細胞焦亡誘導在抗腫瘤治療中應用的研究進展

張夢丹 綜述；王毅剛 審閱（浙江理工大學生命科學與醫(yī)藥學院新元醫(yī)學與生物技術研究所，浙江杭州 310018）

隨著人們對細胞死亡機制的研究深入，目前已發(fā)現細胞凋亡、壞死、鐵死亡、自噬性死亡、溶酶體依賴性細胞死亡和免疫原性細胞死亡等多種細胞死亡形 式[1]。1999 年，HERSH 等[2]研究發(fā)現Caspase-1 在沙門氏菌誘導的細胞死亡中被激活，該死亡形式最初被認為是Caspase-1 依賴性細胞凋亡。2000 年，BRENNAN 等[3]研究發(fā)現由沙門氏菌感染的巨噬細胞，其細胞膜完整性被破壞。這與細胞凋亡含有完整的細胞膜的特征相悖，且該巨噬細胞中的Caspase-3與PARP1 均未被激活，其結果表明沙門氏菌誘導的巨噬細胞死亡并非凋亡。2001年，COOKSON等[4]提出細胞焦亡（pyroptosis）的概念，能較好地闡明上述細胞死亡現象。細胞焦亡是一種由焦孔素（gasdermin，GSDM）介導炎癥性程序性細胞死亡，其主要特征為膜穿孔、細胞腫脹、細胞內容物溢出、染色質凝聚以及DNA 斷裂等[5-6]。人GSDM 家族包括GSDM-A、-B、-C、-D、-E和DFNB59等6個成員，其中誘導細胞焦亡機制研究最為完整的是GSDMD 和GSDME。隨著研究的不斷深入，發(fā)現細胞焦亡在多種疾病如腫瘤、動脈粥樣硬化、神經退行性變和代謝性疾病等中都有重要的作用[7-9]。細胞焦亡在腫瘤免疫過程中發(fā)揮了“雙刃劍”作用，一方面促進炎癥因子釋放，形成腫瘤微環(huán)境，從而加劇炎癥因子風暴，增加機體受感染的幾率；另一方面通過引發(fā)炎癥反應抑制腫瘤細胞的增殖，起到抗腫瘤的作用。因此，如何利用細胞焦亡這個新興武器研發(fā)新的腫瘤治療方案、降低化療藥物的耐藥性以及增強機體免疫力成為急需解決的問題。因此，本文針對細胞焦亡發(fā)生的機制、與腫瘤發(fā)生的關系及細胞焦亡的誘導在抗腫瘤治療中應用的研究進展做一綜述。

1 細胞焦亡發(fā)生的機制

1.1 GSDMD介導的細胞焦亡途徑

1.1.1 Caspase-1依賴性途徑 Caspase-1依賴性細胞焦亡又稱經典炎癥小體途徑，其發(fā)生基于炎癥小體的激活。炎癥小體是一個蛋白復合物，主要由模式識別受體（pattern recognition receptor,PRR）、炎性半胱氨酸蛋白酶和凋亡相關斑點樣蛋白組成。在炎癥小體復合物中，最常見的模式識別受體為AIM2、NLRC4、NLRP3 和NLRP1，上述PRR 可被各種刺激活化。如細菌或被病毒感染的宿主細胞中的雙鏈DNA可激活AIM2；細菌蛋白是NLRC4的刺激源；細菌毒素、病毒雙鏈RNA、腺苷三磷酸、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和內源性損傷信號均可活化NLRP3[10]；NLRP1 則通過識別炭疽毒素誘導細胞焦亡[11]。此外，含有Caspase 募集結構域的NLRP1 或NLRC4 可募集pro-Caspase-1 并直接促進其蛋白質水解[12]。在細胞焦亡發(fā)生的經典通路中，活化的Caspase-1 參與IL-18 和IL-1β 非活性前體的形成[13]，IL-18能促進多種細胞產生IFN-γ和穿孔素來改善宿主防御，還能促進Th1 和Th2 細胞的發(fā)育，并刺激Th1 和Th2 型免疫反應；IL-1β 是單核細胞和巨噬細胞等免疫細胞分泌的產物，其作為促炎細胞因子刺激多種炎癥因子的表達和釋放。同時，活化的Caspase-1 能裂解GSDMD 為N 端結構域和C 端結構域，且由于GSDMD-NT 具有親脂性，能聚集在質膜內側，形成大量的孔隙，導致細胞腫脹、膜穿孔以及細胞內容物如IL-1β 和IL-18 的釋放[5,14-15]。研究[16]發(fā)現，當GSDMD-NT 與GSDMD-CT 結合成完整的GSDMD時，上述變化被抑制。

