介入瓣膜瓣中瓣模式下耐久性能測試及評價

劉 麗，萬辰杰，王 碩，李崇崇，柯林楠

隨著生物瓣膜材料和技術的不斷進展，以及對機械瓣膜終身抗凝并發(fā)癥的重視，越來越多的臨床研究顯示了生物瓣的優(yōu)越性[1~4]。歐洲心臟病學會（European Society of Cardiology，ESC）/歐洲心胸外科學會（European Association for Cardio-Thoracic Surgery，EACTS）2017年發(fā)布的瓣膜性心臟病治療指南（ESC/EACTSguidelines for the management of valvular heart disease）[5]推薦50歲以下患者選擇機械瓣，70歲以上患者選擇生物瓣，50～70歲患者兩種瓣膜都可以考慮，臨床生物外科瓣膜植入患者年齡有降低的趨勢。生物瓣膜一般使用牛心包或者豬主動脈瓣制作，優(yōu)勢在于患者不需要終生服用抗凝藥物，但生物瓣膜發(fā)生瓣膜毀損和再次手術的風險更高，再次開胸手術的風險比首次手術明顯增高。隨著介入瓣的發(fā)展，2008年介入瓣膜瓣中瓣技術開始在臨床上逐漸嘗試使用[6~10]。介入瓣膜瓣中瓣通常不需要開胸和體外循環(huán)，瓣膜壓縮至輸送系統(tǒng)，經(jīng)導管植入至毀損生物瓣膜位置，患者創(chuàng)傷小，恢復快，尤其適用于不能再次承受開胸手術的高?；颊摺＝?年來，中國國內也開始開展瓣中瓣臨床研究[11，12]。但是介入瓣膜直接安裝在已毀損的外科生物瓣膜內，導致植入的介入瓣面積更小，瓣膜跨瓣壓差增加，從而可能影響瓣膜壽命。目前介入瓣膜瓣中瓣臨床使用時間尚短，缺少長期臨床研究數(shù)據(jù)[13~18]。筆者采用體外加速方法，對一種介入瓣膜瓣中瓣模式下耐久性能進行研究，可作為介入瓣膜瓣中瓣臨床前體外評價的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品

將介入瓣膜（規(guī)格23 mm、27 mm、29 mm）按照說明書通過輸送系統(tǒng)安裝在對應規(guī)格外科生物瓣膜中作為實驗樣品形成瓣中瓣。由于放入介入瓣之前利用外科瓣的支架彈性及特殊設計對其進行了預擴張，使得放入介入瓣膜后瓣口內徑仍可維持原尺寸。所有測試環(huán)境參數(shù)模擬及標準參照為主動脈瓣位。

1.1.2 實驗試劑與儀器

流體：0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）。

人工心臟瓣膜疲勞測試系統(tǒng)（提供100 mmHg的平均反向壓力，1 000次/分的加速頻率）、模塊化人工心臟瓣膜脈動流測試系統(tǒng)（模擬主動脈瓣部位流動環(huán)境，提供生理壓力及流量波形，2～7 L/min的模擬心輸出量）（上海心瓣測試設備有限公司，中國）。差示掃描量熱儀（DSC 214 Polyma。Netzsch，德國）；雙光子共聚焦顯微鏡（A1R MP。Nikon，日本）。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理

在實驗臺的瓣膜安裝位置先安裝外科生物瓣膜（牛心包），進行測試后利用其瓣架上的特殊裝置及材料本身的彈性用球囊將其內徑擴大，使得介入瓣膜放入后與原先測試的外科瓣膜有相同的瓣口內徑。將介入瓣膜按照使用說明壓握至適用規(guī)格的輸送系統(tǒng)上，按實驗管路通過輸送系統(tǒng)放入對應規(guī)格的外科瓣膜中（實驗瓣膜的規(guī)格為23/27/29 mm 3個尺寸），形成瓣中瓣模式。

