老年大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞分選新方法及功能特征觀察*

張雨彤，趙 欣，尹藝儒，吳淑芬，張利娜，杜相欣，張 宇

(山西醫(yī)科大學生理學系 細胞生理學教育部重點實驗室，太原030001)

隨年齡增長，個體生存及整體功能下降的過程稱為衰老[1]。在衰老過程中，人體對內(nèi)外環(huán)境適應能力逐漸減退，大腦的結構和功能逐漸老化，導致認知障礙、抑郁和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率增加。

小膠質(zhì)細胞是神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的一種，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，參與神經(jīng)元凋亡、突觸發(fā)生和突觸剪枝，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育所必需。小膠質(zhì)細胞還是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)固有的免疫細胞，通過其分支監(jiān)控神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境[2-4]，吞噬清除病原體和細胞碎片，維持突觸穩(wěn)態(tài)，調(diào)控突觸可塑性，維持大腦正常的結構和功能[5]。當神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生炎癥、感染或創(chuàng)傷時，小膠質(zhì)細胞可迅速激活，參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展[6，7]。作為神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)固有的免疫細胞，小膠質(zhì)細胞參與衰老的具體機制尚未完全闡明。

小膠質(zhì)細胞的研究對象包括細胞系(小鼠小膠質(zhì)細胞(BV-2)和大鼠小膠質(zhì)細胞(HAPI))或乳鼠原代分離培養(yǎng)的細胞。細胞系的主要優(yōu)勢在于有較強的增殖能力、易培養(yǎng)易操作，但細胞系的永生化可能會顯著影響細胞特性，改變細胞生理功能。原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞與細胞系相比，其功能更接近生理狀態(tài)，但原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞來源于剛出生、尚未發(fā)育成熟的乳鼠，因此原代小膠質(zhì)細胞雖然更接近正常細胞，但因沒有經(jīng)歷成熟過程，并不能完全反映正常成熟甚至衰老細胞的功能。

小膠質(zhì)細胞分離純化方法很多，但各種方法操作步驟上有很大的差異，而且分選出的細胞純度、數(shù)目及細胞活性的差異明顯，但普遍都存在不足之處。如流式細胞術需要的設備昂貴，所需的專業(yè)技能要求高；免疫磁珠分選雖然操作簡單、分選出的細胞純度高，但是由于試劑昂貴，所以如果大量分離細胞以用于實驗，所需成本太高。雖然從大鼠神經(jīng)系統(tǒng)中分離小膠質(zhì)細胞的方法已經(jīng)比較成熟，但由于老年大鼠小膠質(zhì)細胞較為脆弱，所以如何從老年大鼠脊髓組織中獲得小膠質(zhì)細胞仍然存在較大困難。因此，本研究旨在建立一種分選高純度、高活性老年大鼠小膠質(zhì)細胞的實驗方法，并以此為基礎初步觀察脊髓小膠質(zhì)細胞的老化特征。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗分組：年輕組(2月齡雄性SD大鼠)與老年組(20月齡雄性SD大鼠)。

大鼠均購自山西醫(yī)科大學動物實驗中心。飼養(yǎng)于SPF級動物房，每籠2只，環(huán)境溫度20℃～22℃，濕度50%，晝夜明暗交替時間為12 h/12 h。所有動物自由進食和水。所有動物實驗及處理均經(jīng)山西醫(yī)科大學倫理委員會審核批準。

