1株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化神戶腸桿菌的鑒定及脫氮特性

胡丹 何富強 杜全能 王剛 蘭時樂

摘要 [目的]鑒定1株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化神戶腸桿菌，明確其脫氮特性。[方法]從養(yǎng)殖池塘底泥中篩選到1株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌HD-NAH，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗以及16S rDNA序列分析，鑒定為神戶腸桿菌（Enterobacter kobei）HD-NAH，并研究其脫氮特性。[結(jié)果]該菌在以檸檬酸鈉為碳源，C/N為18，初始pH為7，溫度為27 ℃，轉(zhuǎn)速為190 r/min時，24 h亞硝氮（NO2--N）和總氮（TN）降解率分別為99.98%和89.37%，具有較高的降解效率。菌株在初始pH為7～10，溫度為27～37 ℃，轉(zhuǎn)速為130～210 r/min時，對NO2--N和TN的降解率均較高，表明該菌株的環(huán)境適應(yīng)性較強。在不同氮源條件下，菌株HD-NAH對氮的去除存在差異，其對TN去除率表現(xiàn)為NO2--N>NH4+-N+NO2--N>NH+4-N+NO3--N>NH4+-N>NO3--N，還存在一定短程異養(yǎng)硝化-好氧反硝化過程。[結(jié)論]菌株HD-NAH良好的脫氮特性可為養(yǎng)殖廢水除氮提供可選擇材料。

關(guān)鍵詞 神戶腸桿菌HD-NAH;異養(yǎng)硝化;好氧反硝化;脫氮特性

中圖分類號 X172? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）10-0070-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.018

Identification of a Heterotrophic Nitrification-Aerobic Denitrifying Bacterium and Its Removal Characteristics of Nitrogen

HU Dan1，2，HE Fu-qiang1，DU Quan-neng3 et al （1.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128; 2.Hunan Institute of Microbiology，Changsha，Hunan 410009; 3.Haida Research Institute of Guangdong Haida Group Co.，Ltd，Guangzhou，Guangdong 511400）

Abstract [Objective]To identify a heterotrophic nitrification-aerobic denitrifying bacterium，and clarify its denitrification characteristics.[Method]A heterotrophic nitrification-aerobic denitrifying bacterium was screened from the sludge of aquaculture pond，was named as HD-NAH.The strain was identified as Enterobacter kobei by morphological observation，physiological and biochemical tests，and 16S rDNA sequence analysis.The removal characteristics of nitrite nitrogen and total nitrogen by HD-NAH were studied.[Result]The results showed that degradation rate of nitrite nitrogen and total nitrogen by strain HD-NAH were 99.98% and 89.37% respectively，under the conditions of trisodium citrate as the sole carbon source，C/N 18，pH 7，appropriate culture temperature 27 ℃ and shaking speed 190 r/min.The strain HD-NAH had preferable degradation rate of nitrite nitrogen and total nitrogen under pH 7-10，temperature 27-37 ℃，and shaking speed 130-210 r/min，it means that strain HD-NAH has strong environmental adaptability.The degradation rate of nitrite nitrogen and total nitrogen were measured under different nitrogen source，the rate was arranged as：NO2--N>NH4+-N+NO2--N>NH+4-N+NO3--N>NH4+-N>NO3--N.The strain showed a certain short-range heterotrophic nitrification-aerobic denitrification process.[Conclusion]It provided an alternative material for the denitrification of aquaculture wastewater basing on good denitrification characteristics of the strain HD-NAH.

Key words Enterobacter kobei HD-NAH;Heterotrophic nitrification;Aerobic denitrification;Denitrification characteristics

