催乳素對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊毛囊體外培養(yǎng)影響的研究

包躍先,趙飛飛,2，宮文典,2，盧澤宇,2，穆 卿,2，劉俊陽(yáng),2，特日格樂(lè),2，趙艷紅,2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

內(nèi)蒙古絨山羊是歷經(jīng)長(zhǎng)期的自然選擇和人工選育而形成的地方良種，由于其絨毛細(xì)度好、產(chǎn)絨量高、紡織性能好等優(yōu)良特性而享有“軟黃金”的美稱(chēng)。如何提高羊絨的產(chǎn)量和質(zhì)量一直是絨山羊育種工作的重點(diǎn)。貼著表皮生長(zhǎng)的絨毛平均直徑約15 μm，由次級(jí)毛囊生成[1]，是優(yōu)質(zhì)的紡織原料，價(jià)值較高。絨山羊具有異質(zhì)的雙重毛被，其毛被由有髓質(zhì)的粗毛和無(wú)髓質(zhì)的絨毛兩類(lèi)纖維組成。絨毛的品質(zhì)很大程度上決定于絨山羊的皮膚及毛囊，毛囊位于真皮和皮下組織中，是毛發(fā)獲取養(yǎng)分的通道，且具有自我更新能力。因此，研究絨山羊毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)羊絨的生產(chǎn)具有重要意義。

近年來(lái)，關(guān)于催乳素(PRL)的研究越來(lái)越多，作為一種具有調(diào)控作用的激素，催乳素不僅在機(jī)體某些器官的生長(zhǎng)發(fā)育和泌乳等方面起作用，還調(diào)控著哺乳動(dòng)物毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育，催乳素的分泌受到光照的影響，長(zhǎng)光照會(huì)使催乳素的分泌增加，且褪黑激素的分泌也會(huì)影響到催乳素的分泌[2]。謝景艷[3]通過(guò)檢測(cè)絨山羊皮膚毛囊中催乳素受體的表達(dá)情況來(lái)探索絨毛生長(zhǎng)與催乳素之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)催乳素對(duì)體外培養(yǎng)的毛囊生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。Ibraheem等[4]研究表明，催乳素對(duì)體外培養(yǎng)的次級(jí)毛囊的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。因此，本研究以內(nèi)蒙古白絨山羊毛囊為研究對(duì)象，在體外培養(yǎng)時(shí)添加催乳素，觀察毛囊生長(zhǎng)狀況，分析催乳素對(duì)絨山羊毛囊生長(zhǎng)和形態(tài)的影響,旨在為研究催乳素調(diào)控絨山羊毛囊生長(zhǎng)的機(jī)理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 本試驗(yàn)所采樣品來(lái)源于內(nèi)蒙古呼和浩特市土左旗善岱鎮(zhèn)召上村金萊牧業(yè)有限公司。隨機(jī)選取10只健康的2周歲成年阿爾巴斯絨山羊母羊，將其綁定，把靠近肩胛部附近的羊毛剪去，用碘酒和酒精棉球消毒，快速切取1 cm2大小的皮膚放入含雙抗的Hanks液的采樣管中，于2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑及儀器 Hanks液、PBS均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；William’E培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司；催乳素購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉混合液(100×ITS)、L-谷氨酰胺、氫化可的松和青-鏈霉素混合液均購(gòu)自Sigma公司。解剖顯微鏡(SMZ800)和倒置顯微鏡(TE2000-S)均購(gòu)自Nikon公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱(TH3111)購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制：在50 mL離心管中加入0.5 mL青-鏈霉素混合液，0.4 μg/mL氫化可的松，0.5 mL胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉混合液(100×ITS)，0.5 mLL-谷氨酰胺，用William’E培養(yǎng)基定容至50 mL。

