Aβ抗真菌活性與聚集形態(tài)和細(xì)胞壁多糖的關(guān)系探究

文 榕，周君琳，王 倬，張 琛，王一丁

（1.四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，成都 610101；2.中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190）

阿爾茨海默癥（alzheimer’s disease,AD）是發(fā)生于老年或老年前期，以記憶認(rèn)知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)，目前全世界AD 的發(fā)病人數(shù)高達(dá)2500萬，平均每7s就會(huì)增加1個(gè)AD患者。我國(guó)有AD患者600多萬，絕對(duì)數(shù)量居世界首位。迄今為止AD的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，當(dāng)前的主流學(xué)說認(rèn)為，β 淀粉樣蛋白（β?amyloid,Aβ）的錯(cuò)誤折疊和聚集是AD 主要的致病機(jī)制。Aβ 是通過β?分泌酶（β?secretase）和γ?分泌酶（γ?secretase）連續(xù)裂解淀粉樣前體蛋白（APP）產(chǎn)生的含有39～43 個(gè)氨基酸殘基的多肽，其在腦內(nèi)的聚集沉積可作用于神經(jīng)元產(chǎn)生毒性，并進(jìn)一步激活腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞等產(chǎn)生慢性炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能紊亂。γ?分泌酶裂解位點(diǎn)不同會(huì)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的Aβ肽鏈，其中兩個(gè)最常見的殘基亞型是擁有40個(gè)氨基酸的Aβ40和擁有42個(gè)氨基酸的Aβ42，雖然Aβ40占神經(jīng)元分泌Aβ的90%～95%，但Aβ42更容易發(fā)生淀粉樣變性。

Aβ曾被認(rèn)為是APP分解代謝產(chǎn)生的無任何正常生理功能的“代謝垃圾”，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，Aβ與先天免疫系統(tǒng)中的抗感染關(guān)鍵因子“抗菌肽”（antimicrobial peptides,AMPs）十分相似。前期研究發(fā)現(xiàn)，Aβ可以抑制8種臨床常見病原菌的生長(zhǎng)，AD 患者腦組織樣品較正常組織樣品的抗菌活性顯著升高，而在該組織樣品中加入Aβ 抗體后，其抗菌活性被顯著抑制。其他研究也發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)Aβ 水平的降低則會(huì)增加人們受感染的風(fēng)險(xiǎn)。前期動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，病原真菌白色念珠菌可以穿過血腦屏障并引發(fā)炎癥反應(yīng)，形成與阿爾茨海默病近似斑塊并造成輕度記憶障礙。病原細(xì)菌牙齦卟啉單胞菌也可以進(jìn)入腦內(nèi)，并促進(jìn)Aβ的產(chǎn)生。這些研究結(jié)果表明，微生物的感染與AD的發(fā)生發(fā)展可能存在密切關(guān)系，相關(guān)研究者也基于此提出了AD發(fā)病機(jī)制的微生物感染假說。

近年研究發(fā)現(xiàn)，AD 患者的血清中存在較多真菌源生物大分子(多糖、蛋白質(zhì)和DNA)，在患者腦組織切片中也發(fā)現(xiàn)了真菌細(xì)胞和真菌源物質(zhì)，而正常人腦組織切片中并沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)物質(zhì)的存在。流行病學(xué)研究顯示，真菌感染和多種精神疾病有密切關(guān)聯(lián)?；趧?dòng)物模型的研究表明，白色念珠菌可以穿過血腦屏障引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并在腦中形成與阿爾茨海默病中Aβ 斑塊類似的肉芽腫型結(jié)構(gòu)，造成小鼠輕度記憶障礙。體外研究也發(fā)現(xiàn)，Aβ可以快速纏繞在真菌菌體上發(fā)揮抗菌活性。真菌感染可能與AD存在密切關(guān)系，但真菌與AD發(fā)生發(fā)展的具體關(guān)系仍有待發(fā)現(xiàn)證明，其作用機(jī)制及AD病理相關(guān)的關(guān)鍵因子等仍有待明確。