基金項目 湖南省重點研發(fā)項目（2016NK2103）;湖南創(chuàng)新型省份建設(shè)經(jīng)費資助項目（2020NK2029）。

作者簡介 胡丹（1989—），女，湖南桃江人，助理工程師，碩士，從事環(huán)境重金屬檢測研究。 通信作者，副教授，從事微生物資源利用研究。

收稿日期 2021-07-06

水體氮元素的大量累積會造成水體富營養(yǎng)化和生態(tài)失衡等一系列問題，嚴重威脅水生生物的生存和健康，制約我國養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展。在處理水體氮污染過程中，微生物起著重要作用，可通過氨化、硝化和反硝化等過程減少水體中的氮含量，從而達到脫氮目的[1]。傳統(tǒng)認為微生物的硝化和反硝化是2個獨立的過程，直到1984年，Robertson等[2]發(fā)現(xiàn)一種能進行異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的脫氮副球菌（Paracocci denitrificans），并提出了異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的概念。異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細菌可在有氧條件下利用有機碳源和有機氮源進行生長，在降低有機物含量的同時，利用自發(fā)反應(yīng)去除水體中有毒的氨氮與亞硝酸鹽氮，且除氮率高、除氮速率快，避免了二次污染，受到廣泛關(guān)注[3-5]。

異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細菌的發(fā)現(xiàn)，為生物脫氮提供了新的研究方向。近年來，許多研究者從自然界分離了諸多異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌并對其脫氮進行了研究，包括假單胞菌（Pseudomonas sp.）[6]、無色桿菌（Achromobacter sp.）[7]、芽孢桿菌（Bacillus sp.）[8]、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）[9]和農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium sp.）[10]等細菌及皺褶念珠菌（Diutina rugosa）[11]等真菌。一些細菌在實際水體的應(yīng)用中取得了良好效果，如魔鬼弧菌（Vibrio diabolicus）SF16對含鹽廢水的氨氮和總氮去除率分別達到97.14%和73.92%[12]，Acinetobacter sp.T1能夠明顯提高養(yǎng)豬場廢水中的氮去除率[13]。因此，篩選出更多高效除氮的菌種資源，對于利用微生物進行氮污染環(huán)境修復(fù)有著重要意義。該研究從淡水養(yǎng)殖池塘底泥中分離到1株高效異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株HD-NAH，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗并結(jié)合16S rDNA序列分析，鑒定為神戶腸桿菌，目前有關(guān)該菌用于生物脫氮方面的研究鮮見報道。筆者進一步探討了該菌株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的影響因素，以期為菌株HD-NAH應(yīng)用于淡水養(yǎng)殖廢水的除氮處理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種分離樣品。采集于湖南省長沙市東湖養(yǎng)殖場池塘底泥，裝于無菌玻璃瓶中，迅速帶回實驗室進行富集培養(yǎng)和菌株分離。

1.1.2 培養(yǎng)基。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH自然。加入2%瓊脂，制成斜面培養(yǎng)基。

反硝化培養(yǎng)基：檸檬酸鈉9.0 g/L，NaNO2 0.6 g/L，Na2HPO4 1.0 g/L，NaH2PO4 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl2·2H2O 0.2 g/L，1%溴麝香草酚藍（Bromothymol Blue，BTB）1.0 mL/L，瓊脂2%，pH 7.0?；A(chǔ)脫氮培養(yǎng)基：成分同反硝化培養(yǎng)基，不添加1% BTB和瓊脂。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的富集與初篩。

稱取10 g池塘底泥于100 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，32 ℃ 170 r/min搖床中富集培養(yǎng)72 h后，按10倍稀釋法將富集液稀釋至10-8。分別取最后3個稀釋度的稀釋液0.1 mL涂布于反硝化固體培養(yǎng)基平板上，32 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長出單菌落后，挑取不同形態(tài)的單菌落進行純化并編號。

1.2.2 菌種復(fù)篩。

將分離純化的菌種分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，32 ℃ 170 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h后，離心收集菌體，使用基礎(chǔ)脫氮培養(yǎng)基洗滌菌體2次，等體積基礎(chǔ)脫氮培養(yǎng)基懸浮菌體，按1%（V/V）接種量分別接種于基礎(chǔ)脫氮培養(yǎng)基中，32 ℃ 170 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，測定菌株對亞硝氮（NO2--N）的去除率。

