如何證明植物生物刺激劑的功效聲明

申繼忠，余武秀

(上海艾農(nóng)國(guó)際貿(mào)易有限公司，上海 200122)

已經(jīng)出臺(tái)的歐盟肥料法規(guī)提出基于功效聲明(主張)的植物生物刺激劑定義?！爸参锷锎碳笔侵复龠M(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)的吸收和轉(zhuǎn)化而不提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)品，目的是改進(jìn)植物的下列特征中的一項(xiàng)或多項(xiàng): 養(yǎng)分利用效率，對(duì)非生物脅迫的耐受性，作物品質(zhì)性狀或土壤和根際土壤中被限制的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有效性。法規(guī)也明確規(guī)定了植物生物刺激劑“應(yīng)具有產(chǎn)品標(biāo)簽上功效聲明的效果”[1]。這就使得制造商有責(zé)任向監(jiān)管機(jī)構(gòu)和消費(fèi)者證明產(chǎn)品功效聲明是合理的。因此，對(duì)某一特定的植物生物刺激劑證明其農(nóng)藝學(xué)上的功效聲明是使其能夠被投放到市場(chǎng)的重要因素。

目前全世界范圍內(nèi)生物刺激劑的監(jiān)管還都處于起步階段，有很多問(wèn)題尚待明確。中國(guó)目前尚無(wú)生物刺激劑的官方定義，更沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的監(jiān)管措施[2]。因此，作為刺激劑產(chǎn)品都是廠家自己的功效聲明，市場(chǎng)上的生物刺激劑產(chǎn)品也相對(duì)混亂。生物刺激劑的有效成分可能具有多種生物活性，功效聲明其具有刺激劑作用必須有充分的證據(jù)，這些證據(jù)可以來(lái)自田間驗(yàn)證試驗(yàn)、現(xiàn)有文獻(xiàn)等多個(gè)方面。但是功效聲明具有刺激劑作用必須遵守一定的原則，否則就會(huì)產(chǎn)生混亂。這方面的工作，目前只有歐盟和美國(guó)在進(jìn)行中。歐盟生物刺激劑工業(yè)委員會(huì)(EBIC)提出了功效聲明產(chǎn)品具有刺激劑作用應(yīng)遵守的一般性原則，目的是為歐洲肥料法規(guī)中生物刺激劑產(chǎn)品制定標(biāo)準(zhǔn)提供參考[2]。美國(guó)環(huán)保署發(fā)布了“植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑包括生物刺激劑產(chǎn)品標(biāo)簽聲明指導(dǎo)草案(2019)”[3]以及“植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑包括生物刺激劑產(chǎn)品聲明指導(dǎo)草案(2020)”[4,5]。本文僅就EBIC 提出的“證明生物刺激劑功效聲明的一般原則”作簡(jiǎn)要介紹，以供國(guó)內(nèi)主管部門(mén)和業(yè)界參考。

1 歐盟肥料法規(guī)

新的歐盟肥料法規(guī)于2019 年6 月25 日發(fā)布，2019 年7 月15 日開(kāi)始生效，2022 年7 月16 日開(kāi)始全面實(shí)施[1]。

新的肥料法規(guī)將生物刺激劑納入肥料管理范疇，與植物保護(hù)產(chǎn)品(農(nóng)藥)分開(kāi)監(jiān)管。新的歐盟肥料法規(guī)涵蓋6 種產(chǎn)品(肥料、石灰質(zhì)材料、土壤改良劑、生長(zhǎng)介質(zhì)、抑制劑、植物生物刺激劑)以及它們的組合物(表1)。其中生物刺激劑包括微生物刺激劑和非微生物刺激劑。在此法規(guī)中，沒(méi)有微生物肥料的概念，說(shuō)明此類(lèi)物質(zhì)都可以歸入微生物類(lèi)刺激劑。

表1 歐盟肥料法規(guī)包括的肥料產(chǎn)品類(lèi)別[1]

歐盟肥料法規(guī)還對(duì)每類(lèi)產(chǎn)品所使用的原材料進(jìn)行了規(guī)范，共分為11 類(lèi)原材料(表2)。其中第7 類(lèi)(CMC 7)是微生物類(lèi)生物刺激劑推薦使用的微生物種類(lèi)。當(dāng)然在實(shí)際生產(chǎn)中，也可以使用其他類(lèi)微生物。

表2 歐盟肥料產(chǎn)品原料組分分類(lèi)(CMCs)[1]

續(xù)表2

2022 年7 月16 日之前，還需要為法規(guī)的實(shí)施制定一系列執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。這項(xiàng)工作由歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)負(fù)責(zé)。

歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CEN)專(zhuān)門(mén)制定歐洲標(biāo)準(zhǔn)(ENs)，適用于整個(gè)歐洲單一市場(chǎng)。CEN 匯集了34個(gè)國(guó)家的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)機(jī)構(gòu)和由數(shù)千個(gè)來(lái)自商業(yè)聯(lián)盟、商業(yè)和消費(fèi)者的技術(shù)專(zhuān)家組織、環(huán)境團(tuán)體和其他社會(huì)利益相關(guān)者。它被歐洲委員會(huì)授權(quán)開(kāi)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)支持肥料產(chǎn)品法規(guī)的實(shí)施，在這種情況下CEN 于2017年創(chuàng)建了CEN/TC 455 植物生物刺激劑技術(shù)委員會(huì)，專(zhuān)門(mén)負(fù)責(zé)開(kāi)發(fā)生物刺激劑相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)(表3)。法國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(AFNOR)被指定為CEN/TC 455 第二工作組(WG 2)的負(fù)責(zé)機(jī)構(gòu)，專(zhuān)門(mén)制定生物刺激劑功效聲明的標(biāo)準(zhǔn)(表3)。

表3 CEN/TC 455 生物刺激劑技術(shù)分委會(huì)和工作組[6,7]

2 證明植物生物刺激劑功效聲明的一般原則

2.1 生物刺激劑的定義及其對(duì)功效聲明的要求

植物生物刺激劑的定義是基于產(chǎn)品功效聲明的(歐洲委員會(huì)，2016；歐盟理事會(huì)，2018)，意思是用產(chǎn)品功能而不是用產(chǎn)品所含的成分來(lái)定義生物刺激劑。因此，證明一種產(chǎn)品確實(shí)是真正的生物刺激劑取決于對(duì)它的效果的證明。但是，這不能被視為要求保證產(chǎn)品具有特定水平的效果。在任何情況下，將生物刺激劑投放歐盟市場(chǎng)都不應(yīng)被視為保證在所有條件下的有效性，因?yàn)樵S多因素可能會(huì)影響生物刺激劑在現(xiàn)場(chǎng)的性能。

制造商應(yīng)該提供足夠可信的數(shù)據(jù)，而不是讓這個(gè)過(guò)程變成不必要的負(fù)擔(dān)。為產(chǎn)品功效聲明提供可靠的科學(xué)支持是歐洲生物刺激劑工業(yè)理事會(huì)(EBIC)工作的核心原則之一，而EBIC 也從其他部門(mén)的產(chǎn)品功效聲明證明中獲得了靈感。但是，其他類(lèi)別產(chǎn)品的現(xiàn)有功效聲明論證程序不能以復(fù)制/黏貼的方式自動(dòng)應(yīng)用于生物刺激劑，原因有：⑴ 現(xiàn)有生物刺激劑產(chǎn)品(包括微生物和非微生物產(chǎn)品)具有多樣性以及隨之而有的廣泛的功效聲明；⑵ 生物刺激劑的功效受多種環(huán)境因素的影響；⑶ 生物刺激劑成分之間的相互作用，以及生物刺激劑本身與其他系統(tǒng)因素(如天氣、土壤微生物群、土壤類(lèi)型、作物品種等)之間的相互作用都對(duì)其功效有影響。

為了促進(jìn)提供高質(zhì)量數(shù)據(jù)支持生物刺激劑的功效聲明(無(wú)論是為了投放市場(chǎng)還是商業(yè)用途)，EBIC與主要利益攸關(guān)方共同制定指導(dǎo)方針，匯編生物刺激劑的可靠數(shù)據(jù)，以便獲得一致和可靠的結(jié)果。

歐洲生物刺激劑工業(yè)理事會(huì)已經(jīng)確定有必要制定指導(dǎo)方針，以滿(mǎn)足2 個(gè)層面的要求：⑴ 生成支持生物刺激劑功效聲明的數(shù)據(jù)；⑵ 使用數(shù)據(jù)支持將生物刺激劑投放歐盟市場(chǎng)和/或支持商業(yè)產(chǎn)品功效聲明。

那么需要多少數(shù)據(jù)來(lái)支持產(chǎn)品功效聲明呢?這取決于功效聲明的作用多少。功效聲明范圍越窄，所需的數(shù)據(jù)就越少?？紤]到產(chǎn)品效果、作物或作物分組和生長(zhǎng)條件的多樣性，制造商需要靈活設(shè)計(jì)適應(yīng)特定農(nóng)藝狀況的試驗(yàn)研究。此外，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，當(dāng)涉及到提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有效性的產(chǎn)品(特別是微生物)時(shí)，土壤類(lèi)型和條件可能比作物類(lèi)型本身更重要。因此，需要靈活的試驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)適應(yīng)這種情況。