研究發(fā)現(xiàn)，Aβ 可以快速識(shí)別并結(jié)合于真菌細(xì)胞壁中的多糖結(jié)構(gòu)。針對(duì)AD 診斷標(biāo)志物的研究也提供了AD 與真菌細(xì)胞壁間關(guān)系的更多線索。臨床研究表明，AD 患者的腦脊液幾丁質(zhì)酶樣蛋白YKL?40 和幾丁質(zhì)酶Chitinase1 的濃度明顯高于正常人群，YKL?40 和Chitinase1 可能是AD 診斷和預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。幾丁質(zhì)是常見于真菌細(xì)胞壁、甲殼類動(dòng)物及昆蟲外殼的一種多糖，在人體內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)。幾丁質(zhì)酶及相關(guān)蛋白可能通過結(jié)合、降解真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)參與宿主抵抗真菌感染的過程。盡管AD 患者幾丁質(zhì)酶表達(dá)水平的升高在AD發(fā)病機(jī)制中的所扮演的角色尚不清楚，但這些研究進(jìn)一步預(yù)示著真菌尤其是幾丁質(zhì)等真菌細(xì)胞壁多糖組分在AD發(fā)生中可能扮演重要角色。

白色念珠菌是一種寄生于人體皮膚、黏膜、腸道中的條件致病真菌，當(dāng)人體免疫功能下降或者體內(nèi)菌群失調(diào)，可能引起表皮、黏膜或全身性念珠菌病。白色念珠菌還會(huì)導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和阿爾茨海默癥等多種疾病。由于植入性醫(yī)學(xué)材料增多以及抗生素濫用等因素，導(dǎo)致白色念珠菌的耐藥菌大量增加以及白色念珠菌病的發(fā)病率不斷上升，每年約造成2400 萬感染病癥。本研究主要以白色念珠菌為研究對(duì)象，研究了Aβ 的抗真菌活性，比較了不同聚集形態(tài)對(duì)Aβ 抗真菌活性的影響，并初步探索了其作用位點(diǎn)及抗菌機(jī)制，這將為Aβ生理活性探究提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

白色念珠菌（

Candida albicans

,SC5314）由中國(guó)科學(xué)院微生物所菌種保藏中心提供。Aβ42 由吉爾生化上海有限公司合成（純度>95%）。葡萄糖、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、酵母膏和瓊脂均購(gòu)買自O(shè)XOID 公司。DMSO 購(gòu)買自西隴科學(xué)股份有限公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、3?(4,5?二甲基噻唑?2)?2,5?二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、三氮嗎啡啉丙磺酸（MOPS）、鋨酸均購(gòu)買自北京索萊寶科技公司。RPMI?1640 培養(yǎng)基粉末購(gòu)買自Thermofisher 公司。六氟異丙醇、細(xì)胞壁鈣熒光白（Calcofluor White,CFW）、硫黃素T（ThT）、氟康唑、來源于釀酒酵母的葡聚糖和甘露聚糖以及來源于蝦蟹殼的幾丁質(zhì)、殼聚糖和殼寡糖均從Sigma 公司購(gòu)買?？ú捶覂糍?gòu)買自APExBIO 公司。其他未提及的試劑均為國(guó)產(chǎn)最高純度試劑。

1.2 方法

1.2.1 白色念珠菌培養(yǎng) 使用YPD 固體培養(yǎng)基（2%葡萄糖，2%細(xì)菌學(xué)蛋白胨，1%酵母膏，2%瓊脂）活化白色念珠菌凍存菌株并置于30℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48h。挑取白色念珠菌單菌落至YPD 液體培養(yǎng)基，30℃恒溫?fù)u床200r·min過夜培養(yǎng)。如需培養(yǎng)生物被膜，則使用RPMI 1640 培養(yǎng)基（34.53g·L三氮嗎啡啉丙磺酸，10.4g·LRPMI?1640 粉）調(diào)整過夜培養(yǎng)的菌液濃度至1×10cells·mL。按照每孔100μL 菌液加入96 孔板，96孔板最外側(cè)兩排和兩列加入200μL無菌水以保持濕度，將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24h，在孔板底部即可形成成熟生物膜。