1.1.2 Caspase-4/-5/-11依賴性途徑 Caspase-4/-5/-11依賴性細胞焦亡的發(fā)生與炎癥小體復合體無關，故該途徑也稱為非經典炎癥小體途徑。有研究[17-18]發(fā)現，細菌脂多糖能直接激活人Caspase-4/-5 和鼠Caspase-11，而活化的Caspase 切割GSDMD 穿孔細胞膜。與Caspase-1 不同，Caspase-4/-5/-11 不激活pro-IL-1β 和pro-IL-18；然而，活化的Caspase-11 能以NLRP3 炎癥小體依賴的方式誘導低水平的IL-1β 分泌[17]。RüHL 等[19]研究發(fā)現，細胞焦亡的機制為細胞破裂后鉀離子外流，激活NLRP3/Caspase-1，最終導致IL-1β和IL-18成熟并釋放。由此可見，Caspase-11和Caspase-1 的活化存在緊密聯系，這也成為經典炎癥小體途徑和非經典炎癥小體途徑相互聯合的紐帶（圖1）。

1.2 GSDME介導的細胞焦亡途徑

1.2.1 Caspase-3依賴性細胞焦亡 研究[21-22]發(fā)現，在Caspase-3 依賴性細胞焦亡中，GSDME 是Caspase-3 的反應底物，且GSDME 參與調節(jié)繼發(fā)性壞死。ROGERS 等[21]揭示了活化的Caspase-3能切割GSDME，產生有活性的GSDME-N，后者被激活后則能在細胞膜上穿孔介導細胞焦亡；而WANG 等[22]進一步證實了GSDME 在化療藥物中通過誘導Caspase-3 依賴性細胞焦亡發(fā)揮作用，并且GSDME的表達水平決定了細胞死亡類型，高表達的GSDME 能將細胞凋亡轉化為Caspase-3 依賴性細胞焦亡，或直接發(fā)生細胞焦亡，但低表達的GSDME只能發(fā)生細胞凋亡。然而，LEE 等[23]研究發(fā)現，當Caspase-3 被活化劑（如FasL 或細胞色素C）激活后，缺乏GSDME的巨噬細胞膜仍會遭到破壞，因此他們猜測GSDME 對于遲發(fā)性繼發(fā)性壞死的發(fā)生可能是冗余的。

1.2.2 顆粒酶依賴性細胞焦亡 顆粒酶是由細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）和自然殺傷（natural killer，NK）細胞釋放的外源性絲氨酸蛋白酶，進入靶細胞后通過激活凋亡相關的酶系統而誘導靶細胞凋亡。人體內含5種顆粒酶，分別為顆粒酶A、B、H、K、M。ZHANG 等[9]發(fā)現，顆粒酶通過切割GSDME參與NK細胞誘導的細胞焦亡。為驗證穿孔素和顆粒酶B是否同時參與該過程，該研究團隊在人神經母細胞瘤細胞中開展相關實驗，研究結果顯示，顆粒酶B不僅能直接切割GSDME D270位點，將免疫細胞介導的細胞殺傷機制轉化為細胞焦亡，而且顆粒酶B 還能間接激活Caspase-3，通過Caspase-3依賴性細胞焦亡途徑切割GSDME D270 位點。因此，顆粒酶依賴性通路借助于免疫細胞，能通過細胞焦亡介導抗腫瘤的免疫治療。

2 細胞焦亡與腫瘤發(fā)生

在腫瘤及腫瘤微環(huán)境的形成過程中，細胞焦亡具有抑制和促進其形成的雙重作用[24-25]：一方面，細胞焦亡過程中釋放的炎癥小體能抑制腫瘤細胞的增殖及轉移，其機制為細胞焦亡產生的NLRP3 炎癥小體通過分泌炎癥細胞因子抑制腫瘤發(fā)生；另一方面，炎癥小體的聚集有助于形成腫瘤微環(huán)境，促進腫瘤發(fā)生與發(fā)展。研究[26]表明，NLRP3炎癥小體對DC免疫后腫瘤中髓源抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）的聚集及抗腫瘤T 細胞免疫反應的抑制有重要作用。腫瘤相關巨噬細胞中的NLRP3 通過IL-1β 驅動胰腺導管腺癌腫瘤免疫微環(huán)境中免疫抑制的CD4+T 細胞的極化[27]。另外，IL-22的產生依賴于NLRP3炎癥小體的激活及隨后免疫細胞中IL-1β 的釋放，IL-22 與多種腫瘤的發(fā)展關系密切，如肺癌、皮膚癌、乳腺癌及胃癌等[28]。

