表面活性劑協(xié)同超聲提取杠板歸中 總黃酮及抗氧化活性研究

劉佳豪，李 磊，彭 林

（邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南邵陽 422000）

杠板歸又名貫葉蓼、蛇倒退等，屬于蓼科蓼屬（Polygonaceae）植物。杠板歸不僅能被加工成可口的菜肴，還是飼養(yǎng)牲畜的優(yōu)質(zhì)植物，是一種集食、飼于一身的植物。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，杠板歸中的黃酮能清除自由基，具有一定的抗氧化活性，因此杠板歸可作為天然抗氧化劑的來源應(yīng)用于食品等方面，如從杠板歸中提取出的黃酮搭配維生素C、維生素E組成抗氧化活性更高的物質(zhì)[1-2]。杠板歸在我國產(chǎn)量大、生長范圍廣，但沒有被大量開發(fā)利用，所以需要加強(qiáng)對杠板歸的研究，擴(kuò)大杠板歸的應(yīng)用范圍，優(yōu)化產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)。目前，杠板歸中總黃酮的提取方法有纖維素酶解法、乙醇回流提取法、超聲提取法和微波提取法等，還沒有利用表面活性劑或離子液體輔助超聲提取法相結(jié)合的有關(guān)研究[3-5]。表面活性劑超聲波協(xié)同輔助提取杠板歸中的黃酮類物質(zhì)，能更大程度上使黃酮類物質(zhì)析出，提高提取效率。經(jīng)過單因素試驗(yàn)，對表面活性劑輔助超聲提取杠板歸中總黃酮類化合物的條件篩選，得到最佳提取條件，并探究杠板歸黃酮提取物體外抗氧化活性，為杠板歸在食品抗氧化劑中的應(yīng)用提供理論 依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杠板歸，湖南省邵陽市本地采摘；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品；無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸銨、十二烷基苯磺酸鈉、十六烷基三甲基氯化銨、十八烷基三甲基氯化銨、聚乙二醇600、維生素C和1,1-二甲基-2-三硝基苯肼，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DZ-2BC型真空干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；SB-4200型超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；FW400A型高速萬能粉碎機(jī)，北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 杠板歸樣品預(yù)處理

取適量杠板歸，曬干、粉碎，過80目篩，真空干燥后放入密封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 溶液的制備

①蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取干燥后的蘆丁對照品10 mg置于燒杯中，以70%乙醇溶解并定容至 50 mL容量瓶，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。②亞硝酸鈉溶液。稱取2.50 g NaNO2固體，定容至50 mL容量瓶，制得5%的亞硝酸鈉溶液。③硝酸鋁溶液。稱取5.00 g Al(NO3)3固體，定容至50 mL容量瓶，制得10%的硝酸鋁溶液。④氫氧化鈉溶液。稱取2.00 g NaOH固體，定容至50 mL容量瓶，制得4%的氫氧化鈉溶液。

1.3.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確吸取0 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、 1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL和3.00 mL放入10 mL容量瓶中，加5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，靜置6 min； 加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，靜置6 min；再加4%的氫氧化鈉溶液2.0 mL，最后以70%的乙醇溶液定容至10 mL刻度線搖勻，靜置15 min[6-7]。

以試劑空白作為參比，在波長為510 nm處測定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的濃度作為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 表面活性劑種類對提取率的影響

稱取7份5.000 g杠板歸置于7個錐形瓶中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%（0.050 0 g）的表面活性劑。表面活性劑種類為十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸銨、十二烷基苯磺酸鈉、十六烷基三甲基氯化銨、十八烷基三甲基氯化銨、聚乙二醇600以及空白組。用70%乙醇溶液定容，料液比為1∶20（g∶mL），40 ℃下超聲提取60 min，抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL，取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中，按照1.3.3的操作步驟測吸光度，計(jì)算出總黃酮得率。

1.4.2 表面活性劑用量對提取率的影響

稱取8份5.000 g杠板歸置于8個錐形瓶中，分 別 加 入0.025 0 g（0.5%）、0.050 0 g（1.0%）、 0.075 0 g（1.5%）、0.100 0 g（2.0%）、0.125 0 g（2.5%）、0.150 0 g（3.0%）、0.175 0 g（3.5%）和0.200 0 g（4.0%）十八烷基三甲基氯化銨，用70%乙醇溶液定容，料液比為1∶20（g∶mL），40 ℃下超聲提取60 min， 抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL， 取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中，按照1.3.3的操作步驟測吸光度，計(jì)算出總黃酮得率。

1.4.3 乙醇濃度對提取率的影響

稱取6份5.000 g杠板歸置于6個錐形瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的十八烷基三甲基氯化銨，錐形瓶中分別加入濃度不同的乙醇溶液，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%和100%，料液比為1∶20（g∶mL），40 ℃下超聲提取60 min，抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL， 取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中，按照1.3.3的操作步驟測吸光度，計(jì)算出總黃酮 得率。