1.2.3 菌種鑒定。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]，對菌株HD-NAH的菌落和菌體形態(tài)進行觀察并分析菌株的常規(guī)生理生化指標。采用DNA提取試劑盒（SK8257，上海生工生物工程股份有限公司）提取菌株的基因組DNA，通過PCR擴增16S rDNA序列。PCR體系（25 μL）：10×Buffer （Mg2+） 2.5 μL、dNTP 1 μL、Taq酶 0.2 μL、引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′）各0.5 μL、模板0.5 μL，用無菌ddH2O定容至25 μL。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min。測序后將16S rDNA序列提交至NCBI，使用Blastn檢索比對，用MEGA 7.0.26軟件的鄰位連接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap自展1 000次檢驗。

1.2.4 菌株HD-NAH脫氮特性研究。采用單因素試驗法，分別改變基礎(chǔ)脫氮培養(yǎng)基的碳源種類（檸檬酸鈉、碳酸鈉、丁二酸鈉、酒石酸鈉和蔗糖）、C/N（2、6、10、14、18、22）、初始pH（6、7、8、9、10）、溫度（22、27、32、37、42 ℃）、搖床轉(zhuǎn)速（130、150、170、190、210 r/min）和氮源種類（121.74 mg/L NH4Cl、121.74 mg/L NaNO3、121.74 mg/L NaNO2、60.87 mg/L NH4Cl+60.87 mg/L NaNO3、60.87 mg/L NH4Cl+60.87 mg/L NaNO2），探討不同條件下菌株HD-NAH的脫氮性能。

1.2.5 測定方法。

參照文獻[15]中的方法測定發(fā)酵液上清液中氨氮（NH4+-N）、亞硝氮（NO2--N）、硝態(tài)氮（NO3--N）和總氮（TN）含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理。

使用GraphPad Prism 8.0.1對數(shù)據(jù)進行處理。采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行one-way ANOVA分析和Tukey’s HSD 檢驗（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選

從養(yǎng)殖水體底泥中篩選菌種，通過富集和平板分離，共獲得11株具有反硝化能力的菌株，分別命名為HD-NAH、HD-NBH、HD-NCH、HD-NDH、HD-NEH、HD-NFH、HD-NGH、HD-NHH、HD-NJH、HD-NMH、HD-NNH。將分離的11株菌株分別接種至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，32 ℃ 170 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，按1%（V/V）的接種量接入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，同樣條件下發(fā)酵48 h，測定發(fā)酵液中NO2--N含量。從圖1可見，分離篩選的11株細菌均具有NO2--N的降解能力，菌株HD-NAH對NO2--N的去除率最大，達到94.36%。因此，選擇該菌株進行后續(xù)研究。

2.2 菌株HD-NAH鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)觀察。

菌株HD-NAH在反硝化培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后的菌落形態(tài)為圓形，較小，白色，表面濕潤光滑，邊緣整齊，半透明;顯微鏡下細菌形態(tài)特征呈短桿狀、無芽孢，周生鞭毛。

2.2.2 生理生化指標。

菌株HD-NAH的半乳糖、V-P反應(yīng)、硝酸鹽還原、亞硝酸鹽還原發(fā)酵為陽性;麥芽糖、MR反應(yīng)、水解淀粉、吲哚和纖維素水解發(fā)酵為陰性（表1）。該菌株的生理生化特征與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]中的腸桿菌屬基本一致。

2.2.3 16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

使用通用引物27F/1492R對菌株HD-NAH的16S rDNA進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，在1 500 bp處有明顯條帶（圖2A），長度為1 475 bp。Blast比對分析后采用MEGA 7.0.26軟件對選取的序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果見圖2B。菌株HD-NAH與神戶腸桿菌STW0522-51及Enterobacter kobei strain WCHEK045523的親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化試驗結(jié)果，將菌株HD-NAH鑒定為神戶腸桿菌。

2.3 菌株HD-NAH脫氮特性

2.3.1 碳源對菌株HD-NAH脫氮特性的影響。

從圖3可見，不同碳源對菌株HD-NAH的NO2--N、TN降解率存在顯著影響（P<0.05）。以檸檬酸鈉為碳源時，NO2--N、TN的降解率最高，分別為75.21%和57.23%。因此，選擇檸檬酸鈉為碳源進行后續(xù)脫氮特性研究。

