芪參顆粒抗缺血性中風(fēng)線粒體保護(hù)作用研究

劉黎明 戴玉豪 吳文潔 劉陳 李韶菁

摘要 目的：基于線粒體呼吸功能，研究芪參顆粒對(duì)缺血性中風(fēng)相關(guān)線粒體能量代謝障礙保護(hù)作用。方法：選用PC12神經(jīng)細(xì)胞復(fù)制缺氧缺糖損傷模型，采用細(xì)胞能量代謝分析儀（Seahorse XFe 96）考察芪參顆粒及藥效成分對(duì)糖氧剝奪細(xì)胞呼吸功能的保護(hù)作用。復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）模型，采用Clark氧電極法檢測(cè)芪參顆粒對(duì)MCAO大鼠腦線粒體三態(tài)呼吸速率、四態(tài)呼吸速率、磷氧比、呼吸控制率、氧化磷酸化率等呼吸功能相關(guān)指標(biāo)。蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）檢測(cè)腦線粒體功能相關(guān)解偶聯(lián)蛋白（UCP）-1、UCP-2的表達(dá)水平變化。結(jié)果：芪參顆粒及其主要藥效成分可提升細(xì)胞線粒體有氧呼吸水平，改善缺血性中風(fēng)大鼠腦線粒體呼吸功能;與模型組比較，芪參顆粒觀察組的腦組織中UCP-1、UCP-2表達(dá)明顯下降（P<0.01）。結(jié)論：芪參顆粒能夠顯著提高缺氧后神經(jīng)細(xì)胞線粒體能量代謝水平，降低缺血性腦卒中大鼠腦線粒體呼吸功能損傷，其調(diào)節(jié)作用可能與UCP密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞 芪參顆粒;PC12細(xì)胞;糖氧剝奪;腦卒中;能量代謝;線粒體呼吸速率;解偶聯(lián)蛋白;腦心同治

Protective Effect of Qishen Granules on Mitochondria Against Ischemic Stroke

LIU Liming1，DAI Yuhao1，WU Wenjie2，LIU Chen1，LI Shaojing1

（1 Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100010，China; 2 Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230000，China）

Abstract Objective：To investigate the protective effect of Qishen Granules on mitochondrial energy metabolism disorders caused by ischemic stroke based on mitochondrial respiratory function.Methods：PC12 nerve cells were selected to replicate the oxygen-glucose deprivation（OGD） model.The cell energy metabolism analyzer（Seahorse XFe96） was used to investigate the protective effect of Qishen Granules and their medicinal ingredients on the respiratory function of OGD cells.The middle cerebral artery occlusion（MCAO） model was induced in rats.Clark oxygen electrode was used to detect state 3 respiration rate，state 4 respiration rate，P/O ratio，respiratory control rate，oxidative phosphorylation rate，and other indicators related to the respiration function of brain mitochondria extracted from MCAO rats treated by Qishen Granules.Western blot was used to detect changes in the expression of uncoupling protein（UCP）-1 and UCP-2 which was closely associated with brain mitochondrial function.Results：Qishen Granules and their main medicinal components could increase the levels of aerobic respiration of mitochondria and improve the respiratory function of brain mitochondria in rats with ischemic stroke.Compared with the model group，the protein expression of UCP-1 and UCP-2 in the Qishen Granules group decreased（P<0.01）.Conclusion：Qishen Granules can significantly increase the level of mitochondrial energy metabolism of nerve cells after hypoxia，reduce the damage of brain mitochondrial respiratory function in rats with ischemic stroke，and the regulatory effect may be closely related to UCP.

