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    黨參中多糖和5種化學(xué)成分的相關(guān)性研究

    2022-06-01 07:17:46陳曉虎
    食品與藥品 2022年3期
    關(guān)鍵詞:紫丁香色氨酸黨參

    任 月,陳曉虎,張 毅,

    (1. 成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,四川 成都 611137;2. 重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院,重慶市藥物過(guò)程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心,重慶 401121)

    黨參為桔??浦参稂h參Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf.、素花黨參Codonopsis pilosulaNannf. var.modesta(Nannf.) L. T. Shen和川黨參Codonopsis tangshenOliv.的干燥根,具有健脾益肺、養(yǎng)血生津的功效,主要用于脾肺氣虛、咳嗽虛喘、氣血不足等癥[1],是大宗常用的傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥,常用作人參替代品。研究表明,黨參富含多種成分,包括多糖、苯丙素、生物堿、聚乙炔醇和酚酸等[2-4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,黨參有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)血脂或血糖等多種作用?!吨袊?guó)藥典》2020年版一部及各省、市、區(qū)的地方標(biāo)準(zhǔn)中,僅收載有性狀、顯微特征、薄層鑒別、水分、灰分、浸出物等非特異性項(xiàng)目,并未在化學(xué)成分的基礎(chǔ)上對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行有效控制。而黨參質(zhì)量的安全性、有效性是其臨床應(yīng)用的有效保障,黨參有效成分及含量的測(cè)定是制定質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的重要指標(biāo)[5]。近年,張麗芬等[6]采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定黨參中黨參多糖和黨參炔苷的含量;貢東軍等[7]采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測(cè)定黨參中黨參內(nèi)酯和蒼術(shù)內(nèi)酯III的含量;關(guān)琳靜[8]通過(guò)黨參HPLC特征圖譜研究,測(cè)定不同來(lái)源黨參成分含量,進(jìn)行總體定性分析;陳娟等[9]采用HPLC測(cè)定黨參中3種成分含量??傮w而言,黨參藥效顯著,但成分復(fù)雜,活性指標(biāo)成分不清楚?;瘜W(xué)成分含量測(cè)定較為單一,難以全面評(píng)價(jià)黨參的內(nèi)在質(zhì)量。研究表明,多糖類成分是抗衰老、抗腫瘤的主要藥效成分,主要通過(guò)提高抗氧化酶活性或清除有機(jī)體內(nèi)的自由基發(fā)揮作用。黨參多糖是黨參補(bǔ)脾作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[10-12];腺苷被認(rèn)為是補(bǔ)益類中藥共有的物質(zhì)基礎(chǔ),參與代謝過(guò)程,是生物細(xì)胞維持生命活動(dòng)的重要元素[13];紫丁香苷作為指標(biāo)性成分可鑒定紋黨參和白條黨參[14];黨參炔苷對(duì)乙醇所致的胃黏膜損傷有較好的保護(hù)作用[15]。因此,本文通過(guò)比色法建立黨參多糖含量測(cè)定方法,通過(guò)色譜法建立黨參中腺苷、色氨酸、紫丁香苷、綠原酸、黨參炔苷等5種成分的含量測(cè)定方法,對(duì)同一來(lái)源相同時(shí)間采集的黨參樣本進(jìn)行初步對(duì)比分析研究,探索黨參化學(xué)成分與黨參多糖是否具有相關(guān)性,為后續(xù)黨參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高及質(zhì)量控制提供參考。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    e2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司),HP8453E型紫外-可見分光光度計(jì)(HP公司);AX-205電子天平(梅特勒公司);恒溫水浴鍋(上海精密公司)。