1.2.2 Aβ42單體化處理 1mg Aβ42溶于1mL六氟異丙醇，冰浴超聲20min，4℃靜置2h。待Aβ42完全溶解后，冰浴超聲20min 打散Aβ42聚集體，然后4℃、14000r·min離心20min，收集上清至1.5mL EP 管中并凍干。向凍干Aβ42 中加入400μL NaOH（20mM）吹打混勻，冰浴10min 使其完全溶解。再次4℃、14000r·min離心10min，取上清并通過BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定Aβ42濃度，?80℃保存。

1.2.3 Aβ42濃度測(cè)定 將BCA試劑與Cu試劑按照50∶1的比例配制BCA工作液。取90μL PBS加入10μL BSA標(biāo)準(zhǔn)品（5mg·mL），將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0.5mg·mL，96孔板中分別加入0，2，4，6，8，12，16，20μL稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品，加PBS 補(bǔ)足至20μL。將Aβ42 分別按照5 倍和10 倍稀釋，取20μL 稀釋后的Aβ42 加到96 孔板。各孔加入200μL BCA 工作液，充分混勻，96孔板邊緣孔加無菌水防止邊緣效應(yīng)影響檢測(cè)結(jié)果，37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置孵育30min。孵育結(jié)束后通過酶標(biāo)儀測(cè)定562nm 處吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Aβ42濃度，保證樣品點(diǎn)落在標(biāo)準(zhǔn)線1/2后。

1.2.4 MTT法測(cè)定Aβ42對(duì)白色念珠菌細(xì)胞活力的影響 如上述培養(yǎng)白色念珠菌浮游菌及生物被膜，在浮游菌試驗(yàn)中，用含有特定濃度Aβ42的YPD 液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為1×10cells·mL，37℃作用24h，將96孔板以1000r·min離心10min，棄上清，每孔加入100μL MTT 溶液（0.2mg·mL），37℃避光孵育3h。棄上清，每孔加入50μL DMSO 溶液，置于水平搖床100r·min混勻10min，待甲臜完全溶解后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm 處吸光值。在生物被膜試驗(yàn)中，待形成成熟生物被膜后加入用RPMI?1640 培養(yǎng)基配制的不同濃度的Aβ42，37℃靜置培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后棄上清并用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去浮游的白色念珠菌，加入MTT 溶液進(jìn)行生物膜細(xì)胞的活力測(cè)定。

1.2.5 熒光顯微鏡觀察Aβ42對(duì)白色念珠菌的作用 分別用含有0，3.33，16.67μg·mLAβ42 的YPD 液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為1×10cells·mL，并按照每孔600μL 菌液加入24 孔板，37℃靜置培養(yǎng)24h。Aβ42 處理結(jié)束后，用PBS 洗去浮游白色念珠菌，每孔再加入終濃度為10μg·mL的細(xì)胞壁鈣熒光白（calcofluor white,CFW）進(jìn)行熒光染色，37℃恒溫培養(yǎng)箱避光孵育1h，PBS洗凈多余染料并置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 不同聚集狀態(tài)Aβ42對(duì)白色念珠菌的抑制作用 使用Tris?HCl（pH值7.4,10mM）將Aβ42分別稀釋為10，50，100μg·mL，并將其置于37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置孵育4h形成寡聚態(tài)Aβ42，或96h形成纖維態(tài)Aβ42。將不同形態(tài)Aβ42分別作用于白色念珠菌生物被膜和浮游菌24h，處理結(jié)束后通過MTT試驗(yàn)檢測(cè)各組白色念珠菌細(xì)胞活力。