2.3.2 C/N對菌株HD-NAH脫氮特性的影響。

通過改變培養(yǎng)基中碳源的含量，測定了菌株在6種不同C/N條件下的脫氮情況。結(jié)果表明（圖4），C/N對菌株脫氮具有顯著影響（P<0.05）。C/N在6～18時，NO2--N、TN的降解率隨著C/N的升高而增加;在C/N為18時，NO2--N、TN的降解率均達到最高，分別為91.56%和66.95%;C/N大于18時，NO2--N、TN的降解率均下降。因此，選擇C/N為18進行后續(xù)試驗。

2.3.3 初始pH對菌株HD-NAH脫氮特性的影響。培養(yǎng)基pH主要影響生物的細胞膜電荷量、細胞膜通透性以及對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。從圖5可知，菌株在中性和堿性環(huán)境（pH≥7）對

NO2--N、TN的降解率明顯高于酸性環(huán)境（pH為6）。在pH為7～10時，NO2--N的降解率均超過93.01%。初始pH為7時，NO2--N、TN的降解率最佳，分別為95.66%和79.43%。但當pH高于9時，NO2--N、TN的降解率反而下降。以上結(jié)果說明菌株HD-NAH對中性和堿性環(huán)境具有較廣的適應(yīng)性，在pH 7～10對氮具有較高的去除率，因此后續(xù)選擇pH為7進行試驗。

2.3.4 培養(yǎng)溫度對菌株HD-NAH脫氮特性的影響。

溫度主要影響酶促反應(yīng)速率、細胞膜的流動性和營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響微生物代謝產(chǎn)物的合成。從圖6可見，菌株HD-NAH具有較廣的脫氮溫度適應(yīng)性，在27～37 ℃時，對NO2--N、TN的降解率無顯著差異（P>0.05），27 ℃為最佳氮去除溫度，NO2--N、TN的降解率分別達到99.95%和84.64%。當溫度低于27 ℃或高于37 ℃時，NO2--N、TN的降解率下降。因此，選擇培養(yǎng)溫度為27 ℃進行后續(xù)試驗。

2.3.5 搖床轉(zhuǎn)速對菌株HD-NAH脫氮特性的影響。搖床轉(zhuǎn)速主要影響培養(yǎng)過程的溶氧量。從圖7可見，搖床轉(zhuǎn)速在130～210 r/min時，菌株對TN的降解率無顯著影響（P>0.05），TN的降解率在81.75%～89.37%;轉(zhuǎn)速為150～210 r/min時，菌株對NO2--N的降解率也無顯著影響（P>0.05），NO2--N的降解率均超過99.90%;當搖床轉(zhuǎn)速為190 r/min時，NO2--N、TN的降解率均為最高，分別達99.98%和89.37%。

2.3.6 氮源種類對菌株HD-NAH脫氮特性的影響。

由表2可知，在以NH4+-N為唯一氮源時，NH4+-N的去除率達到87.68%，平均降解速率為4.45 mg/（L·h），TN去除率為70.43%，且NO3--N殘留濃度僅2.90 mg/L。以NO3--N為唯一氮源時，NO3--N的去除率為74.50%，平均除氮速率為3.78 mg/（L·h），TN去除率為69.59%，且NO2--N積累較少，僅5.23 mg/L。以NO2--N為唯一氮源時，NO2--N的去除率為99.84%，平均除氮速率為5.06 mg/（L·h），TN去除率為91.60%，且NO2--N殘留濃度為1.10 mg/L。以NH4+-N+NO3--N為混合氮源，NH4+-N去除率為83.65%，平均除氮速率為2.12 mg/（L·h），NO3--N去除率為96.63%，平均除氮速率為2.45 mg/（L·h），TN去除率為88.45%;以

NH4+-N+NO2--N為混合氮源的條件下，NH4+-N去除率為83.21%，平均除氮速率為2.11 mg/（L·h），NO2--N去除率為96.34%，平均除氮速率為2.44 mg/（L·h），TN去除率為89.29%。以上結(jié)果表明，單一氮源時，菌株對NO2--N的去除速率和去除率最高，對NO3--N的去除速率和去除率最低。對TN的去除速率和去除率表現(xiàn)為NO2--N>NH4+-N+NO2--N>NH4+-N+NO3--N>NH4+-N>NO3--N。