1.4.4 超聲時間對提取率的影響

精確稱取7份5.000 g杠板歸置于7個錐形瓶中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的十八烷基三甲基氯化銨，用70%乙醇溶液定容，料液比為1∶20（g∶mL），40 ℃下超聲提取。分別在30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min和90 min時取出一個錐形瓶，做好標(biāo)記，超聲處理后抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL，取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中，按照1.3.3的操作步驟測吸光度，計(jì)算出總黃酮得率。

1.4.5 超聲溫度對提取率的影響

精確稱取6份5.000 g杠板歸置于6個錐形瓶中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%十八烷基三甲基氯化銨，用70%乙醇溶液定容，料液比為1∶20（g∶mL），分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃下超聲提取70 min，抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL，取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中，按照1.3.3的操作步驟測吸光度，計(jì)算出總黃酮得率。

1.4.6 料液比對提取率的影響

精確稱取4份5.000 g杠板歸置于4個錐形瓶中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%十八烷基三甲基氯化銨，用70%乙醇溶液定容，60 ℃下超聲提取70 min，考察料液比分別為1∶10（g∶mL）、1∶20（g∶mL）、1∶30（g∶mL）和1∶40（g∶mL）時對杠板歸中總黃酮提取率的影響。超聲處理后抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL，取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中，按照1.3.3的操作步驟測吸光度，計(jì)算出總黃酮得率。

1.4.7 總黃酮提取率計(jì)算

黃酮提取率計(jì)算如公式如下：

式中：ρ為由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的提取液所計(jì)算得到的樣品黃酮質(zhì)量濃度，g/L；V0為黃酮提取液的定容體積，L；V1為顯色反應(yīng)中提取液樣品的定容體積，L；V2為所稱量的提取液樣品的體積，L；m為所稱取的質(zhì)量，g。

1.5 杠板歸中黃酮類化合物的抗氧化能力測定

1.5.1 樣品制備

精確稱取5.000 g杠板歸粉末置于錐形瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%十八烷基三甲基氯化銨，在乙醇濃度為70%，料液比為1∶30，60 ℃下超聲提取70 min， 超聲處理后趁熱抽濾得杠板歸黃酮提取液，藥渣用70%的乙醇溶液沖洗3遍，抽濾、合并收集杠板歸黃酮提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶液，得到提取浸膏，待用。

1.5.2 DPPH自由基清除

精密稱取避光冷藏的1,1-二甲基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基粉末0.005 0 g，加入無水乙醇溶解，倒入100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，制得 0.05 mg/L DPPH自由基溶液，避光保存，備用。

取杠板歸黃酮提取浸膏，用無水乙醇配制濃度分別為0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL、1.6 mg/mL和 2.0 mg/mL的樣品作為杠板歸黃酮提取液，貼好標(biāo)簽。此外在貼有標(biāo)簽的試管中分別加入2 mL上述杠板歸黃酮提取液和2 mL 0.05 mg/L的DPPH自由基溶液，將試管放置于自制的避光紙盒中，輕微搖晃使其混合均勻，室溫條件下放置30 min，于517 nm處測得吸光度（A1）；同樣的方法制備樣品對照組，其中采用無水乙醇替代DPPH溶液，貼好標(biāo)簽（A2）；空白組也是一樣，無水乙醇替代杠板歸黃酮提取液，貼好標(biāo)簽（A0）。然后根據(jù)順序，依次測量各管吸光度值。維生素C為陽性對照。每個測試管做3組平行，結(jié)果取平均值。樣品對DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如下：

式中：A0為2 mL無水乙醇+2 mL DPPH自由基溶液的吸光度值；A1為2 mL杠板歸黃酮提取液 +2 mL DPPH自由基溶液的吸光度值；A2為2 mL杠板歸黃酮提取液+2 mL無水乙醇的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為Y=3.774 8X-0.000 7（Y為吸光度，X為濃度，單位為mg/mL），R=0.994 8＞0.99。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 表面活性劑對提取率的影響

由圖1可知，在其他條件相同的情況下，加入表面活性劑組比不加表面活性劑的空白組的總黃酮提取率高，說明表面活性劑協(xié)同超聲提取杠板歸中總黃酮的效果明顯，其中十八烷基三甲基氯化銨的提取效果最好，總黃酮提取率為5.95%。因此，在后續(xù)采用十八烷基三甲基氯化銨協(xié)同超聲提取杠板歸中總黃酮。

圖1 表面活性劑種類對提取率的影響

2.2.2 表面活性劑用量對提取率的影響

由圖2可知，開始時杠板歸中總黃酮的提取率隨著十八烷基三甲基氯化銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增大，當(dāng)十八烷基三甲基氯化銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.00%時，提取率達(dá)到最大值6.16%，隨后再增加十八烷基三甲基氯化銨的用量，提取率反而降低。這是由于隨著十八烷基三甲基氯化銨用量的增加，溶液中形成的膠束數(shù)目增多，對杠板歸中黃酮的增溶作用變強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到臨界膠束濃度后，對黃酮的增溶能力變化不大，反而對其他雜質(zhì)有了一定的增溶作用，從而導(dǎo)致黃酮的得率下降。因此，十八烷基三甲基氯化銨的最佳提取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.00%。