1.2 方法

1.2.1 毛囊的分離 將樣本裸露的毛干剪掉，用生理鹽水沖洗表面污物后再用含有青-鏈霉素混合液的Hanks液沖洗。充分清理皮膚表面的雜物后，用酒精棉球包裹揉搓2次，再用含有青-鏈霉素混合液的Hanks液沖洗。使用眼科剪剪成約1 mm3左右的組織塊，分別挑出無(wú)損傷、毛乳頭明顯的單個(gè)初級(jí)和次級(jí)毛囊。用注射器針頭將毛囊周?chē)M織去除后，置于培養(yǎng)液中。

1.2.2 最佳催乳素濃度篩選 用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將催乳素稀釋為5、10、50、100 ng/mL 4個(gè)濃度，對(duì)照組(0 ng/mL)不添加催乳素，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)初級(jí)毛囊。培養(yǎng)5 d，每天觀察形態(tài)并拍照、測(cè)量其長(zhǎng)度，計(jì)算毛囊的平均日生長(zhǎng)長(zhǎng)度、最終生長(zhǎng)長(zhǎng)度及存活率，篩選最佳催乳素處理濃度。

1.2.3 催乳素對(duì)體外培養(yǎng)毛囊的影響 將初級(jí)毛囊與次級(jí)毛囊分別分為對(duì)照組(K)和最適濃度催乳素組(PRL)，即初級(jí)毛囊對(duì)照組(PF-K)、初級(jí)毛囊試驗(yàn)組(PF-PRL)、次級(jí)毛囊對(duì)照組(SF-K)、次級(jí)毛囊試驗(yàn)組(SF-PRL)。在24孔培養(yǎng)板中，試驗(yàn)組每孔加入0.6 mL最佳濃度催乳素的培養(yǎng)液，對(duì)照組用基礎(chǔ)培養(yǎng)液。在顯微鏡下選取形態(tài)良好的初級(jí)毛囊與次級(jí)毛囊置于培養(yǎng)板中，每孔1根，每組24根。37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，每天在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)并拍照。培養(yǎng)前記錄毛囊長(zhǎng)度(即第0天的毛囊長(zhǎng)度)，之后每天測(cè)量并記錄毛囊總長(zhǎng)度。各組試驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用RStudio R4.1.1軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用LSD法進(jìn)行多重比較。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 催乳素對(duì)毛囊體外培養(yǎng)的最適濃度

由表1可知，10 ng/mL催乳素組毛囊在1～5 d的平均生長(zhǎng)長(zhǎng)度均極顯著高于其他組(P<0.01)，且10 ng/mL催乳素組5 d的累計(jì)生長(zhǎng)長(zhǎng)度最大、存活率最高。因此，選擇10 ng/mL催乳素用于后續(xù)試驗(yàn)毛囊的體外培養(yǎng)。

2.2 毛囊體外培養(yǎng)的形態(tài)觀察

由圖1可知，初級(jí)毛囊與次級(jí)毛囊5 d的平均日生長(zhǎng)長(zhǎng)度和生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致。PF-K組毛囊在生長(zhǎng)過(guò)程中內(nèi)外根鞘與毛干同時(shí)伸長(zhǎng)，且根鞘的直徑微微變細(xì)，整體形態(tài)未發(fā)生太大變化，彎曲程度較小。內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰且毛乳頭部位逐漸萎縮同時(shí)顏色變淺。PF-PRL組毛囊在伸長(zhǎng)的同時(shí)根鞘直徑無(wú)明顯變化，各部位的結(jié)構(gòu)清晰可辨，隨著長(zhǎng)度的增加毛囊的兩端變的彎曲。PF-PRL組生長(zhǎng)長(zhǎng)度明顯高于PF-K組，彎曲更嚴(yán)重。SF-K和SF-PRL組的毛囊隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸伸長(zhǎng)，新生長(zhǎng)的毛干變細(xì)，毛囊的整個(gè)部位發(fā)生彎曲，內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰且毛球部位逐漸萎縮，SF-PRL組毛囊的毛球上部彎曲異常。因此，培養(yǎng)基中添加10 ng/mL催乳素可以促進(jìn)初級(jí)毛囊與次級(jí)毛囊生長(zhǎng)。