    1.2 試藥

    腺苷(批號(hào):110879-201703,含量:99.7 %)、色氨酸(批號(hào):140624-201506,含量:99.9 %)、紫丁香苷(批號(hào):111574-201504,含量:94.9 %)、綠原酸(批號(hào):111574-201504,含量:96.2 %)、黨參炔苷(批號(hào):111732-201607,含量:96.6 %)、無(wú)水葡萄糖(批號(hào):110833-201908,含量:99.8 %)對(duì)照品均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇為色譜醇(安徽時(shí)聯(lián)特種溶液股份有限公司),濃硫酸為分析純(重慶川東化工有限公司),水由Milli-Q系統(tǒng)(美國(guó)密理博公司)制備。

    20批黨參樣品采集自山西壺關(guān),經(jīng)重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院中藥室張毅副主任中藥師鑒定為桔??浦参稂h參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.的干燥根。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 多糖含量測(cè)定

    2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取葡萄糖對(duì)照品適量,加水制成0.1 mg/ml葡萄糖溶液,分別精密量取0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 ml,加水至2.0 ml,加入5 %苯酚溶液1.0 ml后搖勻,迅速精密加入濃硫酸5.0 ml并搖勻,置水浴中加熱15 min,取出,立即冷卻至室溫,以相應(yīng)試劑為空白。用紫外-可見分光光度法于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖在10.2~102.1 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?;貧w方程為A=7.2708X-0.0055,相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。

    2.1.2 供試品溶液的制備 取黨參細(xì)粉約0.2 g,精密稱定后,精密加入體積分?jǐn)?shù)為80 %乙醇50 ml回流提取2 h,濾過(guò),殘?jiān)?0 %乙醇熱洗滌后加水60 ml,水浴加熱回流2 h,趁熱過(guò)濾,殘?jiān)盁坑脽崴?0 ml洗滌,分3次洗滌,洗液并入濾液,濃縮至適量,放冷,移入100 ml量瓶,加水定容后搖勻,精密量取供試品溶液0.2 ml,加水至2.0 ml搖勻,加入5 %苯酚溶液1.0 ml搖勻后,迅速精密加入濃硫酸5.0 ml并搖勻,置水浴中加熱15 min后,取出,立即冷卻至室溫,即得。

    2.1.3 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液,于490 nm波長(zhǎng)處重復(fù)測(cè)定6次吸光度,RSD為0.69 %,結(jié)果表明,儀器的精密度良好。

    2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一黨參樣品,按2.1.2項(xiàng)法制備供試品溶液,分別于0,0.5,1,2,3,4 h于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。其RSD為2.71 %,結(jié)果表明,黨參樣品在4 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

    2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一黨參樣品6份,按2.1.2項(xiàng)法制備供試品溶液,分別于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度,其RSD為1.35 %,結(jié)果表明,供試品重復(fù)性良好。

    2.1.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的供試品0.1 g,共6份,分別稱取葡萄糖對(duì)照品約18 mg,按2.1.2項(xiàng)法制備供試品溶液,于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度,計(jì)算平均回收率,結(jié)果見表1。

    表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

    2.1.7 樣品多糖含量測(cè)定 取本品細(xì)粉約0.2 g,按2.1.2項(xiàng)法制備供試品溶液,于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知多糖濃度,計(jì)算,即得,結(jié)果見表5。

    2.2 黨參中5種成分含量測(cè)定

    2.2.1 色譜條件 色譜柱Agilent SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)214,218,257 nm,流動(dòng)相:A相為乙腈溶液,B相為0.1 %磷酸水溶液;梯度洗脫見表2;流速:1 ml/min;進(jìn)樣量:20 μl。

    表2 梯度洗脫程序

    2.2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取對(duì)照品腺苷20.22 mg、色氨酸20.22 mg、紫丁香苷18.74 mg、綠原酸9.88 mg和黨參炔苷9.14 mg,用50 %甲醇制成質(zhì)量濃度分別為2.016,2.078,1.778,0.950,0.883 mg/ml單一成分對(duì)照品儲(chǔ)備液。

    2.2.3 供試品溶液制備 精密稱取黨參粉末約1 g,置具塞錐形瓶中,精密加入50 %甲醇25 ml,密塞,稱定重量,超聲處理60 min,放冷,再稱定重量,用50 %甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

