貝類中甲肝病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展

朱金艷 高彬 孫淼淼 陳思 楊宇 麻麗丹

摘 要：甲型肝炎病毒（Hepatitis A Virus，HAV）是全球食源性傳染病的重要原因之一。因食用感染HAV的貝類而患病的案例日益增加，引起了國內(nèi)外研究者的重視。本文對貝類中HAV的提取與檢驗(yàn)方法進(jìn)行了闡述，為貝類中HAV的研究提供了依據(jù)，也有助于進(jìn)一步探討貝類中HAV檢驗(yàn)的新方法，以防止HAV的傳染與危害。

關(guān)鍵詞：甲型肝炎;貝類;檢測技術(shù)

Research Progress on Detection Technology of Hepatitis A Virus in Shellfish

ZHU Jinyan1， GAO Bin2， SUN Miaomiao3， CHEN Si1， YANG Yu4， MA Lidan5*

（1.Zhuanghe Inspection， Testing and Certification Technology Service Center， Zhuanghe 116400， China; 2.Food College of Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China; 3.Zhuanghe Agricultural Development Service Center， Zhuanghe 116400， China; 4.Dalian Customs Technology Center， Dalian 116000， China; 5.Dandong Customs， Dandong 118000， China）

Abstract： Hepatitis A Virus （HAV） is one of the important causes of foodborne infectious diseases in the world. There are more and more cases of HAV infected shellfish， which has attracted the general attention of domestic researchers. This paper expounds the extraction and inspection methods of HAV in shellfish， which not only puts forward the basis for the research of HAV in shellfish， but also helps to further explore the new methods of HAV inspection in shellfish， so as to prevent the infection and harm of HAV and protect people’s life and health.

Keywords： hepatitis A virus; shellfish; detection technology

甲型肝炎病毒（Hepatitis A Virus，HAV）是平均孔徑大小約為27 nm、無病毒包膜、單鏈小核糖核酸病毒。全球每年感染HAV的人數(shù)約有1 000萬人，其中大約50%的感染源無法確定，僅有2%～3%的報(bào)告病例屬于食源性感染病例[1-2]。傳播途徑通常分為水型暴發(fā)、食物型暴發(fā)、散發(fā)式感染等[3]。目前很多研究人員都使用國際標(biāo)準(zhǔn)方法ISO 15216—2017或采用蛋白酶K法的提取方式對其進(jìn)行檢測，而上述方式都存在回收率較低、操作煩瑣、耗時(shí)較長等問題[4]。為提升貝類檢測的規(guī)范性和準(zhǔn)確性，本文對貝類樣品中HAV的提取和檢測方法的現(xiàn)狀展開論述，為貝類中HAV的檢測提供參考。

1 貝類中甲肝病毒污染

1.1 貝類中食源性甲肝病毒污染情況

許多國家的研究和數(shù)據(jù)證實(shí)了貝類是HAV的重要傳播載體。由于貝類通過消化系統(tǒng)過濾海水來獲取食物，能將海水中的病毒在體內(nèi)積累，從而易于引發(fā)病毒型食源性疾病。2016年全世界有7 134人死于甲型肝炎，因此貝類的病毒污染給消費(fèi)者帶來嚴(yán)重的健康風(fēng)險(xiǎn)，并且有可能給海鮮行業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[5]。

1.2 貝類中食源性甲肝病毒檢測存在的困難

病毒的傳染劑量很低，少量病毒顆粒就可以造成大量傳染，并且病毒顆粒在離體條件下，以無生命的生物大分子狀態(tài)存在，并保持其侵染性。此外，這種病毒的序列變異較大，血清型也較多。貝類食源性甲肝病毒檢測中所存在的問題主要有以下幾點(diǎn)。①貝類食物中的HAV濃度較低。②HAV培養(yǎng)周期較長，很難實(shí)現(xiàn)快速測定。③從病毒中提純RNA的有效性較低。④貝類的生長環(huán)境復(fù)雜，導(dǎo)致其存在多種干擾雜質(zhì)。

2 貝類中食源性甲肝病毒的提取方法

RNA的提取是病毒檢驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。病毒的提取是從食物基質(zhì)中分離出病毒，去除抑制性化合物，并濃縮一定體積。甲肝病毒RNA的提取方法主要有3種，分別為酸吸附—洗脫—濃縮法、直接提取RNA法和蛋白酶K處理法。

2.1 酸吸附-洗脫-濃縮法

酸吸附—洗脫—濃縮技術(shù)用于從碳水化合物 、脂肪、蛋白質(zhì)食品以及貝類產(chǎn)品中提取食源性病毒。通常洗脫步驟需使用中性或堿性洗脫緩沖液。PAPAFRAGKOU等通過酸吸附—洗脫—濃縮方法從5 g牡蠣中檢出HAV為2×100～102 RT-PCRU[6]。

2.2 直接提取病毒RNA法

直接提取病毒RNA法是采取物理或化學(xué)的方法，直接破壞病毒分子，提取病毒RNA。直接提取病毒RNA法已成功應(yīng)用于脂肪、蛋白質(zhì)類食品，研究數(shù)據(jù)顯示，利用鋯珠粉碎牡蠣消化組織，再通過直接提取病毒RNA法從0.15 g的牡蠣消化組織中成功提取到10 RT-PCRU[7]。