2.3 催乳素對(duì)體外培養(yǎng)初/次級(jí)毛囊生長(zhǎng)長(zhǎng)度的影響

由表2可知，PF-PRL、SF-PRL組毛囊在2～5 d的總長(zhǎng)度分別極顯著高于PF-K、SF-K組(P<0.01)。PF-K組除第1天與第0天差異不顯著外，1～5 d毛囊的總長(zhǎng)度依次顯著增加(P<0.05)；PF-PRL組0～5 d毛囊的總長(zhǎng)度依次顯著增加(P<0.05)。SF-K組毛囊第5天的總長(zhǎng)度顯著高于0～4 d(P<0.05)，其余相鄰2 d間差異不顯著(P>0.05)；SF-PRL組第4、5天毛囊的總長(zhǎng)度顯著高于0～3 d(P<0.05)，第3天毛囊的總長(zhǎng)度顯著高于0～2 d(P<0.05)。由圖2可知，PF-PRL、SF-PRL組毛囊在2～5 d的平均日生長(zhǎng)長(zhǎng)度分別極顯著高于PF-K、SF-K組(P<0.01)。

表1 不同濃度催乳素對(duì)毛囊體外生長(zhǎng)的影響

圖1 各組毛囊的形態(tài)觀察(40×)Fig.1 Morphological observation of hair follicles in each group (40×)

表2 各組毛囊總長(zhǎng)度

①A，初級(jí)毛囊；B，次級(jí)毛囊。②**，差異極顯著(P<0.01)；無(wú)*，差異不顯著(P>0.05)①A,Primary hair follicles;B,Secondary hair follicles.②**，Extremely significant difference(P<0.01)；No *,No significant difference(P>0.05)圖2 各組毛囊平均日生長(zhǎng)長(zhǎng)度Fig.2 Average daily growth length of hair follicles in each group

3 討 論

想要獲得形態(tài)結(jié)構(gòu)完好的毛囊首先要了解毛囊的生理與生長(zhǎng)特性[5-6]，如在毛囊的生長(zhǎng)期就比較容易獲得形態(tài)結(jié)構(gòu)完整和活性較強(qiáng)的毛囊，有利于后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。采集樣品時(shí)要做好充分的準(zhǔn)備，在剪毛后對(duì)皮膚進(jìn)行多次清潔，避免樣品污染。本試驗(yàn)在采樣管中保存樣品時(shí)添加適量的青-鏈霉素可以降低污染，同時(shí)提高后期毛囊體外培養(yǎng)的成活率。一般采用機(jī)械法與切割法結(jié)合分離初級(jí)毛囊[7]，分離毛囊的效率會(huì)隨著分離手法的嫻熟而提高，由于次級(jí)毛囊成簇生長(zhǎng)且形態(tài)比較微小，用分離初級(jí)毛囊的方法分離次級(jí)毛囊極易損傷毛囊結(jié)構(gòu)，所以本試驗(yàn)改進(jìn)了毛囊分離的方式，將皮膚組織剪成薄片后置于體視顯微鏡下，將皮膚的表皮部分切去，在切口處可觀察到次級(jí)毛囊的毛干，將皮膚用鑷子拉伸后皮膚組織會(huì)變得較為疏松，用精細(xì)鑷夾取次級(jí)毛囊毛干部分，這樣就會(huì)很容易抽離出一簇次級(jí)毛囊，接著在顯微鏡下將成簇的次級(jí)毛囊分成獨(dú)立的單個(gè)毛囊。此種方法減少了器械對(duì)毛球部位的損傷，提高了毛囊的存活率。