產(chǎn)品功效聲明的理由應(yīng)集中在歐盟的生物刺激劑定義上。為了將產(chǎn)品投放歐洲市場(chǎng)，所有功效聲明均應(yīng)證明與歐盟肥料法規(guī)(歐洲委員會(huì)，2016 年；歐盟理事會(huì)，2018 年)之生物刺激劑定義中的4 種功效聲明之一：提高養(yǎng)分利用效率、對(duì)非生物脅迫的耐受性、作物品質(zhì)特征或土壤和根際被限制養(yǎng)分的可獲得性。

由于每一類(lèi)功效聲明都相當(dāng)寬泛，表4 給出了各類(lèi)功效聲明的更精確描述，以使每一類(lèi)功效具體化并便于執(zhí)行。

表4 生物刺激劑的功效聲明類(lèi)別及子類(lèi)

此外，這些影響通常會(huì)轉(zhuǎn)化為對(duì)農(nóng)民有價(jià)值的建議。例如提高產(chǎn)量(這在歐盟肥料法規(guī)中沒(méi)有明確提到，但可能是使用任何生物刺激劑產(chǎn)品的結(jié)果)和提高作物質(zhì)量(這是生物刺激劑的作用)。雖然產(chǎn)量收益可以追溯到法規(guī)中所定義的生物刺激劑功效聲明中的一種，但EBIC 已將其列為單獨(dú)一類(lèi)功效聲明，以確保以恰當(dāng)?shù)男g(shù)語(yǔ)描述并顯示其功效。

2.2 可支持功效聲明的信息類(lèi)型

各種類(lèi)型的數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)證據(jù)可以支持生物刺激劑的功效聲明?？梢詮囊寻l(fā)表的文獻(xiàn)和現(xiàn)有數(shù)據(jù)開(kāi)始，然后根據(jù)需要再使用來(lái)自控制條件和田間試驗(yàn)的新實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)補(bǔ)充這些信息是有意義的。

在控制條件下(溫室、生長(zhǎng)室、表型等)從歐盟以外產(chǎn)生的數(shù)據(jù)應(yīng)該是允許的，如果測(cè)試的氣候條件可以適用于歐盟內(nèi)部，而且：⑴ 如果它來(lái)自制造商自己的GEP/GLP-認(rèn)證的設(shè)施；⑵ 如果產(chǎn)生數(shù)據(jù)的獨(dú)立研究合作伙伴(合同設(shè)施、大學(xué)等)被認(rèn)為是有信譽(yù)的；⑶ 如果制造商能夠證明所獲得的方法和數(shù)據(jù)的質(zhì)量與GEP/GLP-認(rèn)證的設(shè)施所能達(dá)到的質(zhì)量基本相當(dāng)。

2.2.1 使用已發(fā)表的文獻(xiàn)和現(xiàn)有數(shù)據(jù)

同行評(píng)議的科學(xué)文獻(xiàn)可以支持生物刺激劑功效聲明。微生物的生物學(xué)文獻(xiàn)可以用來(lái)描述產(chǎn)品的作用方式，或?yàn)橹С炙岢龅墓π暶鞫M(jìn)行的任何已發(fā)表的相關(guān)論文中描述的初步研究等都可以采用。質(zhì)量可接受的科學(xué)文獻(xiàn)可用于支持功效聲明。文獻(xiàn)質(zhì)量可以根據(jù)Klimisch 等人(1997)描述的毒理學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量系統(tǒng)評(píng)估方法進(jìn)行評(píng)估，并確定是否可為歐盟化學(xué)立法(REACH)的數(shù)據(jù)要求所接受。需要注意的是，產(chǎn)品內(nèi)部物質(zhì)組合起來(lái)可能產(chǎn)生各種協(xié)同效應(yīng)或出現(xiàn)的新效應(yīng)，此時(shí)僅靠文獻(xiàn)本身就不太可能充分證明這種功效聲明。

現(xiàn)有的科學(xué)信息和現(xiàn)有的田間試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)按照歐洲化學(xué)品管理局(ECHA)為實(shí)施歐盟化學(xué)品法規(guī)(REACH)而定義的相關(guān)性、可靠性和充分性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估后方可采用(歐洲化學(xué)品管理局2011)。

2.2.2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)

