磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法在食品中百草枯殘留量檢測(cè)的應(yīng)用研究

唐潔 莫緒 張啟韓

摘 要：百草枯（Paraquat，PQ）又稱巴拉利，是一種有效的除草劑，具有觸殺作用和一定內(nèi)吸作用，能迅速被植物綠色組織吸收，制其枯死。百草枯在植物中容易產(chǎn)生殘留，對(duì)人體毒性極高，且無特效解毒藥，是人類急性中毒死亡率最高的除草劑，但因其高效、實(shí)用性，仍然未能完全杜絕其應(yīng)用，每年百草枯中毒現(xiàn)象仍時(shí)有發(fā)生。因此，建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的食品中百草枯殘留檢測(cè)對(duì)有效監(jiān)測(cè)食品安全、控制農(nóng)藥濫用具有非常重要的意義。本文利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法對(duì)百草枯6個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液C1～C6進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性、精密度以及穩(wěn)定性分析均優(yōu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。

關(guān)鍵詞：百草枯;磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法;定量檢測(cè)

Application of Magnetic Particle Luminescence Technology in the Determination of Paraquat Residues in Food

Tang Jie， Mo Xu， Zhang Qihan

（Guilin Normal College， Guilin 541199， China）

Abstract： Paraquat （PQ）， also known as Balali， is an effective herbicides. It has contact killing effect and certain internal absorption effect， which can be quickly absorbed by plant green tissue to make it wither. Paraquat is easy to produce residues in plants， highly toxic to human body， and there is no specific antidote. It is the herbicide with the highest mortality of acute poisoning in human beings. However， due to its high efficiency and practicality， the application of paraquat is still not completely eliminated， and paraquat poisoning still occurs from time to time every year. Therefore， the establishment of rapid， accurate and sensitive detection of paraquat residues in food is of great significance to effectively monitor food safety and control pesticide abuse. In this paper， 6 different concentrations of paraquat standard solutions C1～C6 were quantitatively analyzed by magnetic particle chemiluminescence immunoassay. The results show that the accuracy， sensitivity， specificity， precision and stability of the method are better than the requirements of the national standard.

Keywords： paraquat; magnetism particulate immune-chemistry luminescence method; quantitative detection

截止到2020年，包括中國(guó)、英國(guó)、歐盟、丹麥、俄羅斯及巴西等20多個(gè)國(guó)家已經(jīng)禁止或者嚴(yán)格限制使用百草枯。目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用于禁用農(nóng)藥殘留的檢測(cè)技術(shù)為氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和免疫分析法等[1]。

色譜分析法由于檢測(cè)儀器體積龐大，對(duì)使用環(huán)境及操作者素質(zhì)都有非常高的要求，同時(shí)檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng)，只適合在特定的實(shí)驗(yàn)室由專業(yè)人員進(jìn)行操作，難以普及推廣應(yīng)用;免疫分析法主要根據(jù)體外生成原理，利用抗體作為生化探測(cè)器實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)殘的定性和定量分析;其中，采用酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、熒光免疫分析（Fluorescence Immunoassay，F(xiàn)IA）進(jìn)行檢測(cè)都查到有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。但食品中農(nóng)藥殘留的量往往非常低，這些方法由于其檢測(cè)靈敏度和精密度偏低，因而檢測(cè)結(jié)果達(dá)不到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的檢出率。在免疫分析法中，利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法技術(shù)檢測(cè)百草枯農(nóng)藥殘留還未見報(bào)道[2]。