Keywords Qishen Granules; PC12 cells; Oxygen-glucose deprivation; Stroke; Energy metabolism; Mitochondrial respiration rate; Uncoupling protein; Brain and heart treatment

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.07.013

芪參顆粒是基于慢性心力衰竭臨床研究，以真武湯和四妙勇安湯為基礎(chǔ)化裁而得，主治氣虛血瘀所致的慢性心力衰竭證[1]。基于“虛、毒、瘀”的病因病機(jī)，芪參顆粒以益氣溫陽(yáng)、清熱解毒、活血化瘀作為治療理念，對(duì)心肌纖維化及心肌梗死后心力衰竭有著良好的治療效果[2]。而這一治則也契合中醫(yī)對(duì)中風(fēng)“毒損腦絡(luò)”病機(jī)的治療策略，且芪參顆粒的抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等諸多藥理作用也與中風(fēng)分子保護(hù)機(jī)制密切相關(guān)[3-9]。既往研究主要集中在芪參顆粒的心血管保護(hù)作用研究，而針對(duì)腦病治療，如其對(duì)缺血性中風(fēng)保護(hù)作用尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

細(xì)胞能量代謝障礙是缺血性中風(fēng)早期病理的標(biāo)志性事件，而線粒體作為細(xì)胞生物能量生成和轉(zhuǎn)換的主要場(chǎng)所，在中風(fēng)發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用，因此對(duì)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)在缺血性中風(fēng)治療中意義重大[10-11]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)解偶聯(lián)蛋白（Uncoupling Protein，UCP）可以調(diào)節(jié)線粒體呼吸[12]，可能通過(guò)介導(dǎo)線粒體功能從而影響腦缺血疾病的進(jìn)程，但其與腦缺血疾病之間的關(guān)系尚不明確。本實(shí)驗(yàn)從線粒體呼吸的角度，在細(xì)胞和動(dòng)物水平考察芪參顆粒對(duì)缺血性中風(fēng)線粒體能量代謝障礙的干預(yù)作用及其與UCP相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與動(dòng)物 PC12細(xì)胞購(gòu)自國(guó)家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫(kù)（BMCR），貨號(hào)：SCSP-517。健康Sprague Dawley（SD）大鼠（SPF/VAF級(jí)），7周齡，體質(zhì)量250～260 g，雄性，共44只。購(gòu)于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SYXK-（京）2019-0010。置于溫度（25±2）℃飼養(yǎng)室，動(dòng)物均自由飲水進(jìn)食，濕度40%～70%，明暗交替12 h/12 h。本文所涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)（倫理審批號(hào)：2021B193）。

1.1.2 藥物 芪參顆粒由黃芪、丹參、金銀花、玄參、附子、甘草組成，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制備并提供。北京中醫(yī)藥大學(xué)肖紅斌課題組通過(guò)建立“血漿、心臟靶器官-芪參顆?！狈聪蛲诰蚣夹g(shù)，鑒定出芪參顆粒中參與調(diào)節(jié)心臟、血管功能的主要藥效成分為：甘草酸、綠原酸、丹酚酸B、丹參酮ⅡA和黃芪甲苷等。甘草酸（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：1021E021）;綠原酸（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：1022L021）;丹參酮ⅡA（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：1022F021）;丹酚酸B（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：1021J021）;黃芪甲苷Ⅳ（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：17J11Q15731）;銀杏葉提取物（EGb761）（德國(guó)威瑪舒培博士藥廠，批號(hào)：4250213）。全部實(shí)驗(yàn)用藥物均用純水配制。

