四倍體白掌新品種‘綠萌’的選育

周輝明　林輝鋒　莫智龍　陳昌銘　曹奕鴦　熊君

摘??要：白掌又名白鶴芋，原產(chǎn)于美洲和亞洲的熱帶地區(qū)，為天南星科白鶴芋屬多年生草本植物，是重要的觀花觀葉盆栽植物，當前市場主栽品種基本源于國外，多為人工雜交產(chǎn)生的后代。利用人工誘變技術(shù)對植物體細胞染色體組進行加倍的多倍體育種方法已應(yīng)用于觀賞花卉新品種的選育，多倍體植株具有葉片增大、葉色加深、花朵變大、花色艷麗等優(yōu)良性狀，與二倍體比較，目標性狀的觀賞價值更高。利用化學(xué)誘變產(chǎn)生多倍體是目前人工多倍體育種中常用的誘導(dǎo)方法，其具有操作簡易、突變率高、專一性強和適用性廣等特點。秋水仙素是目前主要采用的多倍體化學(xué)誘變劑，其誘導(dǎo)的效果與誘導(dǎo)時間、使用的濃度、處理的植物種類和器官等因素有關(guān)。本研究以白掌‘美酒’的組培苗愈傷組織為材料，優(yōu)化四倍體白掌誘導(dǎo)方法，經(jīng)秋水仙素浸泡處理后，開展試管苗形態(tài)學(xué)初篩、田間種植優(yōu)選及株系比較試驗，同時進行染色體計數(shù)、氣孔大小和基因組大小比較、四倍體白掌新品種選育。結(jié)果表明：最佳誘導(dǎo)四倍體白掌的方式為0.10%秋水仙素浸泡處理7?d，其四倍體誘導(dǎo)率最高;選育出的四倍體白掌新品種‘綠萌’在設(shè)施大棚種植時自然花期為4—6月，與對照‘美酒’相比，葉片長和寬、葉柄長和直徑、葉鞘長、佛焰苞苞片長和寬、花梗長和直徑、肉穗花序長和直徑、氣孔長度和寬度、氣孔密度均差異極顯著，根尖染色體數(shù)為2=4X=60，是對照（2=2X=30）的2倍。流式細胞儀測定DNA顯示，‘綠萌’基因組大小為10.87?Gb，對照‘美酒’基因組大小為5.73?Gb，鑒定為四倍體白掌新品種。本研究利用人工化學(xué)誘變方法選育的四倍體白掌新品種‘綠萌’，具有葉片增厚、葉色加深、莖桿變粗、葉柄變粗、花梗變粗、肉穗花序變粗等特點，大大提高了白掌的觀賞價值。

關(guān)鍵詞：白掌;化學(xué)誘變;選育

中圖分類號：S682??????????文獻標識碼：A

?is an important ornamental foliage and?flower plant and is an perennial herb native to the tropics of America and Asia. At present， most of the main varieties in China are from abroad， and the offspring of artificial hybridization. The polyploid breeding method of doubling the chromosome sets of plant somatic cells by artificial mutation technology is often applied to ornamental flowers. The variety of selected polyploid plants showed excellent traits such as leaf enlargement， leaf color deepening， flower enlargement and gorgeous flower color， which could greatly improve the ornamental value of the target traits. Using chemical mutagens to induce polyploids is a common induction method in artificial mutagenesis technology because of its simple operation， high mutation rate， strong specificity and wide applicability.?Colchicine is a polyploid chemical mutagen mainly used in polyploid induction at present. The effect of colchicine on inducing polyploidy is related to induction time， concentration， plant species and organs. The callus of Meijiu was used as the material. The induction method of tetraploid was optimized. Morphological screening of seedlings ， field selection and comparison of plants regeneratrd were carried out. Furthermore， the number of chromosomes， stomatal size andgenome size identification were used for breeding and identified new varieties of . The results showed that the best way to induce tetraploid ?was soaking with 0.10% colchicine for 7 days. The flowering duration of the newly selected ‘Lvmeng’ was from April to June when it was planted in the greenhouse. Compared with the control ‘Meijiu’， there were significant differences in leaf length， leaf width， petiole length， petiole diameter， leaf sheath length， bracts length， bracts width， bracts stalk length， bracts stalk diameter， spadix length， spadix diameter， stomatal length， stomatal width and stomatal density at the flowering stage. The number of chromosomes was 2=4X=60， which was twice that of the control 2=2X=30. Flow cytometry DNA analysis showed that the genome size of ‘Lvmeng’ was 10.87 Gb， and that of the control ‘Meijiu’ was 5.73 Gb. It was identified as a new tetraploid species of . The new polyploid variety ‘Lvmeng’ was induced by artificial chemistry， with thickened leaves， deepened leaf color， thickened?stem， petiole， bracts stalk and spadix， which greatly improves?the ornamental value of .