生物刺激劑的功效聲明可以由受控條件下(實(shí)驗(yàn)室、溫室、生長(zhǎng)室、表型等)和/或田間(田間試驗(yàn))條件下產(chǎn)生的試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。來(lái)自精心設(shè)計(jì)的小型實(shí)驗(yàn)室和生長(zhǎng)室研究的額外數(shù)據(jù)往往構(gòu)成所提供的功效聲明理由的重要組成部分。如果使用田間數(shù)據(jù)，至少必須包括一些歐盟境內(nèi)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。如果來(lái)自歐盟以外的田間數(shù)據(jù)都是在與歐盟相似的地理氣候條件下生成的(并且與產(chǎn)品使用的預(yù)期環(huán)境相對(duì)應(yīng))，則可以為歐盟所采納?？梢詤⒖棘F(xiàn)有的“確定地理氣候條件可比性的指南文件(歐洲和地中海植物保護(hù)組織，2014)”確定來(lái)自歐盟以外的數(shù)據(jù)是否合乎要求。

田間試驗(yàn)可提供生物刺激劑在真實(shí)條件下作用效果的必要信息。然而，對(duì)于某些功效聲明如耐受鹽脅迫或冷脅迫的能力，都很難人工模擬合適的田間脅迫的實(shí)際情況。在這種情況下田間試驗(yàn)的重點(diǎn)將更多地放在刺激劑對(duì)作物產(chǎn)量/質(zhì)量等“整體”效益的影響上。而與刺激劑作用方式有關(guān)的功效聲明的具體內(nèi)容可在受控條件下得到驗(yàn)證。比如可以證明在受控的溫室或?qū)嶒?yàn)室條件下使用生物刺激劑產(chǎn)品可增加磷素的可獲得性，并向農(nóng)民證明使用相同的產(chǎn)品可提高產(chǎn)量和/或質(zhì)量這一總體效益。如果制造商只想要證明某生物刺激劑產(chǎn)品能溶解磷，而不想證明其隨后能提高產(chǎn)量和/或質(zhì)量，就不需要進(jìn)行田間試驗(yàn)。

在考慮了生物刺激劑的積極和消極影響后，其農(nóng)業(yè)凈效益必須足以證明使用刺激劑產(chǎn)品的合理性。某個(gè)產(chǎn)品的使用效益必須與該產(chǎn)品設(shè)定的使用環(huán)境相適應(yīng)。在某些情況下，可以接受低水平的效益，例如：⑴ 當(dāng)產(chǎn)品將作為作物綜合管理(ICM)計(jì)劃的組成部分使用時(shí)，或⑵ 在特殊情況下，如有機(jī)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，或在減少養(yǎng)分使用的同時(shí)因使用生物刺激劑產(chǎn)品還能保持相同的產(chǎn)量或質(zhì)量水平的情形。

如果試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明產(chǎn)品效果出現(xiàn)顯著的不一致，那么就必須對(duì)不一致的原因加以解釋。產(chǎn)品使用說(shuō)明要讓用戶(hù)明確在什么條件下能讓產(chǎn)品表現(xiàn)出最佳效果，以及哪些因素會(huì)影響產(chǎn)品的有效性。原因不明的產(chǎn)品性能的變化不應(yīng)阻礙產(chǎn)品投放市場(chǎng)，但在這種情況下產(chǎn)品功效聲明的不確定性應(yīng)該在產(chǎn)品標(biāo)簽上說(shuō)明。透明度對(duì)于農(nóng)民做出明智的選擇至關(guān)重要。

3 生物刺激劑試驗(yàn)/測(cè)試的總指導(dǎo)

通用指南統(tǒng)計(jì)程序的使用應(yīng)適用于田間試驗(yàn)軟件(如ARM)。

3.1 試驗(yàn)研究計(jì)劃

試驗(yàn)研究計(jì)劃應(yīng)包括以下內(nèi)容：⑴ 試驗(yàn)?zāi)康?；?統(tǒng)計(jì)分析和試驗(yàn)設(shè)計(jì)；⑶ 試驗(yàn)條件；⑷ 田間試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和布局；⑸ 對(duì)照數(shù)據(jù)；⑹ 刺激劑處理的應(yīng)用；⑺ 評(píng)估方式。以下分別詳述這些內(nèi)容。

3.1.1 試驗(yàn)?zāi)康?/p>

⑴ 試驗(yàn)的目的和試驗(yàn)場(chǎng)地的基本信息：應(yīng)具體規(guī)定試驗(yàn)的目標(biāo)，包括待驗(yàn)證的生物刺激劑的功效以及在試驗(yàn)中納入其他變量(使用劑量、使用條件)；⑵ 試驗(yàn)是否為評(píng)估某種功效聲明或其他目的(發(fā)芽試驗(yàn)、收獲產(chǎn)品的質(zhì)量、對(duì)后續(xù)作物的影響等)；⑶ 應(yīng)提供關(guān)于試驗(yàn)地點(diǎn)的基本信息，包括完整的地址和地理坐標(biāo)(如果可能)，作物和品種，關(guān)于試驗(yàn)地的任何有用的細(xì)節(jié)(例如光照和坡度)。