1.1.3 試劑與儀器 胎牛血清（Hyclone 公司，美國(guó)，貨號(hào)：SH3040602）;DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司，美國(guó)，貨號(hào)：C11995）;0.25%胰蛋白酶（Invitrogen公司，美國(guó)，貨號(hào)：25200056）;青-鏈霉素雙抗溶液（Invitrogen公司，美國(guó)，貨號(hào)：15140122）;L-谷氨酸鈉（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G8010-100）;L-蘋果酸（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：L8090-25）;廣譜蛋白Marker（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：PR1920-50）;MTT（北京博奧拓達(dá)科技有限公司，貨號(hào)：Top0190）;磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）（碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：C0221A）;Tris-HCl（碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：ST774）;乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic Acid，EDTA）（碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：ST1303）;BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：P0012），RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：P0013C）;SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）凝膠快速配制試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：P0012AC）;SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）（碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：P0015L）;ADP-Na（Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：1897）;牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：A8010）;無(wú)水乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）（Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：E5134）;葡萄糖（Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：Y0001745）;丙酮酸鈉（Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：P2256）;二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）（Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：D2650）;水合氯醛（中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)，貨號(hào)：HCYH210415）;蔗糖（中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)，貨號(hào)：10021418）;磷酸二氫鉀（中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)，貨號(hào)：10017608）;氯化鉀（中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)，貨號(hào)：10016308）;氯化鈉（中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)，貨號(hào)：10019308）;無(wú)水氯化鈣（中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)，貨號(hào)：C1016）;無(wú)水硫酸鎂（中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)，貨號(hào)：33337）;磷酸氫二鈉（中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)，貨號(hào)：20040617）;碳酸氫鈉（中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)，貨號(hào)：10018960）;HEPES（Amresco公司，美國(guó)，貨號(hào)：H8090-25）;谷氨酰胺（Amresco公司，美國(guó)，貨號(hào)：G8230-25）;Seahorse XF細(xì)胞線粒體壓力測(cè)定試劑盒（Agilent公司，美國(guó)，貨號(hào)：103015-100）;Seahorse XF Base Medium培養(yǎng)基（Agilent公司，美國(guó)，貨號(hào)：102353-100）;校準(zhǔn)液（Agilent公司，美國(guó)，批號(hào)：28318001）;兔抗-UCP1（博士德生物工程有限公司，貨號(hào)：M00255）;兔抗-UCP2（博士德生物工程有限公司，貨號(hào)：A02256-1）;山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：ZB-2301）;聚偏二氟乙烯（Polyvinylidenefluoride，PVDF）膜（Millipore公司，美國(guó)，貨號(hào)：C3117）。酶標(biāo)儀（Tecan公司，瑞士，型號(hào)：SUNRISE）;Seahorse能量代謝分析儀（Agilent公司，美國(guó)，型號(hào)：Seahorse XFe96）;782 Oxygen System（Strathkelvin公司，英國(guó)，型號(hào)：2479）;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司，型號(hào)：H-1850R）;萬(wàn)級(jí)天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：FA2204B）;實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)[奧豪斯儀器（上海）有限公司，型號(hào)：STARTER2100];數(shù)顯恒溫?cái)嚢韬銣厮洌ǔＶ輫?guó)華電器有限公司，型號(hào)：HH-60）。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制 缺氧缺糖液：稱取氯化鈉0.68 g、氯化鉀0.04 g、無(wú)水氯化鈣0.02 g、無(wú)水硫酸鎂0.01 g、磷酸氫二鈉0.03 g，碳酸氫鈉0.22 g，HEPES 0.48 g，加入100 mL雙蒸水充分溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，4 ℃儲(chǔ)存[13];以上樣品檢測(cè)液：取100 mL XF Base Medium，加入0.18 g葡萄糖，0.055 g丙酮酸鈉，0.029 2 g谷氨酰胺充分溶解，37 ℃水浴鍋預(yù)熱，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH=7.4，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，4 ℃儲(chǔ)存;線粒體分離試劑：稱取蔗糖42.787 g、Na2EDTA 0.84 g、BSA 0.5 g，量取Tris-HCl（1 mol/L）5 mL充分溶解于500 mL雙蒸水，調(diào)pH=7.4，4 ℃儲(chǔ)存;線粒體呼吸緩沖液：稱取蔗糖7.702 g、KH2PO4 0.068 g、KCl 0.074 6 g、EDTA 0.005 8 g、BSA 0.01 g，量取Tris-HCl（1 mol/L）1 mL充分溶解于100 mL雙蒸水，調(diào)pH=7.4，分裝后-20 ℃儲(chǔ)存;ComplexⅠ底物：配制L-谷氨酸鈉10 mol/L，L-蘋果酸5 mol/L，分裝后-20 ℃儲(chǔ)存，工作液稀釋5倍即L-谷氨酸鈉2 mol/L，L-蘋果酸1 mol/L;ADP-Na2：配制ADP-Na2 0.25 mol/L，分裝后-20 ℃儲(chǔ)存，工作液稀釋5倍即ADP-Na2 0.05 mol/L。