; chemical mutagenesis; breeding

： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.011

白鶴芋（）又名白掌，原產(chǎn)于美洲和亞洲的熱帶地區(qū)，為天南星科（Araceae）白鶴芋屬（）多年生草本植物。其植株葉色翠綠，花形似鶴翹首，色澤潔白無暇，被視為“清白之花”，是重要的觀花觀葉盆栽植物，極具觀賞價值和經(jīng)濟價值。當前，國內(nèi)關(guān)于白掌新品種選育的研究報道較少，市場主栽品種基本源于國外，多為人工雜交產(chǎn)生的后代。雜交育種存在育種周期長、效率低等問題。利用人工誘變技術(shù)對植物體細胞染色體組進行加倍的多倍體育種方法已常應(yīng)用于觀賞花卉，選育的植株表現(xiàn)出葉片增大、葉色加深、花朵變大、花色艷麗等優(yōu)良性狀，大大提高了目標性狀的觀賞價值。利用化學(xué)誘變劑誘變產(chǎn)生多倍體是目前人工多倍體育種常用的誘導(dǎo)方法，具有操作簡易、突變率高、專一性強和適用性廣等特點。秋水仙素是目前主要采用的誘變劑，誘導(dǎo)試驗材料通常選取種子、頂芽、側(cè)芽以及組織培養(yǎng)中的愈傷組織、原球莖等分裂旺盛的器官或組織，秋水仙素誘導(dǎo)的效果與誘導(dǎo)時間、使用的濃度、培養(yǎng)的溫度、處理的植物種類和器官等因素有關(guān)。本研究以主栽白掌‘美酒’愈傷組織為材料，通過秋水仙素化學(xué)誘變結(jié)合試管苗形態(tài)學(xué)初篩、田間種植優(yōu)選及株系比較試驗后，進行了染色體計數(shù)、氣孔大小和基因組大小比較，選育出了四倍體白掌新品種，豐富了白掌種質(zhì)資源，滿足市場需求。

??材料與方法

?材料

供試材料為三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院花卉研究所白掌‘美酒’組培苗和成品苗。

??方法

1.2.1 ?多倍體白掌誘導(dǎo)方法優(yōu)化??2012年4月以白掌‘美酒’健壯二代苗的莖尖誘導(dǎo)的愈傷組織為供試材料，設(shè)計不同濃度的秋水仙素（0、0.06%、0.08%、0.1%）、不同處理時間（7、14、21?d）來優(yōu)化四倍體誘導(dǎo)方法。將秋水仙素處理后的愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基中，45?d后統(tǒng)計生長狀況，計算成活率，成活率=成活愈傷組織數(shù)/處理愈傷組織數(shù)×100%。將分化的種苗進行生根培養(yǎng)，待長出根后，采用根尖壓片法進行多倍體鑒定，統(tǒng)計分化植株數(shù)、變異植株數(shù)和四倍體植株數(shù)，計算變異率和四倍體誘導(dǎo)率，變異率=變異植株數(shù)/分化植株數(shù)×100%，四倍體誘導(dǎo)率=四倍體植株數(shù)/變異植株數(shù)×100%。

