調(diào)味香料桂丁中黃酮類化合物的提取、純化及抗氧化活性研究

杜麗霞，姜子濤,2*，肖建軍，白甜甜

(1.天津天獅學(xué)院 食品工程學(xué)院，天津 301700；2.天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

桂丁(Fructuscinnamomi)是一種常被用于辣味火鍋底料及鹵料中的調(diào)味香辛料，往往與其他香辛料配合使用，起到去腥、增香的作用。桂丁，別名桂丁香、肉桂子、桂子，為樟科植物肉桂樹10—11月份采摘未成熟的果實(shí)曬干而成，主要產(chǎn)地為中國(guó)福建、臺(tái)灣、海南、廣東、廣西、云南等地的熱帶及亞熱帶地區(qū)，其中尤以廣西栽培為多，大多為人工純林。桂丁具有溫里散寒、止痛、止呃之功效，常用于治療心胸疼痛、胃腹冷痛、惡心、噯氣、呃逆、嘔吐以及肺寒咳喘。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)桂丁的研究主要集中在揮發(fā)油的分析[1-4]以及醇提物的抗氧化活性[5-6]方面，而對(duì)其他活性成分的研究較少，尤其是提取和純化桂丁黃酮類化合物的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究以桂丁為原料，探究其中黃酮類化合物的提取條件、純化條件以及清除DPPH自由基的能力，為調(diào)味香料桂丁的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桂丁：廣西壯族自治區(qū)玉林市；DPPH：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇：廊坊市拓迪化工有限公司；5種類型大孔樹脂：天津南大樹脂科技有限公司，使用前按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行預(yù)處理；所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水均為去離子水。

CW-2000超聲-微波協(xié)同萃取/反應(yīng)儀 上海新拓分析儀器科技有限公司；N-1100V-WD旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化器械株式會(huì)社；UV1000單光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桂丁黃酮提取工藝條件的優(yōu)化方法

按照參考文獻(xiàn)[8]中的方法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，提取和測(cè)定桂丁中黃酮類物質(zhì)的含量[9]。通過(guò)設(shè)計(jì)四因素五水平的單因素試驗(yàn)，分別探究了提取時(shí)間(20，40，60，80，100 min)、提取溫度(40，50，60，70，80 ℃)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/mL)以及乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)對(duì)桂丁黃酮得率的影響，得到各因素下的優(yōu)水平，然后通過(guò)L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化，得到桂丁黃酮的最佳提取工藝條件。

1.2.2 桂丁黃酮純化工藝條件的優(yōu)化方法

用最佳提取工藝條件得到桂丁黃酮粗提液，經(jīng)冷凍干燥后，用少量乙醇溶解，用水配制成濃度為1 mg/mL的工作液，用于后續(xù)純化條件的優(yōu)化。通過(guò)靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)[10]從5種不同型號(hào)的大孔樹脂(HPD-100、HPD-600、AB-8、DM130、D101)中篩選出適合桂丁黃酮純化的大孔樹脂，采用靜態(tài)法優(yōu)化了上樣液pH(2，4，6，8)及洗脫液乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%)，采用動(dòng)態(tài)法[11]優(yōu)化了上樣流速(1.0，1.5，2.0 BV/h)及洗脫流速(1.0，1.5，2.0 BV/h)，最終得到桂丁黃酮的最佳純化工藝方案。

1.2.3 評(píng)價(jià)桂丁黃酮抗氧化活性的方法

對(duì)參考文獻(xiàn)[12]中的方法略作修改，配制不同濃度梯度經(jīng)最佳條件純化后的桂丁黃酮溶液，各取0.6 mL與6 mL 0.6 mmol/L DPPH溶液混勻后，在避光條件下反應(yīng)30 min，在517 nm下測(cè)定吸光度值，計(jì)算各濃度桂丁黃酮的清除率，得到清除率曲線，最后計(jì)算IC50值，同法測(cè)定天然抗氧化劑維生素C(Vc)的IC50值，通過(guò)比較兩者大小，評(píng)價(jià)桂丁黃酮的抗氧化活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.1中的方法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0.4374x+0.0038，R2=0.9993，桂丁黃酮提取液的濃度均用以上方程進(jìn)行計(jì)算。