本文采用單克隆抗體、AP酶標(biāo)記以及磁微粒分離技術(shù)，建立了百草枯的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)方法。該方法是在免疫分析法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的集化學(xué)發(fā)光、特異性免疫分析及磁微粒分離等技術(shù)于一體的新型檢測(cè)技術(shù)，相對(duì)于其他傳統(tǒng)分析方法，該技術(shù)具有靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、檢測(cè)成本低及易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作等系統(tǒng)性優(yōu)勢(shì)，最低可檢測(cè)到10-18 g量級(jí)，能及時(shí)有效地為監(jiān)管機(jī)構(gòu)提供監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，為政府職能部門監(jiān)測(cè)和控制農(nóng)藥濫用提供現(xiàn)實(shí)依據(jù)[3-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三羥甲基氨基甲烷（Tris），西隴化工股份有限公司;氯化鈉，西隴化工股份有限公司;牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA），Sigma有限公司;甘露醇，西隴化工股份有限公司;海藻糖，西隴化工股份有限公司;BRONIDOX-L，天津希恩思生化科技有限公司;吐溫20（Tween20），上海聯(lián)邁生物工程有限公司。試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：AR224CN（奧豪斯儀器有限公司）;冷凍離心機(jī)：SF-TGL-20R（上海菲恰爾）;pH計(jì)：Sartoriuspp-20;蛋白測(cè)定儀：K9840（山東還能科學(xué)儀器有限公司）;集熱試恒溫加熱攪拌器：DF-101S（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）;細(xì)胞破碎儀：SM-650A（南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司）;制冰機(jī)：ZBL-35（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試劑緩沖液配制

依次稱取以上物質(zhì)溶解到800 mL純化水里，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為7.4，并定容為1 000 mL的儲(chǔ)備液備用，分別為Tris（0.01 mol/L）、氯化鈉（0.15 mol/L）、BSA（0.5 mol/L）、甘露醇（0.5 mol/L）、海藻糖（0.5 mol/L）、BRONIDOX-L（0.01 mol/L）及Tween20（0.05%）。

1.3.2 檢測(cè)試劑盒主要組份的制備

檢測(cè)試劑盒主要組份由試劑R1、試劑R2及標(biāo)準(zhǔn)液組成。

（1）PQ試劑R1配制。生產(chǎn)工藝流程如圖1所示，采用抗體偶聯(lián)操作工藝。①取10.00 mL磁珠微球（固體物10%），磁分離10 min，棄上清，用100 mL?0.5 mol/L、pH 5.0的MES緩沖液重懸，在混勻儀上混勻10 min;磁分離10 min，棄上清，加入100 mL?0.5 mol/L、PH 5.0的MES緩沖液重懸。②稱取100 mg N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），用0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液充分溶解至10.0 mg/mL;稱取50 mg EDC，用0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液充分溶解至10.0 mg/mL。③在攪拌的條件下，往磁珠微球中先后加入10 mL NHS溶液和5 mL EDC溶液，混勻;④在攪拌的條件下，往磁珠微球中加入百草枯抗體10.00 mg，混勻;⑤磁分離10 min，棄上清，用100 mL 0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液重懸，混勻;⑥磁分離10 min，棄上清，加100.0 mL 10%BSA重懸，混勻;⑦磁分離10 min，棄上清;用100 mL?0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液重懸，混勻即得。

（2）PQ試劑R2配制。R2生產(chǎn)工藝流程如圖2所示，采用抗原標(biāo)記操作工藝。①稱取5 mg百草枯化合物，12 mg DSS，用200 μL DMSO溶解，再加入10 μL N-甲基嗎啉，混合均勻，37 ℃反應(yīng)90 min。②反應(yīng)完成之后再加入1 mL的DMSO，得到百草枯活化液待用。③取1 mg AP酶溶解在0.1 mol/L Tris，pH為8.0的緩沖液中，加入600 μL百草枯活化液，反應(yīng)30 min。④反應(yīng)完成之后，加入100 μL 1 mol/L甘氨酸，反應(yīng)15 min。⑤用蛋白測(cè)定儀確定蛋白標(biāo)記物濃度。⑥用酶標(biāo)記物稀釋液稀釋至25 μg/mL。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)液的制備