1.2 主要試劑和儀器

Percoll(Solarbio)、胰酶替代物(gibico)、DMEM/F12培養(yǎng)基(Boster)、青鏈霉素混合液(Solarbio)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS，Boster)、HBSS(Boster)、10×HBSS(Solarbio)、多聚賴氨酸(sigma)、Iba1抗體(sigma)、4%多聚甲醛溶液(Boster)、TritonX-100(Solarbio)、0.4%臺盼藍(Solarbio)、DNA酶Ⅰ(Solarbio)，柱式動物組織總RNA抽提純化試劑盒(Solarbio)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TAKARA)，TB Green? Premix Ex TapTM II(Tli RNaseH Plus)(TAKARA)。24孔培養(yǎng)皿(NEST)、100 μm濾網(wǎng)、恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱和超凈工作臺(Thermo)、倒置相差光學顯微鏡(Olympus)、熒光倒置顯微鏡(Olympus)、高速自動平衡離心機(Eppendorf)、基因擴增儀(BIO-GENER)、LightCycler 96 Instrument(ABI)。

1.3 Percoll密度梯度離心法分離純化大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞

1.3.1 制備脊髓組織單細胞懸液 取大鼠麻醉后斷頭，置于冰上剪開背部皮膚，用止血鉗分離脊椎暴露脊髓組織，取出全部脊髓組織用冷的PBS沖洗3次以清洗血液，之后轉移至超凈臺中，在冰上剝膜。

胰酶及胰酶替代物制備細胞懸液：用刀片將組織切碎至約1 mm3，加入0.125%胰酶(PBS稀釋)或50%胰酶替代物(PBS稀釋)，輕輕吹打10次左右，置于37℃水浴鍋內(nèi)恒溫消化20 min(期間吹打3次)，消化后可見組織變白呈絮狀。加入5 ml無血清培養(yǎng)基(DMEM/F12+0.1%雙抗)終止消化，加入0.5 ml的DNA酶Ⅰ，用1 ml移液槍將組織輕輕吹散，100 μm濾網(wǎng)過濾至50 ml離心管中。1 500 r/min 離心5 min，棄去上清。

機械網(wǎng)搓法制備細胞懸液：將組織剪碎放在100 μm 濾網(wǎng)上用小鑷子輕搓組織塊，邊搓邊用PBS沖洗，直至組織搓完。500 g 離心5 min，棄去上清。

1.3.2 Percoll分離液配置 用9份 Percoll 原液和1份10×D-Hanks溶液充分混合配制成SIP Percoll混合液，達到生理滲透壓后用DMEM/F12稀釋成30%SIP Percoll分離液，1×D-Hanks稀釋成70%SIP Percoll分離液。

1.3.3 密度梯度法分離純化小膠質(zhì)細胞 細胞懸液離心后所得沉淀用30%SIP Percoll分離液重懸，在其下用注射器緩慢加入70%SIP Percoll分離液(緩慢加入避免破壞分層)，1 900 r/min 離心30 min后可見分層，去除上層白色髓鞘，小心吸取出30%與70% SIP Percoll分離液之間的霧狀小膠質(zhì)細胞層，加入兩倍體積的PBS混勻，1 500 r/min 離心5 min，去除上清，收集細胞。細胞可用于后續(xù)實驗。如需培養(yǎng)，可將細胞重懸于2 ml的無血清培養(yǎng)基中，接種于預先鋪好0.1 mg/ml多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板上，置于恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育(圖1)。

Fig. 1 Sorting process of rat spinal cord microglia

1.4 細胞存活率及數(shù)量檢測

將分選出的小膠質(zhì)細胞懸液與0.4%臺盼藍以9∶1混合均勻，靜置染色3 min，取20 μl滴到血細胞計數(shù)儀中。藍色細胞為死細胞，未染色且折光性較強的細胞為小膠質(zhì)細胞。對細胞進行計數(shù)，每次檢測4個視野，取平均值，計算出活細胞數(shù)與總細胞數(shù)。細胞存活率 (%) = 活細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100。