2.2 提取桂丁黃酮的單因素試驗(yàn)結(jié)果

桂丁黃酮的單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 單因素對(duì)桂丁黃酮得率的影響Fig.1 Effect of various factors on the extraction rate of Fructus cinnamomi flavonoids

由圖1中a可知，在一定時(shí)間內(nèi)，提取時(shí)間越長(zhǎng)，越有利于黃酮類物質(zhì)的充分溶出，得率隨之提高，但當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)80 min時(shí)，桂丁黃酮得率反而下降，這是因?yàn)槌暡ㄗ饔脮r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致不穩(wěn)定的黃酮類化合物開始快速分解，而使得率下降，因此選擇80 min為最佳提取時(shí)間。由圖1中b可知，當(dāng)提取溫度由40 ℃升高至70 ℃時(shí)，黃酮得率隨之快速提高，這是由于提高提取溫度，能加速分子運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)黃酮物質(zhì)從細(xì)胞中溶出，但當(dāng)提取溫度升至80 ℃時(shí)，過(guò)高的溫度會(huì)加速黃酮物質(zhì)的氧化分解，得率降低，因此選擇70 ℃為最佳提取溫度。由圖1中c可知，料液比為1∶40(g/mL)時(shí)，桂丁黃酮得率達(dá)到最高，當(dāng)料液比過(guò)小時(shí)，提取溶劑量過(guò)少，黃酮物質(zhì)在溶劑中飽和后便不再溶出，而當(dāng)料液比過(guò)高時(shí)，提取溶劑量過(guò)多，反而不利于超聲波的傳導(dǎo)，使黃酮得率降低，因此選擇1∶40(g/mL)為最佳料液比。由圖1中d可知，乙醇濃度為50%時(shí)，桂丁黃酮得率最高，當(dāng)乙醇濃度過(guò)低時(shí)，醇溶性黃酮無(wú)法被充分溶出，而當(dāng)乙醇濃度過(guò)高時(shí)，水溶性黃酮又無(wú)法被充分溶出，因此選擇50%為最佳乙醇濃度。

2.3 提取桂丁黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of orthogonal test

由表1正交試驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)桂丁黃酮得率影響最大的提取因素是提取時(shí)間，然后是乙醇濃度和提取溫度，影響最小的是料液比。桂丁黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度50%、料液比1∶50(g/mL)、提取時(shí)間60 min、提取溫度60 ℃。在此條件下平行提取3次，得到的桂丁黃酮得率分別為10.50%、10.59%、10.56%，平均值為10.55%。

2.4 優(yōu)化桂丁黃酮純化工藝條件的試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 大孔樹脂的篩選結(jié)果

5種大孔樹脂的篩選結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 大孔樹脂的篩選結(jié)果Table 2 The screening results of macroporous resins

由表2可知，型號(hào)為AB-8的大孔樹脂對(duì)桂丁黃酮的吸附和解吸效果均最佳，因此選擇大孔樹脂AB-8來(lái)分離純化桂丁中的黃酮類化合物。大孔樹脂法由于溶劑消耗量小、設(shè)備簡(jiǎn)單、能再生利用、成本低廉而早已被廣泛地應(yīng)用于植物類黃酮的分離純化中，其中AB-8型號(hào)大孔樹脂在許多種植物類黃酮中均表現(xiàn)出較好的純化效果[13-15]。

2.4.2 最佳上樣液pH值的確定

圖2 上樣液pH值對(duì)樹脂吸附桂丁黃酮效果的影響Fig.2 Effect of pH value of loading solution on adsorption of Fructus cinnamomi flavonoids by resins

由圖2可知，上樣液pH為4時(shí)，吸附后上清液中殘留的黃酮吸光度值最低，說(shuō)明大孔樹脂在pH為4時(shí)對(duì)桂丁黃酮的吸附能力最強(qiáng)。當(dāng)pH低于4時(shí)，桂丁黃酮以分子狀態(tài)存在，極性大大降低，而AB-8大孔樹脂為弱極性，具有一定親水性，因此吸附效果降低；而當(dāng)pH高于4時(shí)，隨著pH的升高，桂丁黃酮的存在形式逐漸向鹽轉(zhuǎn)變，極性過(guò)大，樹脂的吸附效果逐漸降低。

