高效液相色譜法測(cè)定檳榔中4種細(xì)胞毒性生物堿

黃 喜

（邵陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 邵陽(yáng) 422000）

檳榔為棕櫚科植物檳榔（Areca catechuL.）的干燥成熟種子，主要分布于我國(guó)南方及東南亞等地，收載于《中國(guó)藥典》，具殺蟲、消積、行氣、利水、截瘧等功效[1]。臨床用于治療肥胖癥、絳蟲病、小兒疳積、腹脹便秘、肝硬化腹水等疾病[1-2]。通過化學(xué)成分分析，已從檳榔中分離得到生物堿、鞣質(zhì)、黃酮、萜類等60多種不同類別化合物[2]。檳榔堿可興奮M-膽堿受體，有增加腸蠕動(dòng)、滅螺、驅(qū)蟲的作用[3]。檳榔次堿興奮M-膽堿受體，并結(jié)合腦部γ-氨基丁酸受體，阻斷神經(jīng)抑制作用，產(chǎn)生抗抑郁作用[4]。現(xiàn)代藥理研究表明，檳榔有多種毒性甚至細(xì)胞毒性，對(duì)人體的心血管、神經(jīng)、胃腸道、代謝、呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)有一定影響[5-7]。2003年國(guó)際癌癥研究中心（IARC）認(rèn)定檳榔為一級(jí)致癌物[8]，食用檳榔的人群患口腔癌的風(fēng)險(xiǎn)增加[9]。Marques在《柳葉刀腫瘤學(xué)》發(fā)表了檳榔堿致癌性主要評(píng)估結(jié)論，檳榔堿被定為2B類致癌物[10]。檳榔堿可誘導(dǎo)細(xì)胞程序性或非程序性死亡[11]，對(duì)PC12細(xì)胞具有神經(jīng)毒性作用[12]。檳榔堿是檳榔成癮性的主要成分，與嗎啡同用能增強(qiáng)嗎啡的成癮性[13]。檳榔能使雄性小鼠精子數(shù)目減少、活性降低，能抑制胚胎細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育[14]。

生物堿是檳榔毒性與藥效兼具的活性成分，其中檳榔堿、去甲檳榔堿、檳榔次堿和去甲檳榔次堿等4 種化合物占檳榔總生物堿90 %以上[15-16]，既是檳榔主要藥理活性物質(zhì)，也是檳榔主要毒性物質(zhì)。因此建立一種簡(jiǎn)單方便、科學(xué)經(jīng)濟(jì)的方法測(cè)定這4種物質(zhì)很有必要?！吨袊?guó)藥典》2020年版用高效液相色譜法測(cè)定檳榔中檳榔堿1種組分的含量[1]，其他文獻(xiàn)大多測(cè)定檳榔堿、檳榔次堿中1種或2種成分，鮮有同時(shí)測(cè)定4種生物堿含量的報(bào)道[17-18]，現(xiàn)有文獻(xiàn)均使用強(qiáng)陽(yáng)離子交換鍵合硅膠為填充劑（SCX-強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱），存在經(jīng)濟(jì)成本高、使用壽命短、維護(hù)保養(yǎng)難、重現(xiàn)性差等不足。本研究嘗試通過優(yōu)化樣品溶液制備方法與色譜系統(tǒng)，選擇實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的C18柱，同時(shí)測(cè)定檳榔堿、去甲檳榔堿、檳榔次堿和去甲檳榔次堿等4 種細(xì)胞毒性生物堿，以期為檳榔質(zhì)量控制提供更經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的技術(shù)方法。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀、自動(dòng)進(jìn)樣器、PDA檢測(cè)器（美國(guó)，沃特世公司）；ME204電子天平（瑞士，梅特勒-托利多）。

氫溴酸檳榔堿對(duì)照品、去甲檳榔堿對(duì)照品、檳榔次堿鹽酸鹽對(duì)照品、去甲檳榔次堿鹽酸鹽對(duì)照品（含量：≥98.0 %，成都瑞芬思生物科技有限公司）；甲醇（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)）；磷酸氫二銨、磷酸、氨水、甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；超純水由實(shí)驗(yàn)室自制。

檳榔樣品由湖南皇爺食品有限公司提供，產(chǎn)地為海南，采摘新鮮成熟果實(shí)，曬干，未經(jīng)其他工藝加工或炮制，共3批，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室鑒定均為棕櫚科植物檳榔。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05 mol/L磷酸氫二銨溶液（用1 % 磷酸溶液或氨試液調(diào)節(jié)pH值6.8～7.0）（63:37，v:v）; 流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取氫溴酸檳榔堿對(duì)照品37.56 mg（檳榔堿重量=氫溴酸檳榔堿重量/1.5214）、去甲檳榔堿對(duì)照品24.85 mg、檳榔次堿鹽酸鹽對(duì)照品31.36 mg（檳榔次堿重量=檳榔次堿鹽酸鹽重量/1.2583）、去甲檳榔次堿鹽酸鹽對(duì)照品32.26 mg（去甲檳榔次堿重量=去甲檳榔次堿鹽酸鹽重量/1.2868）置入25 ml量瓶，加甲醇適量超聲溶解，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液（4種組分質(zhì)量濃度各約為1 mg/ml）。精密量取貯備液0.1，0.5，1，2，5，10 ml，分別置入20 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度約為5，25，50，100，250，500 μg/ml的系列混合對(duì)照品工作溶液。