3.1.2 統(tǒng)計(jì)分析和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將生物刺激劑投放市場(chǎng)絕不應(yīng)被認(rèn)為是保證它在所有條件下都有效，因?yàn)樵S多因素可能會(huì)影響生物刺激劑的田間表現(xiàn)。還有許多其他因素與生物刺激劑產(chǎn)品有關(guān)。這些可能包括：⑴ 提供與作物綜合管理系統(tǒng)和/或有機(jī)農(nóng)業(yè)兼容的方法；⑵ 與栽培實(shí)踐有更大的兼容性；⑶ 減輕替代生產(chǎn)系統(tǒng)的不良影響(對(duì)人類(lèi)、有益生物、非目標(biāo)生物、其他作物等)。

在這種情況下，生物刺激劑制造商應(yīng)確保能夠向用戶(hù)提供有關(guān)產(chǎn)品性能的準(zhǔn)確信息，并就如何最佳使用該產(chǎn)品提供建議，以使其盡可能有效和經(jīng)常地發(fā)揮作用。

考慮到生物刺激劑的作用性質(zhì)以及它們內(nèi)在的可變性(從生理和生物敏感性到土壤氣候條件，當(dāng)?shù)匚⑸锒鄻有院妥魑镞z傳特性)，在受控的條件下(溫室或?qū)嶒?yàn)室)與未經(jīng)處理的對(duì)照相比可以將置信水平設(shè)置在90% (在受控條件下的最低農(nóng)藝生產(chǎn)試驗(yàn))。

為證明生物刺激劑的功效聲明，至少要在歐盟進(jìn)行3 次田間試驗(yàn)。在田間試驗(yàn)中，與未經(jīng)處理的小區(qū)相比，如果觀察到生物刺激劑表現(xiàn)出經(jīng)常的“農(nóng)學(xué)上”的積極作用趨勢(shì)(不一定具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性)，可以認(rèn)為這足以支撐生物刺激劑的功效聲明。

如果在一個(gè)季節(jié)內(nèi)且在不同的地理氣候條件下(與產(chǎn)品銷(xiāo)售和使用地的環(huán)境條件和農(nóng)藝條件相似)進(jìn)行足夠的試驗(yàn)證明功效聲明是合理的，那么試驗(yàn)就不需要經(jīng)過(guò)多個(gè)季節(jié)的試驗(yàn)。這些試驗(yàn)應(yīng)該在歐盟進(jìn)行。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)該以能區(qū)別處理區(qū)和未處理區(qū)的方式進(jìn)行。建議有足夠的重復(fù)，以確保減少數(shù)據(jù)的可變性和增加觀察到處理區(qū)和未處理區(qū)之間經(jīng)常性差異的機(jī)會(huì)。

如果生物刺激劑的性能受溫度、土壤類(lèi)型、作物或其他參數(shù)的影響，那么試驗(yàn)設(shè)計(jì)、執(zhí)行和后續(xù)用戶(hù)建議都應(yīng)考慮這些因素。

如果試驗(yàn)設(shè)計(jì)得當(dāng)，可以在一次試驗(yàn)中證明多種功效聲明。

在產(chǎn)量和質(zhì)量方面，未經(jīng)處理的小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)反映當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的正常農(nóng)藝預(yù)期。

研究計(jì)劃應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明評(píng)估的內(nèi)容、評(píng)估的方式、評(píng)估的時(shí)間和原因。

建議至少評(píng)估農(nóng)民所關(guān)心的某一個(gè)可測(cè)量指標(biāo)(如對(duì)產(chǎn)量和/或質(zhì)量的影響)。例如，根結(jié)形成是早期的可測(cè)量的參數(shù)，但它本身不足以確認(rèn)對(duì)作物產(chǎn)量和/或質(zhì)量的影響。如果在所設(shè)計(jì)的試驗(yàn)中沒(méi)有評(píng)估擬聲明的某種生物刺激作用，那么這個(gè)作用就不能在標(biāo)簽上作為功效聲明。例如，能增加根生長(zhǎng)的功效聲明會(huì)在試驗(yàn)中得到證明，但作物產(chǎn)量增加在試驗(yàn)中沒(méi)有量化。此時(shí)，標(biāo)簽可以聲稱(chēng)“增加了根系生長(zhǎng)”，但不能聲稱(chēng)“能提高產(chǎn)量”，因?yàn)楫a(chǎn)量的增加沒(méi)有得到數(shù)據(jù)證明。