1.2.2 細(xì)胞線粒體壓力測(cè)試 研究芪參顆粒及其藥效成分甘草酸、綠原酸、丹酚酸、丹參酮ⅡA、黃芪甲苷Ⅳ對(duì)糖氧剝奪PC12的線粒體保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)分組如下：對(duì)照組，甘草酸組（100 μmol/L）、綠原酸組（100 μmol/L）、丹酚酸B組（100 μmol/L）、丹參酮ⅡA組（100 μmol/L）、黃芪甲苷Ⅳ組（100 μmol/L），芪參顆粒中劑量組（50 μg/mL）、芪參顆粒高劑量組（100 μg/mL），設(shè)置6復(fù)孔，各組藥均用DMSO配制母液后，用缺糖缺氧液稀釋至工作濃度。取生長(zhǎng)良好的PC12細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為1.125×105個(gè)/mL，接種在XF 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔9 000個(gè)細(xì)胞（體積為80 μL）。室溫靜置60 min后，將細(xì)胞移入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育12 h。向探針板各孔中加入200 μL水化液，將探針浸潤(rùn)在水化液中，置于37 ℃、無(wú)CO2搖床中水化過(guò)夜。次日，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，更換缺糖缺氧液并按照分組給藥，放置在缺氧小室中，通入95% N2、5% CO2的混合氣體，待30 min后氣體飽和，放置37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。缺氧6 h后，吸除缺氧液更換上樣檢測(cè)液，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。取出探針板，按照試劑盒說(shuō)明書配制線粒體呼吸鏈試劑Oligomycin、FCCP、AntimycinA/Rotenone，并依次注入探針板的A、B、C加藥倉(cāng)中，更換校準(zhǔn)液入機(jī)校準(zhǔn)20 min。校準(zhǔn)完成后將底板換成細(xì)胞培養(yǎng)板上機(jī)檢測(cè)，由探針實(shí)時(shí)測(cè)量的微孔內(nèi)的氧氣消耗速率（Oxygen Consumption Rate，OCR），可根據(jù)公式計(jì)算線粒體有氧呼吸相關(guān)參數(shù)。在測(cè)定曲線中，非線粒體呼吸=加入AntimycinA/Rotenone后的OCR值;ATP合成值=加入Oligomycin前后OCR的差值;基礎(chǔ)呼吸值=加入Oligomycin前的OCR值-非線粒體呼吸;最大呼吸值=加入FCCP后的OCR值-非線粒體呼吸;備用呼吸值=最大呼吸值-基礎(chǔ)呼吸值;質(zhì)子漏=基礎(chǔ)呼吸值-ATP合成值。根據(jù)公式計(jì)算各組細(xì)胞在缺氧條件下的有氧呼吸參數(shù)：質(zhì)子漏、基礎(chǔ)呼吸、最大呼吸、ATP合成、備用呼吸。

1.2.3 大鼠分組與模型制備 將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性藥組（銀杏葉提取物，4 mg/kg）、芪參顆粒高、中、低（7.46、3.73、1.87 g/kg）劑量組，每組6只。各組術(shù)前15 min灌胃給藥，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水。腹腔注射10%水合氯醛（400 mg/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后。參照Longa EZ建立的大鼠MCAO方法，對(duì)模型組及給藥組大鼠進(jìn)行MCAO模型復(fù)制，假手術(shù)組不插線栓，僅行術(shù)前麻醉以及血管分離、暴露。將大鼠仰臥固定，75%乙醇消毒頸部皮膚，于正中切口，鈍性分離肌肉和筋膜并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈的近心端結(jié)扎，沿頸總動(dòng)脈繼續(xù)向遠(yuǎn)心端分至分叉處，剝離頸外和頸內(nèi)動(dòng)脈，夾閉頸總動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端，在頸總動(dòng)脈距分叉處1.5 cm剪一小口，將制備好的線栓從剪口處插入，并沿頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈。當(dāng)進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈的線栓長(zhǎng)2 cm時(shí)，結(jié)扎頸總動(dòng)脈以固定線栓，縫合皮膚。整個(gè)手術(shù)過(guò)程室溫保持在（22±2）℃。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.4.1 神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 術(shù)后12 h，參照Bederson等[14]的5級(jí)評(píng)分法（0～4分），對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，分?jǐn)?shù)越高，說(shuō)明大鼠神經(jīng)行為損傷越嚴(yán)重。1）行為完全正常者，記0分;2）提起鼠尾離開地面，手術(shù)對(duì)側(cè)前肢內(nèi)旋、內(nèi)收者，記1分;3）大鼠置于地面，用手?jǐn)D壓前肢兩側(cè)，手術(shù)對(duì)側(cè)抗力下降者，記2分;4）大鼠置于地面，觀察其行走，圍繞手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈者，記3分;5）大鼠損傷極其嚴(yán)重，無(wú)法自主活動(dòng)者，記4分。