1.5 細胞免疫熒光鑒定及純度分析

小膠質(zhì)細胞貼壁培養(yǎng)48 h后，吸出培養(yǎng)基，37℃PBS清洗3次。室溫下，4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次，破膜(0.5% TritonX-100+PBS)15 min，封閉(1%BSA+0.1% TritonX-100+PBS)30 min，一抗Iba1(兔抗大鼠、abcam)以1∶1 000 PBS稀釋后4℃孵育過夜，室溫恢復1 h后用PBS清洗3次。二抗(驢抗兔、abcam)以1∶500 PBS稀釋后室溫孵育1 h，PBS清洗3次，DAPI孵育10 min，PBS清洗3次后在熒光倒置顯微鏡下觀察、拍照。紅色為Iba1標記的小膠質(zhì)細胞，藍色為DAPI標記的細胞核。小膠質(zhì)細胞純度(%) = Iba1標記陽性細胞數(shù)/DAPI標記陽性細胞數(shù)×100%。

1.6 細胞因子檢測

實時熒光定量PCR檢測促炎因子IL-1β與抗炎因子IL-10表達水平。將分選所得小膠質(zhì)細胞加入250 μl中的Buffer Rlysis-AG，按柱式動物組織總RNA抽提純化試劑盒說明書進行RNA提取。將提取出的RNA按TaKaRa試劑盒說明書去除基因組(42℃、2 min)后反轉錄為cDNA(37℃、15 min，85℃、5 s)。按TaKaRa試劑盒說明書進行擴增反應(表1)，兩步法RT-PCR擴增標準程序：(1)預變性：95℃、30 s ；(2)PCR反應：95℃、5 s，60℃、30～40 s；40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件LC 96分析，采用2-ΔΔCt法計算IL-1β與IL-10基因相對表達量。

Tab. 1 Primer sequences

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 不同單細胞懸液制備方式對脊髓小膠質(zhì)細胞分選效果比較

我們比較了胰酶、胰酶替代物及機械網(wǎng)搓法的分選效果。消化液的濃度分別為：胰酶0.125%、胰酶替代物50%。消化之前均將組織切碎至約1 mm3，在37℃下消化20 min，通過100 μm濾網(wǎng)過程中要保持輕柔，避免用力過猛損傷細胞；機械網(wǎng)搓法分散組織應注意，在100 μm濾網(wǎng)上搓組織時動作輕柔且迅速，而且要多次用PBS沖洗濾網(wǎng)；對最終分選出小膠質(zhì)細胞存活率進行觀察，結果發(fā)現(xiàn)，胰酶消化所得細胞的存活率最低；機械網(wǎng)搓法得到的存活率較高，但是細胞獲取率最低；胰酶替代物可顯著提高細胞獲取率及細胞存活率，尤其適合于老年大鼠，分離效果最好(表2)。

Tab. 2 The effects of different treatment on n=3)

2.2 不同年齡大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞分選的數(shù)量及存活率比較

采用胰酶替代物解離結合密度梯度離心法進行分選，結果發(fā)現(xiàn)不同年齡大鼠脊髓組織分選出的小膠質(zhì)細胞數(shù)量不同。老年大鼠脊髓組織體積大，分選出的小膠質(zhì)細胞數(shù)目較多，每只老年大鼠脊髓組織大約可分選出(2.570±0.113)×106個細胞，每只年輕大鼠脊髓組織大約可分選出(0.927±0.049)×106個細胞。采用臺盼藍染色檢測分選出的小膠質(zhì)細胞的存活率發(fā)現(xiàn)，年輕大鼠和老年大鼠的細胞存活率均可達到95%以上，小膠質(zhì)細胞的純度均可達到85%以上(表3)。

Tab. 3 Comparison of isolated spinal cord microglia number,survival rate and n=3)

2.3 不同年齡大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞分選條件比較

在細胞分選的過程中發(fā)現(xiàn)，為達到最好的分選效果，即較多的細胞量和較高的存活率，不同年齡大鼠脊髓組織在制備單細胞懸液的實驗條件需有所差異。消化液中胰酶替代物的濃度保持一致，均為50%；年輕大鼠脊髓組織量較老年大鼠小，消化液體積需少于老年大鼠，但消化時間老年大鼠較年輕大鼠縮短(表4)。