1.2.2 ?選育白掌四倍體??以白掌‘美酒’健壯二代苗的莖尖誘導(dǎo)愈傷組織為供試材料，經(jīng)添加0.1%化學(xué)誘變劑秋水仙素的液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基7?d搖床振蕩處理，然后將處理的愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基，待愈傷組織分化后，從41株分化苗中發(fā)現(xiàn)葉片寬大肥厚、色澤加深、莖稈粗壯的變異株23株，通過根尖染色體檢測，發(fā)現(xiàn)了其中的12株為四倍體植株，選取一個四倍體單株進行少量組培快繁和栽培。經(jīng)農(nóng)藝性狀觀察發(fā)現(xiàn)，其莖稈粗壯，葉片寬大肥厚、富有質(zhì)感，佛焰苞厚實、白色且富有光澤，花高于葉，花梗直徑較粗，符合多倍體巨大性特征，命名為‘MJ-1’。2018年，將‘MJ-1’和對照‘美酒’的形態(tài)學(xué)特征進行比較、根尖染色體、氣孔大小和分子檢測，綜合評價判定為四倍體白掌新品種，定名為‘綠萌’。

1.2.3??形態(tài)學(xué)特征比較??分別隨機抽取10盆‘綠萌’和‘美酒’，測定植株盛花時的葉片長、葉片寬、葉柄長、葉柄直徑、葉鞘長、葉片數(shù)、佛焰苞苞片長、佛焰苞苞片寬、花梗長、花梗直徑、肉穗花序長、肉穗花序直徑、花色等形態(tài)學(xué)特征，統(tǒng)計重復(fù)3次，用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

1.2.4??葉片氣孔大小測定??早上9：00—11：00，用指甲油（思姿戀環(huán)保護甲亮油）涂抹白掌植株成熟葉片的背部，2?min后，用鑷子輕輕地撕取葉片的下表面組織，置于載玻片上，蓋上蓋玻片（注意保證組織的平整放置），在20×10倍鏡下隨機觀察10個視野，重復(fù)3次，統(tǒng)計各視野的氣孔數(shù)，用標準的顯微鏡測微尺測量氣孔長度。氣孔密度計算為：氣孔密度（個/mm）=各視野中氣孔數(shù)（個）/視野的面積（mm）。

1.2.5??根尖染色體檢測??切取白掌根尖0.4～?0.8?cm，置于2?mL試管中，加入1.5?mL已配制好的0.002?mol/L濃度的8-羥基喹啉，16℃黑暗處理6?h，期間每隔2?h換1次0.002?mol/L的8-羥基喹啉處理液。將預(yù)處理后的根尖用清水洗凈，加入新鮮配制的卡諾固定液（95%乙醇∶冰醋酸=?3∶1），于4℃冰箱放置18～24?h;次日，棄除卡諾固定液，用蒸餾水漂洗根系5～10?min，用刀片切取根尖生長點，浸泡于含2%纖維素酶和1%果膠酶的液體中，37℃溫浴1～2?h后緩慢加入75%乙醇，輕輕吸出液體，緩慢加入醋酸少許，之后將根尖生長點取出并置于載玻片上，用玻棒搗碎根尖使根尖緊壓載玻片，蘸取已過濾的0.025%甲基紫1～2滴于根尖搗碎區(qū)，染色2～3?min，蓋上蓋玻片，用濾紙吸取多余的染色液，用普通光學(xué)顯微鏡進行鏡檢和拍照，每個品種選取3株作根尖取樣，每株觀察清晰可辨的細胞10個及以上，以確定染色體數(shù)目。