1.2.7 透射電子顯微鏡（TEM）觀察Aβ42聚集狀態(tài) 參考文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行透射電子顯微鏡樣品的制備。Tris?HCl 緩沖液（10mM，pH 值7.4）稀釋Aβ42 至10μM，取20μL 稀釋好的Aβ42 溶液于37℃分別靜置孵育0，4，60，96h。將孵育好的Aβ42 超聲10s，在不打散Aβ42 聚集體的前提下將Aβ42 分散均勻。將10μL 樣品垂直滴在300目碳膜銅網(wǎng)上，靜置5min后用吸水濾紙從一側(cè)吸去液體。加入2.5%戊二醛固定5min后，用吸水紙吸去液體。使用乙酸雙氧鈾負(fù)染5min 后，用吸水紙吸去液體，37℃烘箱烘干1h，樣品通過透射電子顯微鏡（Ht?7700）觀察。

1.2.8 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察Aβ42抗白色念珠菌黏附作用 按照文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行掃描電鏡樣品的制備。將酸浸以及高壓滅菌處理的細(xì)胞爬片放入24 孔板中，每孔加入500μL 含有1×10cells·mL白色念珠菌的培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24h。待生物被膜成熟后棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入400μL 濃度為200μg·mL的Aβ42，37℃恒溫箱靜置孵育24h，處理結(jié)束后棄去上清并用PBS洗掉浮游白色念珠菌。加入500μL 2.5%戊二醛?4%多聚甲醛固定液，4℃固定1h。加入預(yù)冷的PBS 緩沖液洗去多余固定液后使用400μL 1%鋨酸繼續(xù)固定45min。吸去鋨酸固定液并用PBS清洗。使用50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇進(jìn)行梯度脫水。處理結(jié)束后將細(xì)胞爬片保存于4℃無水乙醇中，經(jīng)過臨界點(diǎn)干燥和噴金處理后即可通過掃描電子顯微鏡（SU8010）在5kV下進(jìn)行樣品的觀察。

1.2.9 硫黃素T（ThT）熒光測(cè)定 ThT 是一種苯并噻唑鹽，可與Aβ 纖維絲特異性結(jié)合而不與單體或低聚中間體結(jié)合，并且ThT的結(jié)合不會(huì)影響Aβ參與淀粉樣纖維原的組裝。因此，ThT常用于定量分析體系中淀粉樣纖維的含量。在黑色非結(jié)合性聚苯乙烯96 孔板中進(jìn)行ThT 熒光測(cè)定試驗(yàn)，每孔添加200μL 體系。使用Tris?HCl緩沖液（10mM，pH 值7.4）稀釋Aβ42、多糖和ThT 母液至終濃度為50μM、200μg·mL和20μM，37℃孵育1，4，8，12，24，48h。孵育結(jié)束后使用酶標(biāo)儀在445nm 激發(fā)波長(zhǎng)和485nm 發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。每次試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行并且減去不含Aβ42的熒光背景值。

1.2.10 殼寡糖、低聚殼聚糖與Aβ42復(fù)配后對(duì)白色念珠菌的抑制作用 培養(yǎng)成熟的白色念珠菌生物被膜，分別用濃度為50μg·mL的Aβ42、200μg·mL的殼寡糖（COS）、200μg·mL的低聚殼聚糖（LCS）、1mg·mL的氟康唑（FLC）、1μg·mL的卡泊芬凈（CAS）以及與Aβ42復(fù)配的混合物處理生物被膜，37℃培養(yǎng)箱靜置孵育24h。處理結(jié)束后吸走上清并用PBS洗去游離白色念珠菌，并通過MTT 試驗(yàn)檢測(cè)不同處理?xiàng)l件下白色念珠菌的細(xì)胞活力。各處理組設(shè)置6個(gè)平行并重復(fù)試驗(yàn)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 Aβ42對(duì)白色念珠菌代謝活力的抑制