Tab. 4 Comparison of digestive process in rat spinal cord

2.4 不同年齡大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞的形態(tài)比較

小膠質(zhì)細胞可通過檢測Iba1(電離鈣結合蛋白)的表達來進行標記。將70%-30% SIP percoll之間的界面分離出的細胞在體外培養(yǎng)48 h后，采用Iba1抗體進行熒光標記，結果發(fā)現(xiàn)，與年輕大鼠相比，老年大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞胞體較大較圓，突起較少且粗短，Iba1熒光信號較強，形態(tài)上更偏向于激活狀態(tài)(圖2)。

Fig. 2 Immunofluorescence staining of rat isolated spinal cord microglia(×200)

2.5 不同年齡大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞炎癥因子表達

對不同年齡大鼠脊髓組織分選出的小膠質(zhì)細胞進行熒光定量PCR分析，結果發(fā)現(xiàn)，與年輕大鼠相比，老年大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞促炎因子IL-1β表達降低(P<0.05)，而抗炎因子IL-10表達升高(P<0.05，表5)。

Tab. 5 Inflammatory cytokines mRNA levels of isolated spinal cord n=3)

3 討論

本研究選取老年大鼠，采用胰酶替代物解離的方法制備脊髓組織單細胞懸液，采用Percoll密度梯度離心法分選小膠質(zhì)細胞，得到活性好、純度高的細胞，進行老年大鼠神經(jīng)組織小膠質(zhì)細胞分選方法的改良。成年大鼠小膠質(zhì)細胞的分選，彌補了細胞系或乳鼠來源原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞不能觀察衰老小膠質(zhì)細胞功能特征的局限性。

胰酶替代物解離脊髓組織分選出的小膠質(zhì)細胞細胞活性好，純度高。以往的研究方案多采用胰酶或木瓜蛋白酶進行組織消化[6,8,9]。然而，有報道稱消化酶處理對活細胞有輕微的毒性作用，影響細胞活力。除此之外，消化酶處理會破壞細胞表面結構，可能會干擾之后的應用[7,10,11]。胰酶替代物是非動物源性的細胞解離試劑，對細胞損傷更??；胰酶替代物可以穩(wěn)定的保存于室溫，便于儲存及使用；胰酶替代物不需要含血清的抑制劑終止消化，直接用 PBS 稀釋終止消化即可。這樣避免了與血清的直接接觸，血清中的復雜成分也不會干擾小膠質(zhì)細胞的生理功能，改變其功能狀態(tài)。

木瓜蛋白酶或胰蛋白酶消化獲得的細胞狀態(tài)不好，存活時間短，不能滿足實驗需要，而且血清來源的消化酶易對細胞產(chǎn)生刺激，使細胞離體時與在體狀態(tài)不同。而機械剪切獲得的細胞雖狀態(tài)好，但由于解離不夠徹底，獲得的細胞量少，不能滿足后續(xù)實驗需要，所以我們利用胰酶替代物代替木瓜蛋白酶或胰蛋白酶進行組織細胞解離，可以保護細胞表面標記物免受損傷，并增加細胞活力，還可以降低血清成分對小膠質(zhì)細胞可能產(chǎn)生的免疫激活反應，更好地保持細胞的正常功能狀態(tài)。

Percoll是一種經(jīng)聚乙烯吡喀烷酮處理的硅膠顆粒，分離液滲透性低、不易穿透細胞、無毒性作用，是比較理想的分離介質(zhì)。Percoll密度梯度離心法已被成功運用到多種細胞及細胞器的分離實驗中[12,13]。Cardona等人使用70% - 37% - 30% SIP從神經(jīng)組織的單細胞懸液中分離小膠質(zhì)細胞[8]。我們采用70% - 30% SIP分離脊髓組織中的小膠質(zhì)細胞。采用密度梯度離心法分選細胞無需使用熒光抗體或磁珠，也可避免抗體結合引起的小膠質(zhì)細胞細胞激活風險[14]。