圖2 十八烷基三甲基氯化銨的用量對提取率的影響

2.2.3 乙醇濃度對提取率的影響

由圖3可知，隨著乙醇濃度的增大，杠板歸中總黃酮的提取率也相對提高，這是因?yàn)楦馨鍤w中的黃酮類化合物在乙醇中的溶解度大于在水中的溶解度，乙醇濃度的增加能夠促進(jìn)黃酮類化合物的析出。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時，提取率達(dá)到最大值6.15%，之后再增加乙醇濃度，提取率反而下降，這可能是由于高濃度的乙醇使得杠板歸中醇溶性雜質(zhì)的溶出率增加，反而抑制杠板歸中總黃酮的提取。因此選擇最佳提取乙醇濃度為70%。

圖3 乙醇濃度對提取率的影響

2.2.4 超聲時間對提取率的影響

由圖4可知，隨著超聲提取時間的延長，杠板歸中總黃酮的提取率也在增加，當(dāng)時間達(dá)到70 min時，杠板歸中總黃酮的提取率達(dá)到最大值6.24%。隨后繼續(xù)增加超聲時長，總黃酮提取率反而下降，可能是由于長時間的超聲導(dǎo)致醇溶性雜質(zhì)的溶出率增加，反而抑制杠板歸中總黃酮的提取。因此，選定最佳超聲時長為70 min。

圖4 超聲時間對提取率的影響

2.2.5 超聲溫度對提取率的影響

由圖5可知，隨著溫度的升高，總黃酮提取率也在增加，當(dāng)溫度升至60 ℃后，提取率達(dá)到最大值6.34%，溫度超過60 ℃后，總黃酮提取率反而降低。說明當(dāng)溫度超過某一臨界值時，會阻礙表面活性劑與杠板歸的結(jié)合，導(dǎo)致提取效率降低。因此，設(shè)定杠板歸中總黃酮的最佳提取溫度為60 ℃。

圖5 超聲溫度對提取率的影響

2.2.6 料液比對提取率的影響

由圖6可知，隨著料液比的增大，杠板歸中總黃酮提取率呈先增加后降低的趨勢，當(dāng)料液比為1∶30時總黃酮的提取率達(dá)到最大值6.43%。料液比的增加會增加杠板歸與提取液之間的黃酮濃度差，使得提取率增大，隨后再增加料液比，其他雜質(zhì)也被析出，從而降低黃酮提取率。因此，料液比為1∶30時最佳。

圖6 料液比對提取率的影響

2.3 杠板歸中黃酮類化合物的抗氧化能力測定

由圖7可知，隨著提取物和維生素C濃度的增加，DPPH自由基清除率也逐漸升高，表明兩種物質(zhì)都具有清除DPPH自由基的能力，并且與濃度相關(guān)，隨著樣品濃度的增加，清除作用也不斷增強(qiáng)，具有一定的量效相關(guān)性。當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL時，DPPH自由基清除率達(dá)到91.7%，與維生素C的清除率幾乎相同，結(jié)果表明，杠板歸黃酮提取物對DPPH自由基具有良好的清除能力，具有一定的抗氧化 能力。

圖7 杠板歸黃酮提取物對DPPH自由基清除能力圖

3 結(jié)論

表面活性劑協(xié)同超聲提取杠板歸中總黃酮產(chǎn)生了明顯的效果，其中增效最明顯的是十八烷基三甲基氯化銨。通過單因素試驗(yàn)，得到表面活性劑協(xié)同超聲波提取杠板歸中總黃酮的最優(yōu)條件為十八烷基三甲基氯化銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.00%，乙醇濃度為70%，料液比為1∶30，60 ℃下超聲提取70 min，在此條件下，杠板歸中總黃酮提取率為6.43%。與單純的超聲提取法相比，表面活性劑協(xié)同超聲提取杠板歸中總黃酮，明顯提高了目標(biāo)產(chǎn)物的得率，降低了生產(chǎn)成本，具有良好的應(yīng)用前景。

通過杠板歸總黃酮體外抗氧化驗(yàn)證，確定了杠板歸中總黃酮的抗氧化能力特征。在DPPH自由基清除中，杠板歸總黃酮提取物在濃度為1.0 mg/mL時，DPPH自由基清除率達(dá)到91.7%，與維生素C的清除率幾乎相同。同時發(fā)現(xiàn)杠板歸黃酮提取物對DPPH自由基具備一定的清除能力，其清除能力主要依賴于自身的質(zhì)量濃度，隨著樣品濃度的增大，清除作用也不斷增強(qiáng)，具有一定的量效相關(guān)性。對杠板歸黃酮抗氧化性的研究，有助于擴(kuò)大杠板歸的用途范圍，優(yōu)化產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，為以后的研究提供參考數(shù)據(jù)。