2.3 蛋白酶K處理法

利用蛋白酶K的消化功能，可以將貝類樣本消化組織中的病毒分子更好地釋放出來，提高病毒RNA的提取效率。一般情況下，經(jīng)蛋白酶處理的樣品可以經(jīng)過PEG沉淀濃縮或高速離心濃縮進(jìn)一步提高檢測的靈敏性。近年來，市場上可供使用的商業(yè)病毒RNA提取檢測試劑盒日漸增多，極大地改善了RNA的提純操作步驟，有效提升了RNA擴(kuò)增檢測的靈敏度和獲取效果[7]。

3 貝類中甲肝病毒的檢測方法

貝類中甲肝病毒的檢測方法目前主要有分子生物學(xué)法、斑點(diǎn)金免疫結(jié)合法、近紅外免疫層析法、電化學(xué)免疫法和電鏡觀察法。

3.1 分子生物學(xué)

3.1.1 PCR法

PCR法即聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR），是以DNA為模板，特定引物為起點(diǎn)，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行延伸，利用核苷酸底物通過變性、退火、延伸等步驟，將DNA增加到所需數(shù)量進(jìn)行分析的過程。通常PCR法無法對貝類中甲肝病毒指定基因組定量，且敏感度較低，導(dǎo)致該法在檢測中的使用受到限制。

3.1.2 RT-PCR法

RT-PCR即逆轉(zhuǎn)錄PCR法（Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction），是將RNA的反轉(zhuǎn)錄RT和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR法由于效率較高、價(jià)格低廉，在實(shí)驗(yàn)室中使用較為廣泛[6]。但存在的問題是每次反應(yīng)僅擴(kuò)增一次模板，在實(shí)際使用中很難做到同時(shí)處理大批量的樣品。喬煜婷等用免疫磁珠法提取病毒后，采用RT-PCR檢測法順利地測定到了水域土壤中殘留的甲型肝炎病毒，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)勢[8]。

3.1.3 RT-qPCR

RT-qPCR法即實(shí)時(shí)熒光PCR定量法（Real-Time-Quantiative PCR），熒光物質(zhì)被添加到PCR反應(yīng)體系中，并在每個(gè)PCR周期后實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光體信號(hào)的積累，以便對起始模板進(jìn)行定性和定量分析。目前此法應(yīng)用于食品行業(yè)檢測、分子生物學(xué)研究、臨床疾病診斷等方面。

3.1.4 基因芯片檢測法

基因芯片檢測法是一種微芯片技術(shù)，通過機(jī)器或原位合成將高密度的DNA片段按特定順序附著在固相表面，用同位素或熒光材料對DNA探針進(jìn)行標(biāo)記，以實(shí)現(xiàn)基于堿基互補(bǔ)雜交原理的詳細(xì)基因表達(dá)和監(jiān)測研究。該方法具有檢測信息量大、可行性強(qiáng)和系統(tǒng)集成化等多種優(yōu)勢。目前基因芯片法研究需要建立穩(wěn)定的、系統(tǒng)的技術(shù)規(guī)范才能在病毒篩查與預(yù)防病毒感染中廣泛應(yīng)用。

3.2 斑點(diǎn)金免疫結(jié)合法

斑點(diǎn)金免疫結(jié)合法是以微孔濾膜為載體，通過滲濾作用使抗原抗體快速進(jìn)行反應(yīng)。劉瑛等研究了斑點(diǎn)金免疫球蛋白結(jié)合法用于HAV的檢測。該方法具有使用快捷、保留時(shí)間長的優(yōu)點(diǎn)，但存在標(biāo)本誤讀的現(xiàn)象，且成本高，準(zhǔn)確度低，這兩個(gè)因素限制了斑點(diǎn)金免疫法的廣泛應(yīng)用[9]。

3.3 近紅外免疫層析技術(shù)法

近紅外免疫層析法是將近紅外熒光技術(shù)和熒光免疫層析技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的一種新型側(cè)向流技術(shù)，具有背景熒光量小、檢測靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。利用近紅外熒光染料成功制備用于檢測食品樣品中甲肝病毒的近紅外免疫層析試紙條[10]。

3.4 電化學(xué)免疫傳感器法

電化學(xué)免疫傳感器法是通過將抗體或抗原和電機(jī)組合而成的檢測裝置。該方法具有電化學(xué)穩(wěn)定性好和生物選擇性高的特點(diǎn)，目前已被成功地應(yīng)用于水樣分析中HAV值的測定。電化學(xué)免疫傳感器可同時(shí)快速檢測到各種類型的HAV抗原，雖然敏感度較高，但需要大批高品質(zhì)的納米金顆粒和蛋白質(zhì)A，增加了檢測成本[11]。

3.5 電鏡觀察法

電鏡觀察法具有直接、安全的優(yōu)點(diǎn)，但病毒在電鏡下的形態(tài)學(xué)特征并不突出，且靈敏度不高，同時(shí)對技術(shù)條件要求苛刻，因此無法直接應(yīng)用于樣品的檢測[12]。

4 結(jié)語

因食用貝類產(chǎn)品而感染HAV已成為全球重要的公共衛(wèi)生問題之一。因此，國內(nèi)外相關(guān)的食源性HAV檢測方法也在不斷更新與完善?，F(xiàn)如今貝類中HAV的檢測方式日益多樣化、深度化，在便利性、快速性和準(zhǔn)確度等方面均有所突破。貝類屬于低劑量病毒感染，病毒RNA的提取、檢測方法都需要進(jìn)一步創(chuàng)新研究。在此基礎(chǔ)上，建立貝類的快速檢測體系能有效防止感染HAV，避免暴發(fā)病毒感染事件。

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