此外，在多發(fā)性骨髓瘤中針對NLRP1 炎癥小體與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系，發(fā)現NLRP1 炎癥小體通過介導IL-18的產生誘導細胞焦亡，提高了MDSC的生成率，并加速腫瘤的進展[29]。盡管已知NLRP1 炎癥小體能被炭疽毒素、弓形蟲感染及應激造血激活，但在腫瘤微環(huán)境中其激活機制尚不明確，可能是多發(fā)性骨髓瘤細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的紊亂活化了NLRP1炎癥小體。雖然NLRP1炎癥小體與其效應性細胞因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有促進作用，但細胞焦亡與腫瘤發(fā)生的具體關系尚需深入研究。

3 細胞焦亡誘導在抗腫瘤治療中的應用

3.1 細胞焦亡誘導與抗腫瘤免疫治療

細胞焦亡和腫瘤治療存在著雙向關系。有研究結果[30]表明，腫瘤中心缺氧區(qū)引發(fā)的細胞焦亡能促進腫瘤發(fā)展，并降低患者生存率。由炎性介質引起的慢性炎癥增加了腫瘤發(fā)生的風險，上皮細胞焦亡釋放HMGB1，該釋放物可通過激活ERK1/2 途徑促進結腸炎相關結直腸癌的發(fā)生[31]。另一方面，作為炎癥性細胞死亡，細胞焦亡又能激活免疫系統，包括HMGB1 在內的免疫刺激劑可誘導樹突狀細胞和抗腫瘤T 細胞的活化。研究[32]表明，BRAF 抑制劑和MEK 抑制劑聯合治療黑色素瘤，通過釋放HMGB1觸發(fā)GSDME 依賴性細胞焦亡和強烈的抗腫瘤免疫反應。HOU 等[30]對于該雙重作用的解釋為，激活慢性炎癥可促進腫瘤發(fā)展，而激活急性細胞焦亡會導致壞死性細胞死亡，從而抑制腫瘤進展，達到抗腫瘤治療的效果。此外，WANG等[33]構建了一個生物正交化學系統（bioorthogonal chemistry system，BCS），該系統可選擇性向腫瘤細胞釋放有活性的GSDM。研究發(fā)現，僅10%～30%的腫瘤細胞發(fā)生細胞焦亡即可完全清除腫瘤移植物，且免疫缺陷小鼠體內不存在腫瘤消退現象。以上結果表明，細胞焦亡可能通過激活免疫應答發(fā)揮抗腫瘤作用。

有研究結果[34]證實，腫瘤浸潤性免疫細胞可誘導腫瘤細胞發(fā)生細胞焦亡。嵌合抗原受體修飾的基因工 程T（chimeric antigen receptor gene-modified T,CAR-T）細胞可誘導白血病細胞發(fā)生GSDME依賴性細胞焦亡，其機制涉及CAR-T 細胞釋放的顆粒酶B切割白血病細胞中活化的GSDME。值得注意的是，決定CAR-T細胞誘導靶細胞焦亡的活性的是CAR-T細胞中穿孔素/顆粒酶B 的數量，而不是現有CD8+T細胞中穿孔素/顆粒酶B 的數量[34]。此外，顆粒酶A也被證實能通過切割GSDMB 誘導腫瘤細胞的細胞焦亡[35]。ZHOU 等[35]發(fā)現,將裂解的GSDMB 引入小鼠腫瘤細胞，并通過免疫檢查點療法可有效控制腫瘤。而GSDMB 的表達由IFN-γ 誘導，所以ZHOU 等提出IFN-γ 與免疫檢查點阻斷聯合治療可極大激活抗腫瘤免疫。因此，顆粒酶家族在CTL 引發(fā)的細胞焦亡中發(fā)揮重要作用。CTL中細胞焦亡的激活能增強細胞毒性。有研究顯示，GSDMD在活化的CD8+T表達上調，而GSDMD 缺乏時其細胞毒性有所降低[36]。