Aβ42 作用于白色念珠菌生物膜后，能顯著抑制白色念珠菌生物膜細(xì)胞活性，且隨Aβ42 濃度升高，抑菌作用增強(qiáng)。Aβ42 在10μg·mL濃度下并不會(huì)對(duì)生物膜態(tài)白色念珠菌產(chǎn)生抑菌活性，當(dāng)濃度分別為50，100，200μg·mL時(shí)，Aβ42 對(duì)生物膜態(tài)白色念珠菌的抑菌率分別達(dá)到35.43%、48.10%、57.42%（圖1A）。Aβ42 也能顯著抑制浮游態(tài)白色念珠菌的活性，低濃度Aβ42 對(duì)浮游菌的抑菌效果比對(duì)生物膜的抑菌效果更顯著，0.1μg·mLAβ42 便能顯著抑制白色念珠菌浮游菌活性，且隨著Aβ42 濃度的增加，其對(duì)浮游態(tài)白色念珠菌的抑菌效果越來越強(qiáng)（圖1B）。CFW染料能夠標(biāo)記白色念珠菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)，在熒光顯微鏡下能夠觀察到白色念珠菌菌絲和孢子發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光。熒光顯微鏡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)過Aβ42 處理的白色念珠菌熒光強(qiáng)度減弱。說明Aβ42能顯著抑制白色念珠菌菌絲的生成，減少白色念珠菌的毒性和耐藥性，并且抑菌效果與Aβ 42濃度呈現(xiàn)正相關(guān)（圖1C）。

圖1 不同濃度Aβ42對(duì)白色念珠菌的抑制作用Figure1 The inhibitory effect of Aβ42 on Candida albicans

2.2 不同聚集狀態(tài)Aβ42對(duì)白色念珠菌的抑制作用

由圖2A 和圖2B 可知，無論白色念珠菌生物膜還是浮游菌，寡聚態(tài)和纖維態(tài)Aβ42 均表現(xiàn)出了明顯的抑菌作用。在低濃度時(shí)，寡聚態(tài)和纖維態(tài)Aβ42在抑菌效果方面沒有明顯差異，但在高濃度時(shí)，寡聚態(tài)Aβ42抗菌活性顯著強(qiáng)于纖維態(tài)（

p

<0.05）。Aβ42 的寡聚態(tài)及纖維態(tài)通過透射電鏡觀察確定。如圖2C 所示，未孵育的Aβ42單體呈現(xiàn)點(diǎn)狀，均勻分布在碳膜銅網(wǎng)上。孵育4h 后Aβ42 發(fā)生聚集，形成團(tuán)塊狀的寡聚態(tài)Aβ42。孵育60h 后，開始形成纖維態(tài)Aβ42。孵育96h 后的Aβ42 基本全部呈現(xiàn)纖維態(tài)。研究結(jié)果表明不同聚集狀態(tài)的Aβ 其抗真菌活性存在差異，當(dāng)Aβ轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維態(tài)時(shí)其抗菌活性降低。

圖2 不同聚集狀態(tài)Aβ42對(duì)白色念珠菌的抑制作用Figure2 Antifungal activity of Aβ42 indifferent oligomerization statuses

2.3 掃描電鏡觀察Aβ42對(duì)白色念珠菌生物被膜的抑制作用

通過掃描電鏡對(duì)Aβ42 處理后的白色念珠菌表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。圖3A、圖3B 和圖3C 分別為正常生長(zhǎng)的白色念珠菌生物膜及菌絲放大1k、10k、30k后的表面結(jié)構(gòu)圖像。由圖3A 可知，白色念珠菌生物被膜是由大量菌絲交連形成的致密三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，再由菌絲細(xì)胞分泌的胞外基質(zhì)包裹形成菌細(xì)胞團(tuán)。圖3B中的絮狀物質(zhì)就是生物膜的胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，在圖3C 的高倍放大條件下可以看到白色念珠菌菌絲飽滿且表面光滑。圖3D、圖3E、圖3F 分別為經(jīng)過200μg?mLAβ42 處理后白色念珠菌生物膜及菌絲放大1k、10k、30k后的表面結(jié)構(gòu)圖像。由圖3D 可知，Aβ42處理后生物膜中的菌絲顯著減少，胞外基質(zhì)丟失（圖3D），且Aβ42 處理使得原本光滑飽滿的菌絲變得干癟粗糙（圖3E）。由于噴金變?yōu)閳A球形的寡聚體Aβ42附著在白色念珠菌菌絲壁上，菌絲壁表面變得疏松多孔（圖3F）。這與抗菌肽破壞菌體的細(xì)胞壁膜，致使壁膜凹凸不平，從而改變通透性的作用效果相似。說明Aβ42 顯著抑制了白色念珠菌生物被膜的形成，其作用機(jī)制可能通過附著于白色念珠菌細(xì)胞壁，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