將百草枯國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物（貨號(hào)：YJ-XXXX）用0.1 mol/L PH為7.4的PBS緩沖液溶解成1 mg/mL母液;再分別稀釋成0 ng/mL、5 ng/mL、25 ng/mL、125 ng/mL、250 ng/mL及500 ng/mL 6個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液C1～C6。

2 結(jié)果與分析

用6個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)發(fā)光儀進(jìn)行定標(biāo)后，分別進(jìn)行準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性、精密度以及穩(wěn)定性分析。

2.1 準(zhǔn)確度分析

將1 mL高濃度標(biāo)準(zhǔn)液C5（250 ng/mL）加入到9 mL低濃度標(biāo)準(zhǔn)液C1（0 ng/mL）中，混勻后在化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上測(cè)試混合液和低濃度標(biāo)準(zhǔn)液濃度值，各測(cè)試3次，計(jì)算平均值，回收率應(yīng)在85%～115%。根據(jù)公式（1）計(jì)算結(jié)果，回收率為99.58%，在要求范圍以內(nèi)。測(cè)試數(shù)據(jù)見表1。

（1）

式中：R為回收率，%;V為加入高濃度標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL;V0為低濃度標(biāo)準(zhǔn)液的體積，mL;C為混合液測(cè)試平均值，ng/mL;C0為低濃度標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)試值，ng/mL;Cs為已知高濃度標(biāo)準(zhǔn)液濃度，ng/mL。

2.2 靈敏度評(píng)估

取標(biāo)準(zhǔn)液C1和C2作為待測(cè)樣本，在化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀上對(duì)C1進(jìn)行20次測(cè)定，C2測(cè)試3次，統(tǒng)計(jì)測(cè)量結(jié)果的發(fā)光值（RLU），計(jì)算C1的平均值（M）和標(biāo)準(zhǔn)差（Standard Deviation，SD），得出M-2SD;同時(shí)根據(jù)C1和C2之間的發(fā)光值（RLU）進(jìn)行兩點(diǎn)回歸擬合得出一次方程，將M-2SD的RLU值代入上述方程中，求出對(duì)應(yīng)的濃度值，即為產(chǎn)品的靈敏度，要求靈敏度不能大于5 ng/mL（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求最低殘留量）。從表2數(shù)據(jù)可以計(jì)算得出，試劑檢測(cè)靈敏度為0.37 ng/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于5 ng/mL，產(chǎn)品具有很高的靈敏度。

2.3 特異性分析

往試劑盒中滴加干擾物并在化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀上分別測(cè)定濃度為500 ng/mL的干擾物多菌靈和毒死蜱，各測(cè)試3次，測(cè)定結(jié)果應(yīng)不得高于0.5 ng/mL。從表3數(shù)據(jù)可以看出，兩組干擾物的測(cè)試結(jié)果均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.5 ng/mL，說明試劑盒受干擾物影響很小，具有很高的特異性。

2.4 精密度

在化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀上分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液C2和C5，各重復(fù)測(cè)試至少10次，分別計(jì)算測(cè)量值的平均值（x）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）[6]。計(jì)算變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV），結(jié)果應(yīng)≤8%。由表4可知，標(biāo)準(zhǔn)液C2和C5變異系數(shù)均小于8%，產(chǎn)品的精密度很高。

2.5 穩(wěn)定性評(píng)估

將制備好的試劑盒進(jìn)行37 ℃加速老化7 d后，用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)試，對(duì)測(cè)試結(jié)果的發(fā)光值（RLU）進(jìn)行對(duì)照，數(shù)據(jù)見表。從表5中統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，實(shí)驗(yàn)組的蛋白活性回收率達(dá)到了95%以上，說明試劑盒穩(wěn)定性很好。

3 結(jié)論

利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法技術(shù)對(duì)百草枯6個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液C1～C6進(jìn)行檢測(cè)，通過準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性、精密度以及穩(wěn)定性分析，可以得到回收率為99.58%，檢測(cè)靈敏度為0.37 ng/mL，精密度≤8%，蛋白活性回收率可達(dá)到98.17%。

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