1.2.4.2 離體線粒體制備及蛋白標(biāo)定 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后，速取大腦，在冰臺(tái)上去除小腦和嗅球，切開左右腦，取缺血側(cè)腦剪成3 mm小塊，加入冰冷的線粒體分離試劑，冰浴緩慢勻漿10次，進(jìn)行梯度離心：1）600×g，4 ℃離心3 min，取上清液;2）1 000×g，4 ℃離心5 min，取上清液;3）10 000×g，4 ℃離心8 min，棄上清液保留沉淀;4）重懸沉淀，10 000×g，4 ℃離心8 min，棄上清液，用分離試劑重懸沉淀，得粗制線粒體。采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)粗制線粒體進(jìn)行蛋白定量。按BCA試劑：Cu試劑=50∶1的比例配制BCA工作液，充分混勻。取粗制線粒體懸液40 μL于96孔板中，用PBS倍比稀釋6個(gè)梯度，取最后4個(gè)梯度加入工作液，做3個(gè)平行。取10 μL BSA標(biāo)準(zhǔn)品（5 mg/mL）用PBS稀釋至62.5 μL，使終濃度為0.8 mg/mL。將BSA標(biāo)準(zhǔn)品以0、2、4、6、8、12、16、20 μL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)蛋白孔中，加PBS補(bǔ)足至20 μL，做3個(gè)平行。向每孔中加200 μL工作液，將96孔板放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min，取出冷卻到室溫，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，檢測(cè)波長(zhǎng)為562 nm。將測(cè)得的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)蛋白的含量，根據(jù)稀釋梯度折回到線粒體蛋白的原始濃度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將線粒體蛋白統(tǒng)一標(biāo)定到10 mg/mL，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.3 離體線粒體呼吸速率測(cè)定 Clark氧電極法測(cè)定腦組織離體線粒體的呼吸速率[15]。采用782 Oxygen System，分別校準(zhǔn)“100%氧”“0%氧”電極，校準(zhǔn)電極后向反應(yīng)池中加入線粒體呼吸緩沖液。待電極穩(wěn)定后加入各組標(biāo)定的線粒體50 μL，依次加入L-谷氨酸5 μL、L-蘋果酸5 μL以及ADP-Na2 5 μL，使總反應(yīng)體積為1 mL，觀察并記錄氧耗曲線。根據(jù)曲線斜率測(cè)量線粒體三態(tài)呼吸速率（State3 Respiration Rate，V3）、線粒體四態(tài)呼吸率（State4 Respiration Rate，V4）及線粒體氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation，ADP/O），按照如下公式計(jì)算呼吸控制速率（Respiration Control Rate，RCR）和氧化磷酸化速率（Oxidative Phosphorylation Rate，OPR）值：RCR=V3/V4，OPR=V3×ADP/O（nmol ATP/min/mg Protein）。