1.2.2 耐久性能實驗

耐久性能測試是評價瓣膜長期有效性的體外測試方法。該實驗模擬瓣膜臨床使用條件及使用時間，對瓣膜的長期使用性能進行評估。根據(jù)YY/T 1449.3—2016及ISO 5840-3：2013介入瓣膜標準，對于介入瓣膜一般考慮模擬臨床使用5年（2.0億次循環(huán)）過程中瓣膜的性能進行評價。利用人工心臟瓣膜疲勞測試系統(tǒng)對組裝好的介入瓣膜瓣中瓣進行耐久性能測試[19，20]。調節(jié)電機運動幅值及頻率，使得通過測試瓣膜平均跨瓣壓差為13.3 kPa（100 mmHg），至少95%循環(huán)達到通過閉合瓣膜的定義目標壓差峰值13.3 kPa（100 mmHg），每個循環(huán)中至少有5%的時間里所受壓差是等于或大于13.3 kPa（100 mmHg）。

1.2.3 脈動流參數(shù)測量

采用模塊化人工心臟瓣膜脈動流測試系統(tǒng)進行脈動流實驗[19，20]。測試瓣膜每0.5億次進行脈動流性能測試。在平均主動脈壓13.3 kPa（100 mmHg）、頻率為70次/分、模擬心輸出量為5.0 L/min的實驗條件下，測試瓣膜的平均跨瓣壓差、反流百分比、有效瓣口面積、泄漏量和關閉量。將0次、0.5億次、1.0億次、1.5億次、2.0億次的介入瓣膜瓣中瓣脈動流性能測試數(shù)據(jù)進行對比、分析。

1.2.4 瓣葉熱力學分析

分別取疲勞測試前后的介入瓣膜的瓣葉，用濾紙吸干表面水分，稱量約5 mg，置于差示掃描量熱儀的鋁制樣品盤中，密封加熱，起始溫度10℃，每分鐘升高2℃，最終溫度150℃。以吸熱峰值作為樣品的變性溫度。

1.2.5 瓣葉膠原纖維結構分析

分別取疲勞測試前后的介入瓣膜的瓣葉，在雙光子共聚焦顯微鏡下觀察，激光設置為840 nm的激發(fā)波長，以誘導細胞外基質依賴的自體熒光和二次諧波（second harmonic generation，SHG）產(chǎn)生。選擇檢測器前的低通濾波器采集膠原的SHG信號。探測器的針孔被設置為最大值以收集焦平面上產(chǎn)生的所有光。觀察膠原纖維的結構。

1.3 統(tǒng)計學方法

運用SPSS統(tǒng)計軟件線性回歸方法對耐久性能測試中介入瓣膜瓣中瓣脈動流性能的穩(wěn)定性進行分析，采用配對t檢驗對瓣葉熱變性溫度進行分析。

2 結果

2.1 3種介入瓣膜脈動流參數(shù)測量結果

2.1.1 3種介入瓣膜脈動流參數(shù)比較

每0.5億次后進行脈動流性能測試。23 mm瓣中瓣平均跨瓣壓差為1.92～1.98 kPa（14.4～14.9 mmHg），反流百分比為7.2%～3.3%，有效瓣口面積為1.45～1.66 cm2；27 mm瓣中瓣平均跨瓣壓差為0.92～1.64 kPa（6.9～12.3 mmHg），反流百分比為14.9%～3.3%，有效瓣口面積為1.88～2.17 cm2；29 mm瓣中瓣平均跨瓣壓差為0.72～1.02 kPa（5.4～7.4 mmHg），反流百分比為14.7%～3.9%，有效瓣口面積為2.24～2.54 cm2。見圖1～3。采用線性回歸方法對脈動流測試數(shù)據(jù)進行分析，在95%可信區(qū)間，平均跨瓣壓差、反流百分比和有效瓣口面積無顯著性變化趨勢。

圖1 3種介入瓣膜瓣中瓣平均跨瓣壓差比較柱狀圖Fig.1 Comparison histogram of mean valve difference pressure in 3 of valve in valve-transcatheter heart valves

圖2 3種介入瓣膜瓣中瓣反流百分比比較柱狀圖Fig.2 Comparison histogram of reflux percentage in 3 of valve in valve-transcatheter heart valves