2.3 樣品溶液的制備

取樣品粉碎成細(xì)粉（過80目篩），稱取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液2 ml，輕輕搖勻，靜置15 min，使粉末充分浸潤(rùn)，加乙醚100 ml，加熱回流，調(diào)節(jié)溫度保持微沸1 h，取出，放冷，濾過，濾液置入加有1 % 磷酸溶液1 ml的蒸發(fā)皿；錐形瓶及殘?jiān)靡颐焉倭慷啻蜗礈欤喜⒁颐岩?，揮干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用0.25 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。在上述色譜條件下，色譜圖分別見圖1，峰形對(duì)稱，與其他組分能完全分離。

圖1 檳榔中4種生物堿HPLC色譜圖

2.4 線性范圍與檢測(cè)限

取系列混合對(duì)照品工作溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定4個(gè)組分的峰面積，以質(zhì)量濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表1。檳榔堿、去甲檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔次堿4種組分在濃度約為5～500 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R均大于0.999。以信噪比S/N=3計(jì)算檢出限，S/N=10計(jì)算定量限，4種組分線性范圍與檢測(cè)限見表1。

表1 4種生物堿線性范圍與檢測(cè)限（n=6）

2.5 加標(biāo)回收率

精密稱取已測(cè)定含量的檳榔樣品約0.5 g，精密加入濃度約為100 μg/ml的混合對(duì)照品溶液1 ml，按2.3項(xiàng)樣品溶液制備方法和2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，回收率%=（測(cè)得量-樣品中含量）÷標(biāo)準(zhǔn)加入量×100 %，平行測(cè)定6份，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，4種待測(cè)組分回收率均良好。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一份混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，以5次的峰面積計(jì)算RSD，結(jié)果檳榔堿、去甲檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔次堿的RSD分別為0.5 %，0.9 %，0.7 %，0.7 %（n=5），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份樣品溶液分別在制備后0，4，8，16，24，48 h進(jìn)樣，以峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果檳榔堿、去甲檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔次堿的RSD分別為1.0 %，1.1 %，2.0 %，1.9 %（n=6），表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 耐用性試驗(yàn)

保持2.1項(xiàng)下其他色譜條件不變，分別改變以下4個(gè)條件：（1）色譜柱分別選用Agilent ZORBAX C18、Waters SunFire C18、Shimadzu Inertsil ODS-SP C18；（2）流動(dòng)相中甲醇比例分別調(diào)節(jié)為57 %，60 %，63 %，66 %，69 %；（3）流動(dòng)相pH值分別調(diào)節(jié)為6.6，6.8，7.0，7.2；（4）柱溫分別設(shè)置為20，25，30，35，40 ℃。結(jié)果均有良好的重現(xiàn)性，峰形對(duì)稱，與其他組分能完全分離，表明色譜條件細(xì)微改變，該法均保持良好的耐用性。

2.9 樣品測(cè)定

取3批樣品，照2.3項(xiàng)樣品溶液制備方法和2.1項(xiàng)色譜條件，測(cè)定檳榔堿、去甲檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔次堿的含量，每批樣品平行測(cè)定3份，計(jì)算平均含量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，檳榔中生物堿成分主要是檳榔堿，約占所測(cè)4種組分總量的50 %。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

3.1.1 流動(dòng)相pH值選擇 用1 %磷酸溶液或氨試液分別調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值為4.0±0.05，5.0±0.05，6.0±0.05，6.5±0.05，7.0±0.05，7.5±0.05，8.0±0.05，8.2±0.05，其他色譜條件不變，用同一份混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣。結(jié)果pH值6.0～7.5時(shí)峰形良好；pH值6.0以下時(shí)，色譜峰出現(xiàn)拖尾；pH值越低，拖尾越嚴(yán)重。4種待測(cè)化合物分子結(jié)構(gòu)中均含有氫化吡啶環(huán)，顯弱堿性，強(qiáng)酸性條件下能接受質(zhì)子呈離子態(tài)；檳榔次堿與去甲檳榔次堿分子中含羧基，整體呈現(xiàn)酸堿兩性，在強(qiáng)堿性條件下失去質(zhì)子呈離子態(tài)；檳榔堿與去甲檳榔堿均含羧酸甲酯結(jié)構(gòu)，強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下，酯鍵容易斷裂呈羧酸根離子；同時(shí)考慮大部分色譜柱對(duì)pH值的耐受性，調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值6.8～7.0，在此條件下，色譜圖見圖1 A，4個(gè)組分色譜峰對(duì)稱因子均為0.95～1.05，保留時(shí)間5～16 min。