1.2.4.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）檢測(cè)腦組織中UCP-1、UCP-2表達(dá)水平 提取大鼠腦組織總蛋白。大鼠MCAO術(shù)后12 h，速取大腦組織，除去血管和腦膜用冰冷的PBS清洗2遍，稱重、于冰臺(tái)上剪碎至3 mm，用玻璃勻漿器冰浴勻漿，按質(zhì)量∶體積=1∶5的比例加入預(yù)冷的裂解緩沖液，置于冰上裂解30 min，將裂解完的組織進(jìn)行12 000×g，4 ℃離心20 min，收集上清液，置于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。采用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行蛋白分離。按試劑盒說(shuō)明書配制分離膠（10%）和積層膠（4%）。分別裝灌分離膠（10%）和積層膠，插入梳子。將待測(cè)樣品置于100 ℃水浴鍋煮沸、變性8 min，變性完成后進(jìn)行12 000×g，4 ℃離心10 min，離心后取出待測(cè)樣品，用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)樣品蛋白定量，將待測(cè)樣品蛋白的濃度調(diào)節(jié)一致。上樣蛋白Marker及待測(cè)樣品，每孔上樣量為40 μg蛋白。電泳。將目的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜后，用3%脫脂牛奶封閉1 h，TBST緩沖液洗膜3次，加入一抗（UCP-1，1∶1 000稀釋;UCP-2，1∶500稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST緩沖液洗膜3次后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，常溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次后，采用ECL法顯色，β-actin（1∶5 000稀釋）為內(nèi)參，采用Image Pro軟件測(cè)定各電泳條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞線粒體壓力測(cè)試 芪參顆粒組及甘草酸、綠原酸、丹酚酸B、黃芪甲苷組，細(xì)胞基礎(chǔ)呼吸值均高于對(duì)照組，且芪參顆粒100 μg/mL組更顯著，明顯提高細(xì)胞的基礎(chǔ)呼吸速率。注入FCCP后，甘草酸、綠原酸、黃芪甲苷組相較于對(duì)照組最大呼吸值提高，且綠原酸組更顯著。芪參顆粒組及甘草酸、綠原酸、黃芪甲苷組的ATP合成效率均高于模型組，其中芪參顆粒100 μg/mL組更顯著。相較于模型組，5個(gè)藥效成分組均提高了質(zhì)子漏水平，且丹酚酸B組和丹參酮ⅡA組更顯著。見表1。芪參顆粒及主要藥效成分作用于PC12細(xì)胞的呼吸曲線見圖1。

2.2 神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 大鼠行MCAO手術(shù)12 h后，與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表示MCAO手術(shù)復(fù)制成功且對(duì)大鼠神經(jīng)損傷明顯;與模型組比較，陽(yáng)性藥組及芪參顆粒高、中、低劑量組的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均明顯偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖2。

2.3 芪參顆粒對(duì)腦缺血大鼠線粒體呼吸的作用?? 在ADP/O的檢測(cè)中，陽(yáng)性藥組明顯高于模型組（P<0.01）;芪參顆粒高、中劑量組均明顯高于模型組（P<0.01），低劑量組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在RCR的檢測(cè)中，陽(yáng)性藥組明顯高于模型組（P<0.01）;芪參顆粒高劑量組高于模型組（P<0.05），芪參顆粒中、低劑量組相較于模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在OPR的檢測(cè)中，陽(yáng)性藥組明顯高于模型組（P<0.01）;芪參顆粒高、中、低劑量組明顯高于模型組（P<0.05）;在V3的檢測(cè)中，陽(yáng)性藥組以及芪參顆粒的高、中、低劑量組均明顯高于模型組（P<0.01）;在V4的檢測(cè)中，陽(yáng)性藥組明顯高于模型組（P<0.01）;芪參顆粒高、中、低劑量組均明顯高于模型組（P<0.01）。見圖3。

2.4 Western Blotting檢測(cè)線粒體功能相關(guān)UCP-1和UCP-2的表達(dá) UCP-1在模型組大鼠腦組織中高度表達(dá)（P<0.01）。與模型組比較，芪參顆粒高、中劑量組和陽(yáng)性藥組表達(dá)量下降幅度明顯（P<0.05）。見圖4。UCP-2在模型組大鼠腦組織中高度表達(dá)（P<0.01）;與模型組比較，陽(yáng)性藥組與芪參顆粒高劑量組UCP-2表達(dá)明顯下降（P<0.01），芪參顆粒中、低劑量組均無(wú)明顯下降。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SD大鼠行MCAO手術(shù)后，腦組織中UCP-1和UCP-2的表達(dá)明顯增加。而給予芪參顆粒治療后，UCP-1和UCP-2表達(dá)明顯下降。見圖5。