3 討論

菌株HD-NAH以檸檬酸鈉為唯一碳源時具有較好的脫氮性能，而以碳酸鈉、丁二酸鈉、酒石酸鈉和蔗糖為碳源時，NO2--N和TN的降解率均很低，這與P.stutzeri HJ-7結(jié)果一致，該菌以檸檬酸鈉為唯一碳源時，30 h能去除水體中全部氨氮[16]。但與其他研究中的一些菌株有差異，如P.stutzeri YG-24在以蔗糖為唯一碳源進行反硝化過程中對NO2--N的去除效果最好[17]，P.putida HJH1和Klebsiella oxytoca HJH2以甘油作為唯一碳源時，對NO2--N的降解率最高[18]?？梢?，碳源種類對菌株的脫氮性能影響較大。

在C/N低于6時，菌株HD-NAH對NO2--N的降解率均很低，這是由于過低的碳源難以為細菌的生存提供足夠的能源，導(dǎo)致其生長緩慢;當C/N在6～18時，菌株除氮率隨C/N升高而上升，但隨C/N繼續(xù)增大除氮率反而下降，這是由于過高的C/N會抑制細菌的生長和氮的去除[19]，這與P.chengduensis ADM 2-2 C/N為5～11、P.chloritidismutans ADM 8-1 C/N為5～13[20]的除氮趨勢一致?？梢姡珻/N的高低對菌株的除氮性能影響很大。

酸性環(huán)境抑制菌株生長，可能是酸性環(huán)境會抑制該菌株功能酶活性和細菌代謝活性，這與Acinetobacter sp.GNR等菌株一致[21]。但菌株HD-NAH在pH為7～9時對NO2--N、TN的去除率分別超過95.0%和79.0%，說明中性和堿性環(huán)境有利于該菌株的生長和反硝化作用，即使在pH為10的強堿性環(huán)境下，菌株對NO2--N、TN的降解率也能達到93.01%和70.38%，表明該菌株耐堿能力強。

菌株HD-NAH在溫度為27 ℃時的氮降解率最佳，且在27～37 ℃均能高效去除NO2--N、TN，對溫度的適應(yīng)范圍較廣，這與諸多傳統(tǒng)硝化-反硝化微生物的最適溫度在25～37 ℃一致[22]。

轉(zhuǎn)速主要影響發(fā)酵過程中的溶氧量，溶氧量的高低會影響菌株的生長。該研究菌株HD-NAH在5個轉(zhuǎn)速條件下除氮率均較高，說明菌株HD-NAH能在較廣的溶氧量范圍進行脫氮，這比一些除氮微生物只能耐受較低的氧濃度有明顯優(yōu)勢[23]。

氮源種類測試結(jié)果表明，菌株HD-NAH有較好的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力，當環(huán)境中

NH4+-N濃度較高時（以NH4+-N為唯一氮源），存在一定NO2--N積累，但NO3--N積累較少，當環(huán)境中NH4+-N濃度較低時（以NO3--N或NO2--N為唯一氮源），NO3--N具有一定積累，且NO2--N積累較少，這說明該菌在水中NH4+-N濃度較高時，pH偏堿性，易形成亞硝酸型硝化，在相反的條件下，則形成硝酸型硝化的傾向很大，存在一定短程異養(yǎng)硝化-好氧反硝化過程。

4 結(jié)論

從養(yǎng)殖池塘底泥樣品中篩選到1株神戶腸桿菌（Enterobacter kobei）HD-NAH，該菌具有較高NO2--N、TN降解率。菌株HD-NAH去除NO2--N的適宜條件為：碳源為檸檬酸鈉，C/N為18，初始pH為7，溫度為27 ℃，轉(zhuǎn)速為190 r/min，24 h內(nèi)對NO2--N、TN降解率分別為99.98%和89.37%。不同氮源條件下，菌株HD-NAH在低NH4+-N濃度中易形成硝酸型硝化，在高NH4+-N濃度中存在一定短程異養(yǎng)硝化-好氧反硝化過程。該研究將獲得的神戶腸桿菌用于水體生物脫氮，至于其在含氮廢水中的實際應(yīng)用有待進一步研究。

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