3.1.2 磷酸氫二銨濃度選擇 流動(dòng)相水相使用磷酸氫二銨溶液，并調(diào)節(jié)溶液pH值，起到緩沖作用，保持流動(dòng)相pH值穩(wěn)定。配制磷酸氫二銨濃度分別為0.001，0.005，0.01，0.03，0.05，0.08，0.1 mol/L，其他色譜條件不變，用同一份混合對(duì)照品溶液各進(jìn)樣10次。當(dāng)磷酸氫二銨濃度在0.01 mol/L以下時(shí)，各組分保留時(shí)間變化范圍較大，同一組份10次進(jìn)樣的保留時(shí)間漂移（保留時(shí)間最大值與最小值之差）超過0.5 min，10次保留時(shí)間RSD為1.5 %～4.0 %。當(dāng)濃度0.03 mol/L以上時(shí)各組分保留時(shí)間變化范圍較小，10次的保留時(shí)間漂移在0.3 min以內(nèi)，保留時(shí)間RSD在1.0 %以下。可見流動(dòng)相緩沖鹽濃度過低，緩沖作用減弱，色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性降低；同時(shí)考慮緩沖鹽濃度過高，容易析出鹽分堵塞液相色譜儀管路，因此選擇0.05 mol/L的磷酸氫二銨溶液。

3.2 樣品前處理方法研究

3.2.1 提取方法研究 方法（1）堿性乙醚提取法：按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，結(jié)果見圖1 B。方法（2）酸性水提取法：以稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.5的蒸餾水為溶劑回流提取，濾過，容器與濾渣用pH 3.5的蒸餾水分次洗滌，合并濾液與洗液，蒸至近干，用流動(dòng)相稀釋至25 ml，結(jié)果見圖1 C。由圖1可見，方法（1）提取的樣品其他組分較少，4種待測(cè)組分與其他成分完全分離，沒有干擾。方法（2）提取的樣品則有大量其他組分干擾，其中1號(hào)目標(biāo)峰（去甲檳榔次堿）與2號(hào)目標(biāo)峰（去甲檳榔堿）與其他組分不能完全分開，干擾嚴(yán)重。在酸性條件下，檳榔中大量水溶性成分被提取出來(lái)，干擾了待測(cè)成分準(zhǔn)確測(cè)定，但也提示，在進(jìn)一步進(jìn)行檳榔成分研究時(shí)，可參考酸性水提法。

3.2.2 加氨順序考察 試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)加氨試液順序?qū)悠分写郎y(cè)組分提取效果有較大影響，因此考察兩種方法：方法（1）先加氨法：樣品先加適量氨試液，充分浸潤(rùn)后，后加乙醚回流提取，即2.3項(xiàng)下方法。方法（2）后加氨法：樣品先加乙醚，后加氨試液，其余同2.3項(xiàng)下。取同一批樣品共10份，其中5份按方法（1）制備，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各組分含量平均值及RSD；另5份按方法（2）制備，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各組分含量平均值及RSD，結(jié)果見表4。樣品4種組分平均含量方法（1）明顯高于方法（2），且RSD較低；進(jìn)行F檢驗(yàn)（α=0.05），結(jié)果均存在顯著性差異。可見先加堿充分浸潤(rùn)樣品粉末，有助于乙醚將待測(cè)組分從植物組織中提取出來(lái)。

表4 兩種方法提取結(jié)果

3.2.3 回流時(shí)間考察 回流時(shí)間分別為15，30，45，60，90，120 min，其余按2.3項(xiàng)下方法，取同一批樣品，每個(gè)時(shí)間段平行測(cè)定3份樣品，以3份樣品含量的平均值為縱坐標(biāo)，回流時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制曲線圖，見圖2。從圖2可見，回流60 min，4種組分基本提取完全。

圖2 檳榔中4種生物堿回流提取結(jié)果

綜上，本文建立的檳榔中細(xì)胞毒性生物堿提取和含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單快速，定量準(zhǔn)確，可同時(shí)測(cè)定檳榔中檳榔堿、去甲檳榔堿、檳榔次堿和去甲檳榔次堿等4種細(xì)胞毒性生物堿的含量，可用于檳榔質(zhì)量控制，提高檳榔安全性；使用常規(guī)C18色譜柱，可減輕企業(yè)負(fù)擔(dān)，提高經(jīng)濟(jì)效益。