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    植物源功能活性多肽研究進展

    2022-06-01 05:47:48張作達吳若娜王琴飛牛曉磊張振文
    中國農(nóng)學(xué)通報 2022年12期
    關(guān)鍵詞:多肽水解氨基酸

    張作達,吳若娜,王琴飛,牛曉磊,張振文

    (1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所,海口 571101;2海南大學(xué),???570228)

    0 引言

    多肽是α-氨基酸以肽鍵連接在一起的化合物,是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物。功能活性多肽是指在3~20個氨基酸大小、分子量小于6000 Da,且具有一定生理功能的蛋白質(zhì)片斷或水解產(chǎn)物[1]。其來源主要有:植物、動物、海洋生物和微生物,如抗氧化活性的大豆肽、抗腫瘤活性的蜂毒多肽[2]、羅非魚抗菌多肽和酵母多肽等[3]。本文主要介紹植物來源的功能活性多肽。

    植物功能活性肽由于其結(jié)構(gòu)性質(zhì)和氨基酸組成及序列的差異,表現(xiàn)出不同生理活性功能,根據(jù)其功能可分為降血壓肽、酪蛋白磷酸肽、免疫活性肽和抗氧化肽等[4],具有顯著的安全性、耐受性、易被吸收和有效性的特點,可以通過細胞膜,作為靶向給藥物載體,是新型治療藥物的優(yōu)質(zhì)原料[5]。目前研究較多的植物源功能多肽有大豆、小麥、玉米和葵花籽等多肽,也已經(jīng)制定了相關(guān)的技術(shù)標準(表1),隨著科技的進步,植物源多肽及其產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、抗菌藥物、保健食品和化妝品中,與人們的日常生活十分密切。

    表1 目前國內(nèi)植物源多肽產(chǎn)業(yè)標準

    近年來,植物源功能活性肽的開發(fā)利用頗受關(guān)注,其相關(guān)的研究方法、研究領(lǐng)域、研究內(nèi)容繁多,本文詳細闡述植物源功能活性多肽的制備、分離和鑒定技術(shù),介紹其部分功能應(yīng)用研究情況,總結(jié)當(dāng)前研究存在問題,并提出未來植物源功能活性多肽的發(fā)展思路,旨在為今后的功能多肽的開發(fā)利用提供借鑒。

    1 多肽制備方法

    植物功能活性多肽的制備方法主要有4種:(1)酶解法,是目前最常用的多肽制備方法,其反應(yīng)條件溫和,具有較強的專一性;(2)化學(xué)合成法,包括固相合成法和液相合成法,此方法可根據(jù)要求開展個性化設(shè)計,但成本高、費時,并且產(chǎn)生的殘留化合物很難清除;(3)微生物發(fā)酵法,發(fā)酵后的多肽產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定、功能性強,但發(fā)酵時間長,容易產(chǎn)生真菌毒素殘留的安全問題;(4)直接提取法,直接提取植物中的天然功能活性肽,無需水解,但是多肽含量較低,無法滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需求[6]。

    目前,酶解法廣泛應(yīng)用植物蛋白多肽的制備,是最熱門的多肽水解方法,但酶解法所用酶的專一性極其重要,因為它可以影響肽的數(shù)量、大小、氨基酸組成以及氨基酸序列,進而影響水解產(chǎn)物的功能特性。因此,酶的選擇是活性肽生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵因素。例如通過胰蛋白酶酶解可得到降血壓肽和礦質(zhì)元素結(jié)合肽;利用胃蛋白酶水解燕麥麩蛋白,可獲得抗氧化能力強的多肽[7];此外,用脯氨酰內(nèi)肽酶和其他產(chǎn)生含脯氨酸肽的蛋白酶水解蛋白質(zhì)有助于產(chǎn)生抗高血壓肽[8]。目前比較常用的蛋白酶主要有,木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶等(表2)。

    表2 常用蛋白酶最適反應(yīng)條件

    2 多肽分離純化

    2.1 膜分離技術(shù)