    2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取腺苷、色氨酸、紫丁香苷、綠原酸和黨參炔苷各單一成分對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0,1.0,0.2,1.0,4.0 ml,置入同一20 ml量瓶,搖勻,作為混合對(duì)照品溶液。

    2.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液及黨參供試品溶液,分別進(jìn)樣,記錄色譜圖,見圖1。

    圖1 黨參混合對(duì)照品(A)和黨參供試品溶液(B)的HPLC色譜圖

    2.2.6 線性考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.1,0.2,0.4,0.5,1,2,5 ml,置入10 ml量瓶,加入50 %甲醇溶液定容,制成系列對(duì)照品溶液。吸取上述對(duì)照品溶液,按2.2.1項(xiàng)法測(cè)定5個(gè)化學(xué)成分的峰面積。以所測(cè)成分質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo),色氨酸、紫丁香苷、綠原酸和黨參炔苷的峰面積Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程,結(jié)果見表3。

    表3 5種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

    2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密稱取同一黨參樣品,按2.2.3項(xiàng)法制備供試品溶液,按2.2.1項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次,結(jié)果表明,腺苷、色氨酸、紫丁香苷、綠原酸和黨參炔苷的峰面積的RSD值分別為0.61 %,0.15 %,0.29 %,0.26 %,0.32 %,均小于1.0 %,表明精密度良好。

    2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一黨參樣品6份,按2.2.3項(xiàng)法制備供試品溶液,按2.2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定,結(jié)果表明,腺苷、色氨酸、紫丁香苷、綠原酸和黨參炔苷的RSD分別為2.54 %,0.17 %,1.23 %,1.91 %,0.53 %,均小于2.5 %,表明方法重復(fù)性較好。

    2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一黨參樣品,按2.2.3項(xiàng)法制備供試品溶液,分別于制備后0,2,4,8,12,24 h按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明,腺苷、色氨酸、紫丁香苷、綠原酸和黨參炔苷峰面積的RSD分別為2.60 %,2.13 %,2.00 %,1.06 %,0.30 %,表明黨參樣品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

    2.2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的黨參樣品粉末約0.5 g,共6份,精密稱定,分別置入具塞錐形瓶,精密加入0.0645 mg/ml腺苷對(duì)照品溶液1.5 ml,0.1293 mg/ml色氨酸對(duì)照品溶液1.0 ml,0.0213 mg/ml紫丁香苷對(duì)照品溶液0.5 ml,0.0570 mg/ml綠原酸對(duì)照品溶液1.0 ml,0.3973 mg/ml黨參炔苷對(duì)照品溶液1.0 ml和50 %甲醇20 ml,按2.2.3項(xiàng)法制備供試品后進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

    表4 5種化合物的加樣回收率(n=6)

    2.2.11 黨參5種成分含量測(cè)定 取本品細(xì)粉約1 g,按2.2.3項(xiàng)法制備供試品溶液,按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見表5。通過(guò)構(gòu)建相關(guān)性系數(shù)圖,以相關(guān)性系數(shù)為指標(biāo),其絕對(duì)值越接近1,相關(guān)性越強(qiáng)。多糖含量與5種化學(xué)成分含量的相關(guān)性系數(shù)圖見圖2。由圖2可見,黨參腺苷、色氨酸、紫丁香苷、綠原酸和黨參炔苷5個(gè)成分與黨參多糖的相關(guān)性系數(shù)分別為-0.153,-0.024,-0.141,-0.178,-0.145,因此不具明顯相關(guān)性。