3 討論

Seahorse生物能量代謝分析儀作為目前生物體能量代謝的金標(biāo)準(zhǔn)，具有傳統(tǒng)方法不可比的高通量、多指標(biāo)同時(shí)精確定量的優(yōu)勢(shì)，適合用于中藥復(fù)方多組分體系研究。本研究采用Seahorse能量代謝分析儀建立了細(xì)胞水平線粒體能量代謝檢測(cè)方法，結(jié)果證明芪參顆粒及其主要藥效成分可明顯提升PC12神經(jīng)細(xì)胞在缺氧條件下的線粒體氧化磷酸化水平，提高細(xì)胞基礎(chǔ)呼吸值、最大呼吸能力、質(zhì)子漏以及ATP生成量，提示芪參顆粒及藥效成分可能通過(guò)改善線粒體呼吸功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝，進(jìn)而發(fā)揮抗缺氧的細(xì)胞保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)芪參顆粒及其主要藥效成分對(duì)線粒體氧化磷酸化的多種指標(biāo)表現(xiàn)不同程度的改善作用，為后續(xù)多成分協(xié)同作用研究提供了基礎(chǔ)。

本研究采用MCAO大鼠模型，研究芪參顆粒對(duì)腦缺血大鼠腦組織線粒體呼吸作用以及呼吸功能相關(guān)UCP-1、UCP-2表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相較于模型組，芪參顆粒高、中、低劑量組均可提高大鼠腦線粒體的三態(tài)、四態(tài)呼吸速率，而芪參顆粒高、中劑量組可提高氧化磷酸化效率，增加單位時(shí)間線粒體蛋白合成ATP的效率。提示芪參顆?？赡芡ㄟ^(guò)改善線粒體呼吸功能從而對(duì)腦缺血大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。有研究表明UCP在腦缺血中表達(dá)，并可能在線粒體能量代謝中發(fā)揮重要作用，UCP的過(guò)表達(dá)可以增加ATP的含量和ATP/ADP比例[16-17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠行MCAO手術(shù)后，腦組織中UCP-1和UCP-2表達(dá)明顯增加。可能是在腦缺血急性期，由于UCP的過(guò)表達(dá)而導(dǎo)致的能量增加對(duì)早期細(xì)胞應(yīng)對(duì)損傷是很有必要的保護(hù)手段[18]，以緩解缺血急性期缺血缺氧造成的嚴(yán)重能量供應(yīng)不足，與模型組比較，芪參顆粒各給藥組UCP-1的表達(dá)量均有明顯下降，而對(duì)于UCP-2，芪參顆粒高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照藥組的UCP-2的表達(dá)顯著性下降，芪參顆粒中、低劑量組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示芪參顆?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)UCP的表達(dá)來(lái)發(fā)揮線粒體呼吸保護(hù)作用，而對(duì)于UCP相關(guān)信號(hào)通路的干預(yù)作用，仍需要進(jìn)一步研究。

心腦血管病是一類嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，具有高病死率、高致殘率特征。中藥復(fù)方因其多組分、多靶點(diǎn)特點(diǎn)用于防治心腦血管疾病具有優(yōu)勢(shì)，與中醫(yī)認(rèn)為“心腦互為體用，共主神明”[19]，“腦心同治”的整體治療理念相契合?，F(xiàn)代研究也認(rèn)為心腦血管雖分屬于不同器官系統(tǒng)，但其存在相同的病理基礎(chǔ)，于心則為冠心病，于腦則發(fā)中風(fēng)，且高血壓、心律失常、心力衰竭、冠心病等心臟病變均可影響腦血管，誘發(fā)腦血管疾病并相互影響[20-21]，甚至有心源性腦缺血的說(shuō)法[22]。前期研究表明芪參顆粒對(duì)心力衰竭具良好療效，而本研究表明芪參顆粒可能通過(guò)改善線粒體能量代謝障礙而發(fā)揮抗缺血性中風(fēng)保護(hù)作用，這一特點(diǎn)符合中醫(yī)的“腦心同治”理論。靶向線粒體作為治療缺血性中風(fēng)的一種有前途的策略，中藥干預(yù)線粒體能量代謝研究，可為中藥新藥研發(fā)提供新思路。

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（2021-10-27收稿 本文編輯：王明）