圖3 Aβ42影響白色念珠菌生物被膜的SEM圖片F(xiàn)igure3 SEM images of Aβ42-treated Candida albicans biofilm

2.4 白色念珠菌細(xì)胞壁多糖對(duì)Aβ42活性的影響

ThT 可以嵌入到Aβ42 的β 片層中并在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，隨著Aβ42 的聚合程度越高熒光值越大。為了探究白色念珠菌細(xì)胞壁多糖對(duì)Aβ42聚集的影響，將白色念珠菌細(xì)胞壁的主要組分葡聚糖、甘露聚糖和幾丁質(zhì)分別與Aβ42 單體一起孵育24h。結(jié)果表明，在孵育48h 后幾丁質(zhì)促Aβ42 的聚集作用最為明顯，葡聚糖也會(huì)顯著促進(jìn)Aβ42的聚集，但甘露聚糖對(duì)Aβ42的聚集沒有影響（圖4a），說明白色念珠菌細(xì)胞壁多糖與Aβ 42 存在相互作用關(guān)系。真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)可以在菌體分泌的水解酶和脫乙酰酶的作用下降解產(chǎn)生殼寡糖和低聚殼聚糖，殼寡糖和低聚殼聚糖對(duì)白色念珠菌生物被膜均有抑菌效果（

p

<0.01），但分別將殼寡糖和低聚殼聚糖與Aβ42 復(fù)配后，對(duì)白色念珠菌生物膜的抑菌作用減弱（圖4b）。分別將氟康唑和卡泊芬凈這兩種藥物與Aβ42復(fù)配均表現(xiàn)出抗菌效果增強(qiáng)趨勢(shì)，說明抗真菌藥物與Aβ42通過不同的作用靶點(diǎn)，協(xié)同發(fā)揮抗真菌活性。Aβ42 與細(xì)胞壁多糖片段的復(fù)配以及與抗真菌藥物的復(fù)配后抗真菌活性趨勢(shì)的差異，說明Aβ42通過與白色念珠菌細(xì)胞壁多糖相互作用從而發(fā)揮抗菌活性。

圖4 Aβ42與白色念珠菌細(xì)胞壁多糖相互作用Figure4 Interaction between Aβ42 and Candida albicans cell wall polysaccharides

3 討論與結(jié)論

隨著AD 致病機(jī)制中“微生物感染假說”的提出和發(fā)展，越來越多的研究證明AD 的發(fā)生與微生物息息相關(guān)。白色念珠菌可以穿過血腦屏障并引發(fā)炎癥反應(yīng)，是AD 患者大腦中發(fā)現(xiàn)較多的一種真菌。目前主流學(xué)說認(rèn)為Aβ 的錯(cuò)誤折疊和聚集沉積是造成AD 的主要原因。近年來研究也發(fā)現(xiàn)Aβ 沉積可能與抗菌有關(guān)。AD 患者較正常腦組織樣品的抗菌活性顯著升高，而在該組織樣品中加入Aβ 抗體后，其抗菌活性被顯著抑制。相關(guān)研究者認(rèn)為，大腦通過產(chǎn)生Aβ 包裹消滅入侵的微生物，并將有害的病原體聚集成斑塊以防止感染，但過量產(chǎn)生的Aβ 因?yàn)樾纬衫w維體而導(dǎo)致抗菌能力減弱并且Aβ 與病原菌形成的斑塊由于遺傳、環(huán)境、機(jī)體機(jī)能衰退等因素未能及時(shí)清除，引起大腦中免疫細(xì)胞持續(xù)的炎癥反應(yīng)，最終誘發(fā)AD。Aβ42 是一條由42 個(gè)氨基酸構(gòu)成的短肽，分子量約為4514.1Da。其結(jié)構(gòu)主要由強(qiáng)疏水性的β 片層構(gòu)成，因而容易沉積。Aβ 單體不會(huì)長(zhǎng)期存在，會(huì)不斷自聚集形成Aβ 寡聚體，包括聚合度為10 以下的低分子量寡聚體以及聚合度為20～40 的高分子量寡聚體。兩種類型寡聚體再進(jìn)一步形成原纖維與纖維。而Aβ 的神經(jīng)毒性主要來源于可溶性的寡聚體，并且AD 患者的認(rèn)知狀態(tài)與大腦內(nèi)Aβ 寡聚體濃度有著密切的關(guān)系。前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Aβ 的抗真菌活性，但不同聚集狀態(tài)的Aβ 和抗菌活性之間的關(guān)系仍不清楚以及Aβ抗菌的機(jī)制依舊不明。