    膜分離(Membrane separation),指利用膜的選擇透過性,以膜兩側(cè)能量差作為推動力,根據(jù)孔徑大小允許某些組分透過而保留混合物中比孔徑大的其它組分,從而達到分離、純化或濃縮的效果。膜分離技術(shù)起始于20世紀30年代的微孔過濾(Microfiltration,MF),經(jīng)過多年不斷發(fā)展,隨后透析(Dialysis,DS)、電透析(Electrodialysis,ED)、反滲透(Reverse osmosis,RO)、超濾(Ultrafiltration,UF)、納濾(Nanofiltration,NF)、滲透汽化(Pervaporation,PV)和電去離子技術(shù)(Electrodeionization,EDI)等成功應(yīng)用(表3)。按孔徑大小分,有微濾膜、超濾膜、反滲透膜和納濾膜;按膜結(jié)構(gòu)差異,可分為對稱性膜、不對稱膜和復(fù)合膜等;按材料分,包括合成有機膜、無機膜。

    表3 膜分離比較

    目前,超濾(UF)較為適合植物功能多肽的分離、濃縮,且由于超濾技術(shù)操作簡單、環(huán)保、對儀器要求不高,且超濾過程中不會因發(fā)生相變而導(dǎo)致多肽失活,故應(yīng)用較為廣泛。如采用超濾技術(shù)對銀杏多肽混合液進行處理,得到了6個組分:大于100 kDa、50k~100 kDa、30k~50 kDa、10k~30 kDa、3k~10 kDa和小于3 kDa[13]。

    2.2 色譜分離技術(shù)

    色譜分離(Chromatographic separation),又稱層析分離或色層分離,是一種分離復(fù)雜混合物中各個組分的有效方法。其原理是利用被分離組分在固定相和流動相中具有不同分配系數(shù)或吸附力等差異,當(dāng)兩相作相對運動時,被分離組分在兩相間進行反復(fù)多次的分配,從而達到分離的效果。目前,色譜有多種,按固定相類型和分離原理不同,可分為吸附色譜(Adsorption Chromatography)、分配色譜(Partition Chromatography)、離子交換色譜(Ion Chromatography)、親和色譜(Affinity Chromatography)、大孔吸附樹脂、凝膠過濾色譜(Size Exclusion Chromatography)和聚焦色譜(Focusing Chromatography)等;按操作形式,可分為紙平面色譜、薄層色譜、紙色譜、柱色譜;按流動相狀態(tài),可分為液相色譜、氣相色譜和超臨界色譜等。各種色譜各具特點(表4),其中常用的有高效液相色譜法(HPLC),由于分離效果好、速度快、回收率高等特點,已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)和化學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域中[14],如利用液質(zhì)聯(lián)用對胡蘿卜籽蛋白酶解液進行分析,成功分離到兩個抗氧化多肽,Lys-Asp-Asn-Phe-Leu-Phe(KDNFLF)和 LeuPhe(LF)[15]。類似地,利用反相高效液相色譜、凝膠過濾色譜同樣可以分別高效分離出米糠蛋白水解物和大豆多肽混合物[16-17]。

    表4 色譜分離技術(shù)比較

    3 多肽序列鑒定

    多肽序列鑒定即肽序列的檢測,根據(jù)測序原理可分N末端測序法(Edman降解法)、C末端酶解法和C末端化學(xué)降解法等;根據(jù)激發(fā)光差異可分質(zhì)譜法(MS)、核磁共振法(NMR)、紅外光譜法(IS)、紫外光譜法(US)和圓二色譜法(CDS)。Edman降解法是蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)傳統(tǒng)方法,測序速度慢,所需樣品量較多,對樣品純度的要求很高,而且容易出現(xiàn)識別錯誤,也無法對N末端受保護的肽鏈進行測定;C末端化學(xué)降解測序法由于難以找到理想的化學(xué)探針,所以其發(fā)展緩慢[18]。質(zhì)譜技術(shù)是多肽鑒定廣泛應(yīng)用的主流技術(shù),該方法由Klaus Biemann教授等人開創(chuàng),采用質(zhì)譜法可以快速、準確的測定蛋白質(zhì)和多肽的序列,且靈敏度高[19],常用于小分子肽鑒定分析[20],包括基質(zhì)輔助激光解析電離/飛行時間質(zhì)譜(MALDI/TOF-MS或MALDI-TOF/TOF-MS/MS),而四極桿/飛行時間質(zhì)譜(Q/TOF-MS)和離子阱或軌道阱質(zhì)譜的使用較少[21],但僅靠質(zhì)譜技術(shù)仍然無法區(qū)分樣品氨基酸的異構(gòu)體[22],可利用ESI-IPMS技術(shù),結(jié)合肽電熱水解,識別D-/L-氨基酸對映體和異構(gòu)體,并可減少數(shù)據(jù)庫比對搜索工作[23]。