目前免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICI）在臨床腫瘤治療中應用前景廣闊，但相關數據表明只有1/3 的患者對ICI 有反應[37]。研究[33]發(fā)現，細胞焦亡與ICI間存在協同效應，誘導靶細胞焦亡會促使抗ICI的腫瘤獲得對ICI的敏感性。該機制是炎癥細胞膜破裂促使細胞內容物外溢，引發(fā)強烈的炎癥反應和大量淋巴細胞浸潤，而這些顯著增加的淋巴細胞進一步誘導Caspase-3依賴性的腫瘤細胞焦亡，形成正反饋以提高抗腫瘤效果[32-33,38]。LU等[39]研發(fā)了一種特制的嵌合共刺激轉化受體（chimeric costimulatory converting receptor，CCCR），該受體由PD-1的胞外區(qū)、NKG2D的穿膜和胞質區(qū)以及41BB 的胞質區(qū)組成。CCCR 修飾的NK92 細胞通過廣泛性誘導細胞焦亡，在體外表現出的抗人肺癌H1299 細胞活性有所增強。然而，另一項研究[40]認為，抗原特異性啟動的CTL 對腫瘤的抑制作用與細胞焦亡無關。因此，細胞焦亡是一種免疫刺激形式的細胞死亡，可以協同ICI，以提高免疫治療的效果。

已有研究[9]發(fā)現，在殺傷性CTL缺失小鼠或免疫缺陷小鼠中，GSDME 不再具有腫瘤抑制作用，這表明GSDME 的腫瘤抑制功能需要依賴于細胞焦亡的抗腫瘤免疫激活。除了可以直接清除腫瘤細胞外，誘導細胞焦亡還可以克服免疫抑制，重新激活機體的抗腫瘤免疫，有利于實現長期控制腫瘤的目標。作為免疫原性細胞死亡的一種主要形式，發(fā)生細胞焦亡的腫瘤細胞能產生大量新抗原，刺激全身免疫反應，顯著抑制腫瘤進展[41]。

3.2 細胞焦亡誘導與化療

越來越多的化療藥物通過介導經典或非經典細胞焦亡途徑誘發(fā)細胞焦亡。WANG 等[22]發(fā)現，在GSDME 高表達的神經纖維瘤SH-SY5Y 細胞或黑色素瘤MeWo 細胞中，傳統化療藥物如多柔比星（doxorubicin，Dox）和順鉑可通過Caspase-3/GSDME途徑誘導細胞焦亡；5-氟尿嘧啶能激活Caspase-3，切割GSDME 誘導細胞焦亡，可以達到治療胃癌目的。CHU 等[42]則發(fā)現，天然化合物如小檗堿和蓖麻素可以激活細胞焦亡，從而抑制癌細胞增殖。此外，ZHANG 等[43]設計了一些天然化合物的結構，為合成和研發(fā)新的化療藥物提供了潛在的可能性。QIAO等[44]報道，2-（beta-萘甲酰基）乙基三甲基碘化銨（α-NETA）可通過GSDMD/Caspase-4途徑誘導上皮性卵巢癌細胞焦亡。

ZHANG 等[45]研究顯示，在高表達GSDME 的肺癌治療中，順鉑相對紫杉醇更能引發(fā)更持久的繼發(fā)性細胞焦亡，Caspase-3/-7 活化水平和GSDME 裂解形成GSDME-NT 的量也更高，導致腫瘤治療功效更佳。張依格等[46]研究指出，正常組織中GSDME高表達會促使化療藥物損傷機體正常組織。WANG 等[47]發(fā)現，二甲雙胍通過靶向miR-497/PELP1信號通路上調抑癌分子miR-497/PELP1 的表達，從而調控由GSDMD介導的細胞焦亡，對食管鱗狀細胞癌的治療起正向作用。富馬酸二甲酯是一種廣譜抗菌藥，研究[48]發(fā)現其能使GSDMD 琥珀酰化，從而抑制由GSDMD誘導的細胞焦亡，因此基于富馬酸鹽靶向抑制GSDMD可研發(fā)相關抗腫瘤藥物。

乳腺癌發(fā)病率近年來迅速攀升，因此，研究細胞焦亡在乳腺癌治療中的作用也引發(fā)關注。XU等[49]發(fā)現，miR-155-5p 下調通過誘導細胞凋亡和細胞焦亡能增強西妥昔單抗對EGFR 高表達的三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）細胞的抗腫瘤作用。此外，四氧化二砷通過激活Caspase-3/GSDME信號通路促進TNBC 細胞線粒體ROS 生成，進而誘導細胞焦亡，抑制TNBC的發(fā)展[50]。LI等[51]進一步研究發(fā)現，雙氫青蒿素能激活乳腺癌細胞中AIM2/Caspase-3/GSDME 軸誘導細胞焦亡，從而抑制乳腺癌的發(fā)生。因此，通過化學藥物誘導乳腺癌的細胞焦亡為乳腺癌治療提供了一種有效的方法，具有較好的應用前景。