1.2.6??流式細胞儀測定基因組大小??取白掌新鮮葉片1?g，置于0.8?mL預(yù)冷的細胞核解離液（45?mmol/L MgCl·6HO，20?mmol/L MOPS，30?mmol/L檸檬酸鈉，1%（/）?PVP40，0.2% （/）Tritonx-100，10?mmol/L NaEDTA，20?μL/mL β-巰基乙醇，pH?7.5）中，用鋒利的刀片將組織迅速切碎，冰上靜置10?min，用400目濾網(wǎng)過濾，濾液為細胞核懸浮液。向細胞核懸液中加入預(yù)冷的含50?μg/mL RNAase的碘化丙啶（propidium iodide，PI）（50?μg/mL）染液100?μL，置于冰上避光染色0.5～1?h。以番茄為內(nèi)參，利用BD FACScalibur流式細胞儀對染色后的細胞核懸浮液樣品上機檢測，采用488?nm藍光激發(fā)，檢測碘化丙啶的發(fā)射光熒光強度，每次檢測收集10?000個顆粒。變異系數(shù)（）控制在5%以內(nèi)。使用Modifit?3.0分析軟件作圖分析，試驗重復(fù)3次。

本試驗所用培養(yǎng)基配方如下：

液體誘導(dǎo)多倍體培養(yǎng)基：MS+6-BA 1.0?mg/L+?NAA 0.1?mg/L+白糖30?;g/L+秋水仙素，pH 5.6。

組培分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 1.0?mg/L+NAA 0.1?mg/L+白糖30?g/L+瓊脂4.5?g/L，pH 5.6。

組培生根培養(yǎng)基：1/2 MS+NAA 0.3?mg/L+?0.5?g/L活性炭+白糖20g/L+瓊脂4.5?g/L，pH 5.6。

??結(jié)果與分析

?不同濃度秋水仙素和不同處理時間對‘美酒’多倍體誘導(dǎo)的影響

從表1可見，相同濃度秋水仙素下，處理時間越長對愈傷組織毒害作用越大，愈傷組織成活率越低;0.06%～0.10%范圍內(nèi)，秋水仙素濃度越高，變異率和四倍體誘導(dǎo)率越高，對愈傷組織毒害作用也越大;0.10%秋水仙素處理7?d，變異率達60%，四倍體誘導(dǎo)率為50%，變異率和四倍體誘導(dǎo)率均比其他濃度和處理時間高。

??形態(tài)學(xué)特征比較

白掌‘綠萌’與對照‘美酒’相比，具多倍體的植株變壯（圖1A～圖1C）、葉片變大（圖1D）、肉穗花序變粗（圖1E）等特征。從表2可見，‘綠萌’葉片長度、葉柄長度、葉鞘長、佛焰苞苞片長度、佛焰苞苞片寬度、花梗長度均小于對照‘美酒’，方差分析顯示差異極顯著;‘綠萌’葉片寬度、葉柄直徑、葉片數(shù)、花梗直徑、肉穗花序長度、肉穗花序直徑均大于對照‘美酒’，方差分析顯示，除葉片數(shù)之外，其他特征差異極顯著?！G萌’在植株形態(tài)學(xué)上具多倍體的葉片增厚、葉色加深、莖桿變粗、葉柄變粗、苞梗變粗、肉穗花序變粗等特征。

?氣孔大小和密度比較

白掌新品種‘綠萌’與對照‘美酒’的氣孔大小和密度比較見表3和圖2，‘綠萌’的氣孔長度為41.72?μm、氣孔寬度為25.93?μm，大于對照‘美酒’的氣孔長度和寬度，方差分析顯示差異極顯著;‘綠萌’的氣孔密度為15.50個/mm，比對照‘美酒’的氣孔密度少，方差分析顯示差異極顯著。

??細胞學(xué)水平比較

本研究觀測了10個清晰視野下的染色體狀態(tài)，重復(fù)3次，結(jié)果顯示對照‘美酒’的二倍體染色體數(shù)為2=2X=30（圖3A），‘綠萌’的染色體數(shù)為2=4X=60（圖3B）?！G萌’的染色體數(shù)為對照‘美酒’的2倍，是‘美酒’的四倍體白掌。