    表5 含量測(cè)定結(jié)果/mg·g-1

    圖2 黨參中多糖和5種化學(xué)成分的相關(guān)性系數(shù)圖

    3 討論

    3.1 多糖前處理考察

    3.1.1 醇除雜考察 取黨參藥材約0.2 g,精密稱定,置入錐形瓶,用80 %乙醇加熱回流提取2 h,取提取液,蒸干,用適量水溶解,濾過(guò)至100 ml量瓶,定容,精密量取濾過(guò)液0.2 ml,加水至2 ml。分別加5 %苯酚溶液1.0 ml,搖勻,迅速精密加入濃硫酸5.0 ml后搖勻,置水浴中加熱15 min,取出,立即冷卻到室溫,進(jìn)行測(cè)定,吸光度值為0,表明該除雜方法可行。

    3.1.2 提取考察 通過(guò)考察加水量60,80,100 ml,水浴時(shí)間1,2,3 h等,對(duì)提取進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,對(duì)比60 ml溶劑提取與80 ml溶劑提取相比結(jié)果,多糖含量在增加提取液后并無(wú)明顯變化;每次提取1 h與2 h相比較,多糖含量增加并不明顯。因此,從節(jié)約成本及時(shí)間角度考慮,用水60 ml,每次提取2 h即可。

    3.2 黨參炔苷前處理考察

    對(duì)于多組分分析,合適的檢測(cè)波長(zhǎng)是重要的參數(shù)[16]。采用波長(zhǎng)范圍為200~400 nm的紫外檢測(cè)器對(duì)黨參中5種成分進(jìn)行掃描,結(jié)果腺苷在257 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,色氨酸在218,278 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,紫丁香苷在219,264 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,綠原酸在218,325 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,黨參炔苷在214,267,283 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,因此選擇腺苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為257 nm,色氨酸、紫丁香苷、綠原酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為218 nm,黨參炔苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。通過(guò)5種成分的分離度、峰形、基線等方面對(duì)不同流動(dòng)相體系,如甲醇~水、甲醇~0.1 %磷酸水溶液、乙腈~水、乙腈~0.1 %磷酸水溶液進(jìn)行考察,結(jié)果在乙腈~0.1 %磷酸水溶液時(shí)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí),黨參中5種化學(xué)成分峰形、分離度較好,因此,選擇乙腈~0.1% 磷酸水溶液作為流動(dòng)相。根據(jù)黨參5種化學(xué)成分的溶出情況,對(duì)不同提取方式,如超聲、回流等;對(duì)不同提取溶劑,如50 %甲醇、75 %乙醇、甲醇等;對(duì)不同提取時(shí)間,如30,60,90 min等進(jìn)行單因素考察,結(jié)果表明,采用50 %甲醇超聲60 min處理樣品時(shí),5種成分的溶出情況最好,因此,選擇50 %甲醇超聲60 min處理樣品。

    3.3 方法評(píng)價(jià)

    本研究采用硫酸-苯酚比色法建立黨參中多糖含量的測(cè)定方法,采用HPLC法建立黨參中腺苷、色氨酸、紫丁香苷、綠原酸和黨參炔苷5種化學(xué)成分的測(cè)定方法,并對(duì)兩種方法進(jìn)行方法學(xué)考察,包括重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性、加樣回收等。比色法操作簡(jiǎn)便、成本低廉;色譜法分離度好,準(zhǔn)確性高,多種方法同時(shí)測(cè)定黨參質(zhì)量,建立中藥整體質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),為黨參質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。同時(shí),采集山西壺關(guān)20批黨參藥材并測(cè)定其黨參多糖和黨參中特異性成分腺苷、色氨酸、紫丁香苷、綠原酸、黨參炔苷的含量,根據(jù)相關(guān)性系數(shù)圖,甘肅壺關(guān)黨參中5種化學(xué)成分與黨參多糖含量不呈現(xiàn)明顯相關(guān)性。由此可知,評(píng)價(jià)黨參質(zhì)量的優(yōu)劣不應(yīng)僅從單一方面進(jìn)行考察,其質(zhì)量控制不能僅限于一兩種成分,多維度多成分對(duì)黨參進(jìn)行定性定量等質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)尤為重要,黨參內(nèi)在質(zhì)量關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

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