最近，ZHANG 等[52]揭示了由代謝物α-酮戊二酸通過Caspase-8介導的GSDMC裂解誘導腫瘤細胞焦亡的新型通路，酸性環(huán)境下α-酮戊二酸被蘋果酸脫氫酶1還原并轉化為L-2-羥基戊二酸，繼而促使ROS水平增加，導致細胞膜上死亡受體6（death receptor,DR6）氧化，進而觸發(fā)[9]DR6 的內吞作用，并通過蛋白質相互作用招募pro-Caspase-8 及GSDMC 至DR6 受體，最終導致細胞焦亡。另外，由于該通路的發(fā)生依賴于酸性環(huán)境，故研究者[52]利用糖酵解最終產物乳酸加以治療，該改良版酸性環(huán)境的建立提高了L-2-羥基戊二酸的表達量，進一步促使抗細胞焦亡的腫瘤細胞發(fā)生α-酮戊二酸誘導的細胞焦亡。上述發(fā)現將細胞代謝物引發(fā)的細胞焦亡與腫瘤治療相聯系，這在腫瘤治療的臨床應用中具有極大的開發(fā)潛力。WANG 等[53]還提出，天然化合物和人工合成小分子均可誘導GSDME介導的細胞焦亡。

3.3 細胞焦亡誘導與其他治療

細胞焦亡和細胞凋亡之間存在著密切聯系。研究[54]發(fā)現，敲除GSDMD能阻斷IL-1β分泌，細胞焦亡轉化為細胞凋亡，從而促進腫瘤細胞的殺傷。SHI等[55]利用在GSDMD 的N 端和C 端結構域間插入其他蛋白酶位點或Caspase-3/-7切割位點以利用基因工程改造GSDMD，也能將細胞凋亡轉變成細胞焦亡。WANG等[22]研究發(fā)現，高表達的GSDME能將細胞凋亡轉化為細胞焦亡，或直接引起細胞焦亡。上述結果為進一步利用細胞焦亡發(fā)揮抗腫瘤作用提供了基礎。

近年來，溶瘤病毒因能靶向殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無殺傷功能引起人們越來越多的關注。溶瘤病毒一方面能特異性在腫瘤細胞中增殖并裂解腫瘤細胞，另一方面也能作為載體攜帶外源抗癌基因表達，從而達到雙重的殺傷腫瘤細胞的作用。本課題組利用溶瘤病毒作為載體開展了一系列的抗腫瘤研究[56]，發(fā)現溶瘤病毒Ad-Wnt(△24bp)-TSLC1 不僅能誘導腫瘤細胞凋亡，也能誘導細胞自噬性死亡。也有研究[57]發(fā)現，溶瘤腺病毒CD55-TMn聯合化療藥物Dox 也能誘導Caspase-3 剪切GSDME 介導的細胞焦亡，導致肝癌細胞特異性殺傷效果。此外，本課題組也開展了溶瘤腺病毒GD55攜帶GSDME基因的肝癌治療研究，發(fā)現GD55-GSDME 單獨或聯合Dox 均能誘導肝癌細胞焦亡，此為進一步開展GD55-GSDME 的抗腫瘤治療奠定了一定的基礎[58]。此外，由于溶瘤病毒能誘導并激活促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9，下調抗凋亡蛋白[59]，并且聯合藥物處理誘導腫瘤細胞凋亡的效果更顯著，因此開發(fā)溶瘤病毒介導的細胞焦亡通路用于腫瘤治療具有一定的可行性。

此外，DING 等[60]研究發(fā)現，NLRP3/Caspase-1/GSDMD 信號通路是細胞焦亡誘導慢性腎病的關鍵機制，而中藥及其提取物可通過抑制NLRP3 信號通路來干預慢性腎病細胞焦亡的發(fā)生與發(fā)展，故探討中醫(yī)藥對細胞焦亡的作用在治療某些癌癥方面至關重要。

4 結語

細胞焦亡是炎性細胞死亡，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，并具有抑制和促進腫瘤的雙重作用。因此，如何進一步闡述細胞焦亡發(fā)揮雙重作用的不同條件，在抗腫瘤治療中將具有重要意義。盡管細胞焦亡能通過抗腫瘤免疫治療、化療和溶瘤病毒等療法發(fā)揮較好的抗腫瘤作用，然而其具體的分子機制尚不明確，有待深入研究。值得一提的是，近年來發(fā)現天然化合物和中藥提取物如高車前素、丙戊酸和補陽還五湯等與化療藥物聯合應用能通過調控細胞焦亡發(fā)揮更好的抗腫瘤治療作用，具有較好的應用前景。針對上述中藥與化療藥物聯合應用治療，可進一步研究其混合比例與濃度以獲取更深入的治療方案，以對細胞焦亡誘導的相關機制作深入探究。