生物刺激劑對(duì)植物的藥害應(yīng)在試驗(yàn)中加以驗(yàn)證。如果沒(méi)有觀察到植物藥害的證據(jù)，那么就沒(méi)有必要進(jìn)行額外的植物藥害試驗(yàn)。但是，如果有植物藥害的跡象，則需要植物藥害數(shù)據(jù)。至少，當(dāng)使用生物刺激劑時(shí)，制造商應(yīng)該提供關(guān)于如何將植物藥害降到最低的建議。

來(lái)自GEP/GLP 認(rèn)證設(shè)施的數(shù)據(jù)可以被認(rèn)為是可靠的，即使這些設(shè)施是屬于制造商的(即非第三方機(jī)構(gòu))。盡管如此，還是希望制造商能證明至少某些研究是由公正和合格的第三方提供的。盡可能多地由獨(dú)立和有能力的合作伙伴進(jìn)行試驗(yàn)以支持產(chǎn)品功效聲明，這些合作伙伴可以是⑴ 國(guó)家研究機(jī)構(gòu)和推廣官員；⑵ 在農(nóng)業(yè)和農(nóng)學(xué)領(lǐng)域發(fā)表研究成果的機(jī)構(gòu)(包括但不限于大學(xué)、其他高等院校和私人研究機(jī)構(gòu))和研究人員；⑶ 經(jīng)認(rèn)證的私人研究中心(GLP/GEP或GLP/GEP 等效條件)。

3.1.3 試驗(yàn)條件

應(yīng)充分說(shuō)明土地和作物的有關(guān)情況，例如：⑴ 對(duì)于一年生作物，播種或種植日期、密度、行距；⑵ 對(duì)于多年生作物，行的排列和間距或單株種植、修剪或整枝方式、砧木、冠層高度、株寬、年齡、生產(chǎn)過(guò)程中的天氣；⑶ 對(duì)于溫室作物，可以在栽培箱內(nèi)、試驗(yàn)臺(tái)上、水培養(yǎng)液中栽培等；⑷ 需要描述作物的栽培方法，如耕作、肥料和灌溉制度，以及任何其他額外的投入；⑸ 應(yīng)說(shuō)明作物在進(jìn)行生物刺激劑處理時(shí)是在正常條件下生長(zhǎng)還是在有脅迫(如干旱、霜凍、風(fēng)或其他整體化學(xué)處理的影響，和/或其他有害生物如病害和雜草的影響)存在的條件下生長(zhǎng)的；⑹ 對(duì)于土壤使用的生物刺激劑產(chǎn)品，應(yīng)至少在試驗(yàn)的第1 個(gè)月每隔2 h 記錄表層土壤在根區(qū)層面的溫度；并應(yīng)描述土壤特征，如砂土、黏土、粉砂土和有機(jī)質(zhì)百分含量，以及pH 等。

3.1.4 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)和布局

試驗(yàn)小區(qū)的設(shè)計(jì)和布局應(yīng)加以描述，最好附有平面圖，小區(qū)的數(shù)量、大小和形狀，無(wú)論是由小區(qū)在地面上的尺寸確定的還是由特定的植物布局確定的都可以。

應(yīng)指明試驗(yàn)設(shè)計(jì)的類(lèi)型。為未經(jīng)處理的對(duì)照所作的安排應(yīng)被準(zhǔn)確地標(biāo)出，以及任何其他對(duì)照方式的細(xì)節(jié)。

在保證科學(xué)設(shè)計(jì)的同時(shí)，試驗(yàn)小區(qū)應(yīng)確保完全隨機(jī)區(qū)組排列，以避免試驗(yàn)小區(qū)之間試驗(yàn)條件可能帶來(lái)的任何干擾(例如在干旱脅迫緩解試驗(yàn)中，必須將充足供水的試驗(yàn)帶置于試驗(yàn)處理的旁邊作為參考)。

在試驗(yàn)中應(yīng)保證有足夠的重復(fù)，以獲得12 個(gè)自由度，這樣就可以證明經(jīng)處理和未經(jīng)處理的作物之間是否存在經(jīng)常的差異。

3.1.5 對(duì)照數(shù)據(jù)

對(duì)照數(shù)據(jù)集可以是來(lái)自完全未經(jīng)處理的小區(qū)，也可以來(lái)自所謂的“漏驗(yàn)”組(omission group)。漏驗(yàn)組與處理組方案相同，只是不用生物刺激劑。