為取得活性較好的細胞，在組織細胞解離和細胞分選過程中應特別注意：(1)在處死動物后，脊髓組織必須一直置于冰冷的環(huán)境中，以減緩離體神經(jīng)組織的液化情況；(2)取出的脊髓組織應盡量將血液清洗干凈，避免血細胞以及血液中的免疫物質(zhì)對后續(xù)實驗的影響；將脊膜分離干凈，以免影響單細胞分離；(3)在組織的機械性分離過程中，最好將組織切碎至1 mm3，組織塊過大會使得消化過程不完全，太小會造成細胞損失過多，細胞狀態(tài)不好；(4)細胞解離后用培養(yǎng)基終止消化，避免消化過度，吹打過程要輕柔，注意不要產(chǎn)生氣泡；(5)在30% SIP Percoll下加入70% SIP Percoll時要注意不要破壞分層；(6)確保離心機緩慢降速，避免破壞細胞分層。

本研究成功分選成年大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞，而老年大鼠和年輕大鼠的細胞分選所需實驗條件也并非完全相同。我們比較老年大鼠和年輕大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞分選條件的差異，與年輕大鼠相比，老年大鼠組織量更大，需要更多消化液，但由于老年細胞較為脆弱，需要適當?shù)目s短解離時間以提高細胞存活率，同時在解離時結合多次輕柔機械吹打，可提高小膠質(zhì)細胞的獲取率。根據(jù)我們優(yōu)化后的實驗方法，分選出的脊髓小膠質(zhì)細胞還可在無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d，保持細胞正常功能狀態(tài)，可進行其他相關實驗。

本研究從年輕和老年大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)中取材，避免了乳鼠小膠質(zhì)細胞還未發(fā)育成熟對實驗帶來的影響，有助于觀察衰老過程中脊髓小膠質(zhì)細胞形態(tài)及功能的變化。自然衰老進程中機體內(nèi)呈現(xiàn)出促炎癥反應狀態(tài)緩慢進行性增高，這種現(xiàn)象被稱為炎性衰老(inflammaging)[15]。其原因在于促炎因子和抗炎因子之間的動態(tài)平衡被打破。小膠質(zhì)細胞是神經(jīng)系統(tǒng)固有的免疫效應細胞，可分泌各種炎性因子，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的炎癥狀態(tài)。我們比較年輕大鼠和老年大鼠脊髓組織分選出的小膠質(zhì)細胞的結構和功能，結果發(fā)現(xiàn)，老年大鼠的脊髓小膠質(zhì)細胞數(shù)目大大增加，形態(tài)上，胞體增大，突起變粗變短，傾向于一種激活形態(tài)；檢測細胞因子(包括促炎因子和抗炎因子)的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，促炎因子IL-1β表達降低而抗炎因子IL-10表達升高，這說明老年大鼠的脊髓小膠質(zhì)細胞的功能異于年輕大鼠，衰老的小膠質(zhì)細胞功能發(fā)生改變，參與神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)促炎功能和抗炎功能的失衡，可能是炎性衰老形成的機制之一。我們的結果還提示，在正常衰老過程中，脊髓小膠質(zhì)細胞可能發(fā)揮的不是促炎作用，而是抗炎作用，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。這可能是因為在正常老化過程中，由于某些原因導致神經(jīng)系統(tǒng)中促炎因子水平增加，而小膠質(zhì)細胞的抗炎作用可參與維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥狀態(tài)平衡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16]。

綜上所述，本研究建立了改良的老年大鼠神經(jīng)組織小膠質(zhì)細胞的分選方法，可分離出數(shù)量多、純度高、活性好的小膠質(zhì)細胞，有助于進行老化的神經(jīng)生物學機制的研究；本研究還初步證實正常衰老過程中，小膠質(zhì)細胞參與炎性衰老的進程。