2.4.3 最佳洗脫液乙醇濃度的確定

圖3 洗脫液乙醇濃度對(duì)桂丁黃酮洗脫效果的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration of eluent on the elution effect of Fructus cinnamomi flavonoids

洗脫液的乙醇濃度是影響洗脫效果的主要因素。由圖3可知，隨著洗脫液乙醇濃度的增大，從大孔樹脂解吸下來(lái)的桂丁黃酮吸光度值先增大后減小，當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)吸光度值最高，說(shuō)明此條件下解吸效果最好。洗脫液乙醇濃度過(guò)小時(shí)，極性過(guò)大，乙醇濃度過(guò)大時(shí)，極性又過(guò)小，均不能充分地將桂丁黃酮從大孔樹脂上洗脫下來(lái)。

2.4.4 最佳上樣流速的確定

圖4 上樣流速對(duì)桂丁黃酮吸附效果的影響Fig.4 Effect of loading flow rate on the adsorption effect ofFructus cinnamomi flavonoids

由圖4可知，當(dāng)上樣流速為1.0 BV/h時(shí)，樣液流經(jīng)大孔樹脂內(nèi)部的速度過(guò)慢，接觸面積減小，降低黃酮吸附率，因此最先達(dá)到泄漏點(diǎn)。當(dāng)上樣流速為2.0 BV/h時(shí)，由于流速過(guò)快，導(dǎo)致黃酮與大孔樹脂的作用時(shí)間較短而吸附不完全，泄漏點(diǎn)出現(xiàn)較快。當(dāng)上樣流速為1.5 BV/h時(shí)，泄漏點(diǎn)出現(xiàn)的最晚，說(shuō)明此流速下，黃酮能充分地吸附在樹脂上，上樣效果最佳。

2.4.5 最佳洗脫流速的確定

圖5 洗脫流速對(duì)桂丁黃酮洗脫效果的影響Fig.5 Effect of elution flow rate on the elution effect ofFructus cinnamomi flavonoids

由圖5可知，當(dāng)洗脫流速為1.5 BV/h時(shí)，洗脫下來(lái)的桂丁黃酮所呈現(xiàn)的峰形較窄，峰值較高，洗脫效果最佳。當(dāng)洗脫流速過(guò)快時(shí)，洗脫液與樹脂作用不充分，洗脫效果不佳。當(dāng)洗脫流速過(guò)慢時(shí)，雖洗脫充分，但黃酮容易擴(kuò)散，導(dǎo)致峰形較寬，峰高降低，純化效果不佳。

2.5 桂丁黃酮抗氧化活性的評(píng)價(jià)

圖6 桂丁黃酮及Vc的清除率曲線Fig.6 The curves of scavenging rates of Fructus cinnamomi flavonoids and Vc

由圖6可知不同濃度下桂丁黃酮及Vc對(duì)DPPH自由基的清除率結(jié)果。分別對(duì)其進(jìn)行多變量擬合，得到桂丁黃酮及Vc的清除率曲線，并據(jù)此計(jì)算出桂丁黃酮和Vc的IC50值分別為82.11 μg/mL和45.55 μg/mL。可見(jiàn)桂丁黃酮在一定濃度具有較強(qiáng)的抗氧化作用，但其抗氧化活性比Vc差；與文獻(xiàn)[5]比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其抗氧化活性高于生姜、中藥茴香籽、陳皮、砂仁和山奈等調(diào)味香料。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助提取法提取調(diào)味香料桂丁中的黃酮類化合物，得到的最佳提取條件是：乙醇濃度50%、料液比1∶50(g/mL)、提取時(shí)間60 min、提取溫度60 ℃，桂丁黃酮的得率為10.55%。用大孔樹脂法分離純化桂丁中的黃酮類化合物，得到的最佳純化條件是：上樣流速1.5 BV/h、洗脫流速1.5 BV/h、上樣液pH值4、洗脫液乙醇濃度50%，在此條件下，其純度由30.1%提高至62.6%。同時(shí)，通過(guò)清除DPPH自由基試驗(yàn)，以天然抗氧化劑Vc作參比，評(píng)價(jià)桂丁黃酮的抗氧化活性，結(jié)果顯示：桂丁黃酮的抗氧化活性雖然比Vc弱，但仍表現(xiàn)出一定的抗氧化作用，且活性比部分天然香辛料強(qiáng)。