為證明用于“改進(jìn)營(yíng)養(yǎng)攝取”這一功效聲明要求設(shè)置的對(duì)照類(lèi)型應(yīng)包括：⑴ 未經(jīng)任何處理的對(duì)照。⑵ 當(dāng)生物刺激劑產(chǎn)品中含有營(yíng)養(yǎng)素時(shí)，需要設(shè)置如下之一作為對(duì)照組，選擇1：如果“支持組”提供營(yíng)養(yǎng)元素，則單獨(dú)使用“支持制劑”；選擇2：不含營(yíng)養(yǎng)元素的生物刺激劑制劑單獨(dú)使用。⑶ 當(dāng)產(chǎn)品功效聲明包括抵抗非生物脅迫時(shí)，對(duì)照應(yīng)包括：有脅迫的對(duì)照、無(wú)脅迫的對(duì)照、脅迫水平的表述。

3.1.6 刺激劑處理的應(yīng)用

應(yīng)提供有關(guān)試驗(yàn)產(chǎn)品的配方、使用方法、濃度和數(shù)量的準(zhǔn)確信息。

為證明生物刺激劑功效聲明的正當(dāng)性，應(yīng)以達(dá)到預(yù)期效果所需的最低推薦劑量進(jìn)行試驗(yàn)。然而，這對(duì)于產(chǎn)品組成主要是環(huán)境中自然存在的物質(zhì)的生物刺激劑產(chǎn)品可能不那么重要，除非添加量顯著超過(guò)了現(xiàn)有的自然本底水平。此外，對(duì)于某些生物刺激劑(例如微生物生物刺激劑)，最低有效劑量的概念可能更難以在實(shí)際中確定，而一個(gè)劑量范圍則可能更適合證明相關(guān)的功效聲明。在這種情況下，當(dāng)需要對(duì)建議的劑量作出適當(dāng)解釋時(shí)，可能沒(méi)有必要提供田間產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。這種解釋?xiě)?yīng)涉及微生物的作用方式和生物學(xué)，還可以包括為推薦制劑濃度和/或使用劑量提供基礎(chǔ)的任何初步研究(包括相關(guān)已發(fā)表的同行評(píng)價(jià)論文)。

雖然制造商應(yīng)該總在尋求證明推薦劑量的合理性，但缺乏精確或常規(guī)的劑量驗(yàn)證數(shù)據(jù)不能成為阻止生物刺激劑投放市場(chǎng)的理由。在此情況下，制造商根據(jù)實(shí)驗(yàn)室或田間試驗(yàn)獲得的有效數(shù)據(jù)提供證明獲得有益影響所需的最低劑量的信息可能就足夠了。

⑴ 測(cè)試和參考產(chǎn)品：應(yīng)給出試驗(yàn)(測(cè)試和參考)中包含的產(chǎn)品的信息，包括通用名稱(chēng)或其他指定標(biāo)準(zhǔn)(如果有)，以及每個(gè)制劑產(chǎn)品的確切名稱(chēng)或其他名稱(chēng)。

⑵ 使用方式：應(yīng)提供如下信息以確保田間試驗(yàn)遵循了良好農(nóng)業(yè)規(guī)范：①使用的方法和設(shè)備；②任何與預(yù)期劑量的顯著偏差；③可能影響產(chǎn)品功效聲明的操作條件(例如噴霧壓力、噴嘴類(lèi)型、噴霧質(zhì)量和噴霧器的移動(dòng)速度)；④使用次數(shù)；⑤每次使用的日期(包括年份，最好使用日-月-年格式表示使用日期)；⑥每次使用時(shí)作物的生長(zhǎng)階段(見(jiàn)BBCH 生長(zhǎng)階段關(guān)鍵詞)；⑦使用劑量(mL/hm2，g/hm2或L/hm2, kg/hm2)和噴霧量(L/hm2)。

⑶ 氣象數(shù)據(jù)：應(yīng)記錄下列氣象資料：①試驗(yàn)員在使用刺激劑當(dāng)天前后觀察得到的氣象資料可能影響試驗(yàn)結(jié)果。這取決于試驗(yàn)者的判斷，但不需要提供像使用當(dāng)天那樣詳細(xì)的氣象資料。②必須提供試驗(yàn)人員在使用生物刺激劑的當(dāng)天觀察的氣象資料，包括某些標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)(溫度、濕度、風(fēng)速)；如果在葉面使用后24 h 內(nèi)下雨，應(yīng)予記錄(涉及到產(chǎn)品的耐雨水沖刷性)。