圖3 3種介入瓣膜瓣中瓣有效瓣口面積比較柱狀圖Fig.3 Comparison histogram of effective valve area in 3 of valve in valve-transcatheter heart valves

2.1.2 3種介入瓣膜瓣中瓣反流量比較

介入瓣膜瓣中瓣反流量分為2部分，即泄漏量和關閉量。2.0億次疲勞測試過程中，23 mm瓣中瓣關閉量為1.40～0.82 mL，泄漏量為3.83～1.52 mL；27 mm瓣中瓣關閉量為4.03～1.29 mL，泄漏量為6.53～0.44 mL；29 mm瓣中瓣關閉量為3.63~2.12 mL，泄漏量為7.02～0.66 mL。見圖4。采用線性回歸方法對脈動流測試數(shù)據(jù)進行分析，在95%可信區(qū)間，29 mm瓣中瓣泄漏量明顯減小，差異有顯著性，其余泄漏量和關閉量均無顯著性變化趨勢。

圖4 3種介入瓣膜瓣中瓣反流量比較Fig.4 Comparison histogram of reflex in 3 of valve in valvetranscatheter heart valves

2.1.3 在標準條件下，脈動流性能參數(shù)比較

介入瓣膜瓣中瓣在13.3 kPa（100 mmHg）平均壓力、70次/分心率、5 L/min心輸出量下的脈動流性能數(shù)據(jù)符合YY/T 1449.3—2016規(guī)定值。YY/T1449.3—2016《心血管植入物 人工心臟瓣膜 第3部分：經(jīng)導管植入式人工心臟瓣膜》（等同轉化于ISO 5840-3：2013）對于左心植入的介入瓣膜的最低脈動流性能做了規(guī)定（表1）。從表1可以看出，經(jīng)過2.0億次疲勞測試的介入瓣膜瓣中瓣在13.3 kPa（100 mmHg）平均壓力、70次/分心率、5 L/min心輸出量下的脈動流性能實驗結果完全滿足該標準的要求，說明介入瓣膜瓣中瓣經(jīng)過2.0億次疲勞測試后仍具有良好的脈動流性能。

表1 3種介入瓣膜瓣中瓣脈動流性能實驗結果Tab.1 Comparison pulsatile-flow testing performance in 3 of valve in valve-transcatheter heart valves

2.2 3種介入瓣膜熱力學分析測試結果

介入瓣膜瓣中瓣疲勞測試前后，瓣葉熱變性溫度下降（圖5），疲勞測試前瓣葉熱變性溫度為（105.40±0.92）℃，疲勞測試后瓣葉熱變性溫度為（98.10±0.50）℃（n=3），差異有統(tǒng)計學意義（t=9.031，P<0.05）。

圖5 3種介入瓣膜瓣葉熱力學分析測試曲線Fig.5 Thermodynamic analysis test curve in 3 leaflet in valve-transcatheter heart

2.3 瓣膜耐久性測試病理變化

耐久性能測試前后的介入瓣膜瓣中瓣瓣葉在雙光子共聚焦顯微鏡下觀察，激光激發(fā)波長為840 nm，測試結果見圖6。從圖6可以看出，經(jīng)過2.0億次疲勞測試后，瓣葉材料在雙光子共聚焦顯微鏡下觀察到，膠原纖維形狀發(fā)生變化，由疲勞測試前卷曲的立體結構，變?yōu)槠跍y試后波浪形線狀結構，可能是部分化學鍵丟失，跟熱變性溫度的表現(xiàn)是一致的。

圖6 雙光子共聚焦顯微鏡下840 nm激發(fā)波長下的介入瓣膜瓣葉疲勞實驗前后圖像Fig.6 Images of before and after leaflet in valve-transcatheter heart fatigue experiment at 840 nm excitation wavelength under two-photon confocal microscope