    4 多肽功能

    4.1 抗氧化

    有氧生物,在呼吸代謝過程和外界環(huán)境脅迫后容易產(chǎn)生自由基,傷害細胞。在正常情況下,抗氧化防御系統(tǒng)可以通過酶系統(tǒng)(SOD酶、GSH-Px酶、CAT酶、POD酶等)和非酶系統(tǒng)(Vc、類黃酮、花青素等)清除自由基。然而,在某些情況下,內(nèi)源性防御系統(tǒng)(酶或非酶系統(tǒng))無法清除自由基,需要通過外源提供抗氧化劑消除自由基的潛在傷害,而安全無毒、高效、營養(yǎng)的抗氧化肽成為了關(guān)注的焦點[24]。研究表明,從芝麻粕和綠豆中獲得的抗氧化肽,在濃度分別為14.41 mg/mL和5 mg/mL時,其DPPH清除率分別為87.622%和91.58%[25-26],而從黑小麥麩皮中提取的多肽總抗氧化活性為8.47 μmol/g,具有較好的抗氧化能力[27]。

    抗氧化肽的作用機制主要包括:(1)直接清除活性氧自由基;(2)螯合金屬離子;(3)抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng);(4)激活身體的抗氧化防御系統(tǒng)。研究表明,抗氧化肽的活性受氨基酸組成、序列和分子量的影響[28],其中疏水性氨基酸殘基可以提高抗氧化肽在脂質(zhì)相中的溶解度,促進其和自由基之間的相互作用,從而使自由基失活,或通過暴露肽的更多活性位點,從而抑制脂質(zhì)的鏈式反應(yīng),降低脂質(zhì)過氧化程度[29];芳香族氨基酸側(cè)鏈上咪唑基團可以參與氫供應(yīng)和電子轉(zhuǎn)移,具有很強螯合金屬離子、清除羥基自由基和抑制脂質(zhì)過氧化能力[30];含硫氨基酸Cys側(cè)鏈的巰基可以通過提供氫原子來清除自由基[31]。大量研究表明,分子量的大小也會顯著影響多肽的抗氧化活性,小肽容易通過腸上皮細胞并被身體吸收,具有更高的抗氧化活性[32]。

    4.2 抗高血壓

    在人體高血壓的生理機制中[40](圖1),血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)是參與腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的主要酶[33],ACE將血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)轉(zhuǎn)化為具有強力收縮血管和升壓能力的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)[34],來升高血壓;而多肽可以抑制腎素或ACE的活性,進而降低血壓[35]。許多研究表明植物源活性多肽可以降低自發(fā)性高血壓[36],它不僅可以通過增加一氧化氮的產(chǎn)生,舒緩血管平滑肌,達到降血壓的作用[37],也可以通過阻斷血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)與其受體結(jié)合,并促進緩激肽介導(dǎo)的血管舒張,從而達到降低血壓的效果[38],也可避免人工合成的抗高血壓藥物所引起的頭暈、味覺障礙、頭痛和血管性水腫等副作用[39]。

    圖1 腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)

    4.3 免疫調(diào)節(jié)