⑷ 試驗(yàn)期間還應(yīng)記錄土壤數(shù)據(jù)。

3.1.7 評(píng)估方式

⑴ 評(píng)估的類(lèi)型、時(shí)間和頻率。⑵ 每次評(píng)估的類(lèi)型和日期。⑶ 應(yīng)描述使用的方法。使用的任何評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)(尺度)都應(yīng)加以說(shuō)明。⑷ 對(duì)作物的直接影響。應(yīng)注意每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)是否存在植物藥害，并準(zhǔn)確描述所有藥害癥狀，例如發(fā)育周期的變化、顏色變化、壞死、變形、對(duì)植物的產(chǎn)量和質(zhì)量的影響。⑸ 當(dāng)需要產(chǎn)量和質(zhì)量數(shù)據(jù)時(shí)，應(yīng)仔細(xì)記錄每一種作物所需的具體參數(shù)。

3.2 試驗(yàn)報(bào)告

試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括：⑴ 試驗(yàn)?zāi)康?；?供試產(chǎn)品和參考產(chǎn)品清單，包括劑量和使用次數(shù)；⑶ 評(píng)估方式；⑷ 試驗(yàn)結(jié)果，包括統(tǒng)計(jì)分析(如有)。

3.3 進(jìn)行生物刺激劑田間試驗(yàn)的作物分組

當(dāng)進(jìn)行證明生物刺激劑功效聲明的試驗(yàn)時(shí)，可參考表5 中列出的作物分組建議，選擇需要試驗(yàn)的作物。歐洲生物刺激劑工業(yè)委員會(huì)(EBIC)建議的指導(dǎo)方針(表6)，可以幫助制造商確定需要的試驗(yàn)次數(shù)，試驗(yàn)次數(shù)需要視實(shí)驗(yàn)性質(zhì)而定，并要防止評(píng)審當(dāng)局對(duì)試驗(yàn)的過(guò)多要求。盡管已有這樣的指導(dǎo)方針，但是制造商仍然可能需要根據(jù)特定的刺激劑功效聲明調(diào)整試驗(yàn)。

表5 為證明生物刺激劑功效聲明的作物分組建議

表6 為證明刺激劑功效聲明所需要的試驗(yàn)次數(shù)

在適當(dāng)?shù)那闆r下，可以用適當(dāng)?shù)目茖W(xué)文獻(xiàn)代替所建議的一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)。

4 結(jié) 論

一種產(chǎn)品的生物刺激劑作用需要通過(guò)其試驗(yàn)效果來(lái)證明，但這不是為了保證產(chǎn)品具有特定水平的效果。在任何情況下，都不能認(rèn)為投入市場(chǎng)的生物刺激劑產(chǎn)品必須在所有情況下都有效，因?yàn)樵S多因素可能會(huì)影響某種生物刺激劑在田間的表現(xiàn)。對(duì)證明產(chǎn)品功效聲明的要求應(yīng)與任務(wù)成比例；制造商應(yīng)該提供足夠可信的數(shù)據(jù)，但又不能使之成為制造商不必要的負(fù)擔(dān)。功效聲明范圍越窄，所需的數(shù)據(jù)就越少?？紤]到可能的影響、作物或作物分組和生長(zhǎng)條件的多樣性，制造商需要靈活設(shè)計(jì)適應(yīng)特定農(nóng)藝情況的試驗(yàn)方案。此外，還應(yīng)認(rèn)識(shí)到，對(duì)于目的在于改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的產(chǎn)品(特別是微生物類(lèi)刺激劑產(chǎn)品)而言，土壤類(lèi)型和土壤條件在設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)可能比作物類(lèi)型本身更重要。隨著刺激劑產(chǎn)品向復(fù)雜、多組分的方向發(fā)展，田間試驗(yàn)將變得更加重要。要證明刺激劑產(chǎn)品的多重效應(yīng)，特別是協(xié)同效應(yīng)或新出現(xiàn)的效應(yīng)時(shí)，則對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)有更高的要求。

歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CEN)已經(jīng)開(kāi)始研究過(guò)程和方法，這些過(guò)程和方法將成為一套統(tǒng)一的歐洲標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)，根據(jù)歐盟肥料產(chǎn)品新法規(guī)來(lái)證明生物刺激劑的功效聲明。這項(xiàng)工作包括標(biāo)準(zhǔn)的名稱(chēng)、生物刺激劑規(guī)格、標(biāo)簽、測(cè)試方法、驗(yàn)證產(chǎn)品功效聲明和安全要求等。

由EBIC 制定并在本文中概述的一般原則可以為CEN 關(guān)于功效聲明論證的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的起草提供參考，因?yàn)檫@些原則的提出得益于參與生物刺激劑產(chǎn)品功效聲明測(cè)試的專(zhuān)業(yè)人士之間的重要討論。