目前有關(guān)催乳素與絨山羊毛囊生長(zhǎng)[8]的研究有很多，如楊敏等[9]研究發(fā)現(xiàn)，催乳素含量隨次級(jí)毛囊的生長(zhǎng)呈現(xiàn)出顯著的周期變化，說(shuō)明催乳素與毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育有很大關(guān)系。徐文軍[10]通過(guò)檢測(cè)不同季節(jié)絨山羊血清中催乳素的含量發(fā)現(xiàn)，絨山羊血清中的催乳素濃度隨著季節(jié)的變化而變化，8月份達(dá)到最大值，在羊絨生長(zhǎng)期的8～10月份，催乳素濃度與羊絨的生長(zhǎng)速度呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明羊絨的生長(zhǎng)和脫落受催乳素的影響。但關(guān)于培養(yǎng)基中添加催乳素對(duì)其生長(zhǎng)狀況影響的研究很少，催乳素是一種蛋白類(lèi)激素，參與代謝調(diào)節(jié)并且對(duì)毛囊的發(fā)育和生長(zhǎng)有一定調(diào)控作用。劉志遠(yuǎn)[11]研究表明，在2～10 ng/mL催乳素濃度范圍內(nèi)，隨著添加濃度的升高，會(huì)顯著增加毛囊的生長(zhǎng)趨勢(shì)。本試驗(yàn)用催乳素對(duì)絨山羊的初級(jí)毛囊與次級(jí)毛囊分別進(jìn)行體外培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察毛囊的生長(zhǎng)長(zhǎng)度與形態(tài)變化，結(jié)果表明，10 ng/mL是體外培養(yǎng)毛囊的最適催乳素濃度。

Ibraheem等[4]研究表明，培養(yǎng)基中添加催乳素對(duì)次級(jí)毛囊的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，由于次級(jí)毛囊的生長(zhǎng)與初級(jí)毛囊的生長(zhǎng)有很大關(guān)系，所以推測(cè)催乳素對(duì)初級(jí)毛囊也有相同作用。本研究結(jié)果顯示，催乳素對(duì)初級(jí)毛囊和次級(jí)毛囊生長(zhǎng)均有極顯著促進(jìn)作用。徐文軍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，絨毛的生長(zhǎng)受到絨山羊體內(nèi)催乳素濃度的影響，當(dāng)濃度達(dá)到最大時(shí)絨毛開(kāi)始生長(zhǎng)，如果抑制催乳素的分泌可能會(huì)使羊絨的生長(zhǎng)推遲。說(shuō)明催乳素對(duì)絨毛的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，與本研究結(jié)果一致。孫慶林等[13]采用原位雜交法檢測(cè)絨山羊皮膚毛囊中催乳素受體mRNA隨季節(jié)變化的規(guī)律發(fā)現(xiàn)，催乳素受體mRNA分布量與毛囊活性呈負(fù)相關(guān)，即催乳素抑制毛囊生長(zhǎng)，與本研究結(jié)果有差異，說(shuō)明催乳素在體內(nèi)對(duì)毛囊的影響與體外不同，在體內(nèi)可能是與其他激素協(xié)同作用來(lái)調(diào)控絨毛的生長(zhǎng)，具體機(jī)制還有待研究。

絨毛的生長(zhǎng)是多種激素共同作用的結(jié)果，動(dòng)物體內(nèi)催乳素的濃度隨著季節(jié)的變化而變化,且與體內(nèi)褪黑激素的濃度存在一定的頡頏關(guān)系[14]，當(dāng)褪黑激素濃度升高時(shí)催乳素濃度降低，多個(gè)研究證明體內(nèi)褪黑激素濃度升高會(huì)促進(jìn)體外絨毛的生長(zhǎng)[15]，但本研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)其他激素作用條件下的毛囊體外培養(yǎng)試驗(yàn)中，適宜濃度的催乳素直接作用于毛囊也會(huì)促進(jìn)其生長(zhǎng)，但是其在體內(nèi)具體的作用機(jī)制還有待深入研究。

4 結(jié) 論

10 ng/mL催乳素顯著促進(jìn)初級(jí)毛囊的生長(zhǎng)，毛囊存活率最高，其對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊初級(jí)毛囊和次級(jí)毛囊體外培養(yǎng)的作用一致，在培養(yǎng)的1～5 d均有顯著促生長(zhǎng)作用。