?基因組大小比較

通過流式細胞儀對細胞DNA含量測定和分析（圖4），‘綠萌’的DNA含量為10.87?Gb，‘美酒’的DNA含量為5.73?Gb，‘綠萌’基因組大小約為‘美酒’的2倍，表明白掌‘綠萌’為純四倍體。

??討論

利用人工化學(xué)誘導(dǎo)劑秋水仙素結(jié)合組織培養(yǎng)誘導(dǎo)植物多倍體的應(yīng)用已十分廣泛，在紅掌、大花蕙蘭、非洲菊、萱草、百合、杜鵑等園藝花卉中已有成功報道，誘導(dǎo)材料的類型包括愈傷組織、原球莖、莖尖、芽體、種子等，不同植物種類對誘導(dǎo)材料的類型選擇不同，且處理濃度也存在差異。在白掌的化學(xué)誘變選育上，鄭云飛利用秋水仙素處理多個品種白掌的葉片、愈傷組織、組培苗的莖尖誘導(dǎo)多倍體，并通過流式細胞儀進行多倍體的鑒定，結(jié)果僅有以組培苗的莖尖成功誘導(dǎo)獲得、‘Coddy color’、?‘Bright’、‘Parrish’等4個品種的多倍體植株，這可能與葉片誘導(dǎo)的愈傷組織在分化過程中易褐變和秋水仙素對愈傷組織的毒害作用有關(guān)。本研究優(yōu)化了多倍體白掌誘導(dǎo)的方法，帶芽的愈傷組織（來源于健壯二代試管苗的莖尖誘導(dǎo)），分化能力強，試驗重復(fù)性較高，是誘導(dǎo)四倍體的好材料;高濃度秋水仙素可提高的四倍體誘導(dǎo)率，但隨著處理時間的延長，愈傷組織成活率越低。因此，最佳誘導(dǎo)四倍體白掌處理為0.10%秋水仙素浸泡處理7?d，其四倍體誘導(dǎo)率最高，應(yīng)用于白掌四倍體新品種的選育。

利用染色體計數(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)和細胞學(xué)水平的差異是植物倍性鑒定的可靠方法。形態(tài)學(xué)的差異是最簡單直觀的鑒定方法，可通過莖稈粗度、葉片厚度、植株形態(tài)等特征的初篩提高倍性鑒定的效率。根尖染色壓片的好壞直接影響染色體鑒定的結(jié)果，本研究參考了張志勝等的壓片方法加以改進，通過混合纖維素酶和果膠酶進行細胞壁的溶解和應(yīng)用低毒、低成本的甲基紫進行染色，建立了適合的白掌染色體分析的改良壓片法。應(yīng)用此方法具重復(fù)性好、分辨率高、效率高等優(yōu)點，為白掌的倍性育種提供了可靠的鑒定方法。

流式細胞術(shù)作為一項高效的檢測技術(shù)，廣泛應(yīng)用于檢測植物細胞的核DNA含量及染色體倍性。本研究參考了田新民等方法，采用生長中的白掌新鮮葉片，選取PI染料為檢測細胞核DNA含量的探針，以番茄為內(nèi)參，利用BD FACScalibur流式細胞儀對染色后的細胞核懸浮液樣品上機檢測，采用488?nm藍光激發(fā)，檢測碘化丙啶的發(fā)射光熒光強度，試驗結(jié)果可靠穩(wěn)定。

本研究采用以白掌‘美酒’的組培愈傷組織為材料，用0.10%秋水仙素浸泡處理7?d后，經(jīng)試管苗形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)的初篩，染色體計數(shù)法及基因組大小的比較鑒定，選育出白掌四倍體新品種‘綠萌’，具多倍葉片增厚、葉色加深、莖桿變粗、葉柄變粗、花梗變粗、肉穗花序變粗等形態(tài)特征，大大提高了白掌的觀賞價值，豐富了白掌種質(zhì)資源。

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