3 討論

隨著外科生物瓣膜植入時間的推移，越來越多的植入的生物瓣膜發(fā)生毀損或鈣化，介入瓣膜作為瓣中瓣的應用逐漸增多，但由于介入瓣膜瓣中瓣植入時間還很短，目前沒有長期臨床數(shù)據(jù)可以參考。筆者首次通過體外加速疲勞測試，模擬介入瓣膜瓣中瓣植入5年的使用時間（2.0億次瓣膜開閉），并對疲勞測試后瓣膜流體力學性能、瓣膜瓣葉的熱變性溫度、膠原蛋白纖維結構進行了評價。

經(jīng)過2.0億次耐疲勞測試，介入瓣膜瓣中瓣平均跨瓣壓差無顯著變化，反流百分比減小，有效瓣口面積基本一致。其中瓣膜反流量包括2部分，瓣膜關閉過程中產(chǎn)生的關閉量和瓣膜關閉后發(fā)生的泄漏量。2.0億次疲勞實驗過程中，瓣膜關閉量無明顯變化，但泄漏量在逐漸減小。說明瓣膜疲勞測試過程中，泄漏量減小是反流百分比減小的原因。瓣膜泄漏量減小說明3個瓣葉運動中配合度越來越好。

YY/T 1449.3—2016《心血管植入物 人工心臟瓣膜 第3部分：經(jīng)導管植入式人工心臟瓣膜》（等同轉化于ISO 5840-3：2013）對于左心植入的介入瓣膜的最低脈動流性能做了規(guī)定，經(jīng)過2.0億次疲勞測試的介入瓣膜瓣中瓣在13.3 kPa（100 mmHg）平均壓力、70次/分心率、5 L/min心輸出量下的脈動流性能實驗結果完全滿足該標準的要求，說明介入瓣膜瓣中瓣經(jīng)過2.0億次疲勞測試后仍具有良好的脈動流性能。

經(jīng)過2.0億次疲勞測試后，瓣葉材料的熱力學變性溫度降低，熱變性溫度是組織內存在化學鍵的表現(xiàn)，這些鍵維持了蛋白質內或蛋白質間三維、四維結構的穩(wěn)定。疲勞測試后熱變性溫度降低，可能是一些化學鍵受到破壞，鍵合程度降低，瓣葉交聯(lián)程度降低。瓣葉材料在雙光子共聚焦顯微鏡下觀察到，膠原纖維形狀發(fā)生變化，由疲勞測試前卷曲的立體結構，變?yōu)槠跍y試后波浪形線狀結構，表明部分化學鍵丟失，跟熱變性溫度的表現(xiàn)是一致的。

筆者對一種介入瓣膜瓣中瓣進行耐久性能測試，并首次采用熱力學分析和雙光子共聚焦顯微鏡對耐久性能測試后的瓣葉進行分析，從微觀角度對介入瓣膜瓣中瓣耐久性能進行評價。經(jīng)過2.0億次耐久性能測試，介入瓣膜瓣中瓣流體力學性能無顯著變化，但瓣葉在纖維結構方面發(fā)生了變化，說明熱變性溫度和膠原纖維結構對于評價生物瓣膜耐久性能具有一定意義。

4 結論

介入瓣膜瓣中瓣經(jīng)過2.0億次疲勞測試后，瓣葉膠原纖維結構由完整的三維結構變?yōu)榫€性二維結構，熱變性溫度降低，但瓣膜脈動流性能指標未發(fā)生變化，且均滿足YY/T 1449.3—2016標準中介入瓣膜的脈動流性能要求。說明疲勞測試后，介入瓣膜瓣中瓣微觀結構發(fā)生了變化，但仍具有良好的流體力學性能。

5 不足和展望

筆者研究中將介入瓣膜放入完好的外科生物瓣膜中進行測試，未模擬出外科瓣膜毀損甚至鈣化的情況，而這類情況的發(fā)生是患者需要放入瓣中瓣的主要原因。當外科瓣膜發(fā)生毀損（鈣化），可能導致植入的瓣中瓣局部變形，從而影響瓣中瓣的耐久性能。由于毀損和鈣化情況多種多樣，很難選擇測試標準模型。由于該模型的重要性，目前在收集臨床病例的影像數(shù)據(jù)，試圖建立具有代表性的瓣中瓣測試周圍錨定幾何模型。