    免疫系統(tǒng)是一個由細胞、組織和器官組成的網(wǎng)絡(luò),分為先天免疫和獲得性免疫。先天免疫,又稱自然免疫或天然免疫,是非特異性的,其中巨噬細胞和中性粒細胞在吞噬作用中起著重要作用[41];獲得性免疫,對存在潛在危險的外來抗原具有高度特異性。獲得性免疫分為兩種類型,即細胞免疫和抗體免疫(體液免疫),T淋巴細胞(T細胞)和B淋巴細胞(B細胞)在細胞免疫中起著重要作用;在抗體免疫中,B細胞與特定抗原結(jié)形成抗體,再與入侵的病原體結(jié)合,由巨噬細胞吞噬破壞[41]。

    目前,由于人工合成的免疫調(diào)節(jié)藥物的具有毒副作用和成本高等缺點,其應(yīng)用推廣比較緩慢,因而植物源免疫調(diào)節(jié)肽成為研究熱點[42],并得到了廣泛應(yīng)用,如水解大豆蛋白能促進小鼠脾淋巴細胞的增殖;水解黃色豌豆種子蛋白可顯著提高腹腔巨噬細胞的吞噬活性[43]。

    研究發(fā)現(xiàn),植物源免疫調(diào)節(jié)肽通過與免疫細胞表面的受體直接結(jié)合而介導(dǎo),誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)細胞因子和抗體的產(chǎn)生,刺激淋巴細胞增殖,增強巨噬細胞的吞噬能力,或增強自然殺傷細胞的活性,提高機體抵抗病原體的防御能力[44],其作用方式與免疫調(diào)節(jié)肽的氨基酸組成、序列、電荷和疏水性有關(guān)[45],疏水性氨基酸、帶負電荷氨基酸和芳香族氨基酸,可提高肽的免疫調(diào)節(jié)活性[46],分子量小、帶正電荷多的免疫調(diào)節(jié)肽能更好的刺激淋巴細胞增殖[47]。

    4.4 其他功能

    自然界中的植物源功能活性多肽形式多樣、來源豐富,除上述3種功能活性肽外,還具有抑菌、抗糖尿病、降膽固醇等功能(表5)。

    表5 常見植物功能活性肽

    5 展望

    近年來,在國家大健康戰(zhàn)略的引領(lǐng)下,多肽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展迅速,植物源功能活性多肽的研究和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用得到迅速推廣。然而,植物源活性多肽的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。

    (1)多肽制備、提取工藝有待優(yōu)化。植物源功能活性多肽是由蛋白質(zhì)水解分離提取獲得,主要有酸水解和酶解兩種方式。酸水解工藝簡單,成本低,但氨基酸受損多、水解程序不易控制;酶解條件溫和,易控制,但蛋白酶解位點廣泛,酶解后產(chǎn)物不穩(wěn)定,需要通過多維分離制備,且在多維系統(tǒng)中流動相不相容,從而提高了分離成本[59]。常規(guī)的分離以膜分離為主,超濾技術(shù)主要用于多肽混合物的分級處理,根據(jù)分子量不同將其分為不同的組分,屬于初步分離;色譜法應(yīng)用十分廣泛,占分離工藝的70%以上,在色譜柱分離中,當(dāng)肽與流動相和固定相相互作用時,可能會引起肽的構(gòu)象變化[60]。可見,開發(fā)穩(wěn)定的制備、提取專用酶或進一步優(yōu)化多維分離制備工藝是今后植物源多肽的重要研究領(lǐng)域。

    (2)多肽標準體系亟待完善。2003年以來,國內(nèi)有關(guān)部門在多肽制備、分離和產(chǎn)品檢測等領(lǐng)域制定了相關(guān)標準16項(表1),包括6項國家標準、8項行業(yè)標準和4項企業(yè)標準,為多肽產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供有利的支撐。然而,隨著植物源多肽產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展,多肽的種類、組成和功能多種多樣,而當(dāng)前多肽產(chǎn)品的生產(chǎn)、質(zhì)量以及術(shù)語定義缺乏標準,需要盡快制定完成,以滿足國家多肽健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,也是貫徹落實我國《國家標準化發(fā)展綱要》的需要。

    總之,植物源功能活性肽資源十分豐富,其發(fā)展前景廣闊,是今后“大食物觀”和“大健康產(chǎn)業(yè)”研究和開發(fā)的熱點。

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