本試驗(yàn)首先驗(yàn)證了Aβ42作用于白色念珠菌后能顯著抑制生物膜和浮游菌活性，并且抑菌活性與Aβ42濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。CFW 染色后發(fā)現(xiàn)Aβ42 能顯著抑制白色念珠菌菌絲的生成。為探究不同聚集狀態(tài)的Aβ 對(duì)抗菌活性有何影響，將孵育不同時(shí)間的Aβ 處理白色念珠菌，結(jié)果顯示，纖維態(tài)Aβ42對(duì)白色念珠菌的抗菌活性沒有寡聚態(tài)強(qiáng)，這與孔繁軍的不同聚集狀態(tài)Aβ 對(duì)神經(jīng)元的損傷結(jié)果一致。為了證明Aβ 是如何發(fā)揮抗菌活性的，通過掃描電子顯微鏡觀察到Aβ42附著在白色念珠菌菌絲上，并使得原本光滑飽滿的正常菌絲變得干癟粗糙、胞外基質(zhì)缺失以及菌絲壁出現(xiàn)多處小孔。說明Aβ42 破壞了白色念珠菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)并且降低了白色念珠菌的黏附作用。其次分別將高純度的葡聚糖、甘露聚糖和幾丁質(zhì)與Aβ42一起孵育，發(fā)現(xiàn)一些多糖能夠與Aβ42結(jié)合促進(jìn)其聚集。已有研究也發(fā)現(xiàn)，Aβ可以快速識(shí)別并結(jié)合于真菌細(xì)胞壁中的多糖結(jié)構(gòu)。將真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)降解產(chǎn)物殼寡糖和低聚殼聚糖分別與Aβ42復(fù)配，發(fā)現(xiàn)Aβ42的抗菌活性被削弱。說明外源加入的細(xì)胞壁多糖片段與Aβ42結(jié)合后，抑制了Aβ42與白色念珠菌細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)或者葡聚糖的結(jié)合，導(dǎo)致Aβ42無法發(fā)揮抗真菌活性?？拐婢幬锓颠虬邢蛴谡婢?xì)胞膜中麥角固醇，卡泊芬凈作為β?1,3 葡聚糖合成酶的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，抑制真菌細(xì)胞壁中β?1,3 葡聚糖的合成，分別將這兩種藥物與Aβ42 復(fù)配均表現(xiàn)出抗菌效果增強(qiáng)趨勢(shì)。Aβ42 與細(xì)胞壁多糖片段的復(fù)配以及與抗真菌藥物的復(fù)配后抗真菌活性趨勢(shì)的差異，進(jìn)一步證明Aβ通過結(jié)合真菌細(xì)胞壁多糖發(fā)揮抗菌活性。

Aβ42 對(duì)浮游態(tài)和生物膜態(tài)白色念珠菌都具有顯著的抗菌活性，并且抗菌活性與Aβ42 濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。不同聚集狀態(tài)的Aβ其抗真菌活性存在差異，當(dāng)Aβ轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維態(tài)時(shí)其抗菌活性降低。Aβ42通過與真菌細(xì)胞壁多糖結(jié)合并破壞細(xì)胞壁完整性從而發(fā)揮抗菌活性。本研究為進(jìn)一步探究Aβ生理活性提供了新的理論依據(jù)。