理筋手法干預(yù)對(duì)頸后肌慢性損傷家兔β-EP、 ENK、5-HT動(dòng)態(tài)變化的影響

袁蘭英 馬惠昇 穆靜 李嫚嫚 李彥雙 孫文靜

【摘 要】 目的：通過動(dòng)態(tài)觀察理筋手法對(duì)頸后肌慢性損傷家兔的中樞及外周疼痛調(diào)節(jié)因子β-內(nèi)啡肽（β-endorphin，β-EP）、腦啡肽（Enkephalin，ENK）與5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）表達(dá)的影響，探討在家兔頸部慢性損傷形成的早中晚不同階段，理筋手法的干預(yù)作用及其調(diào)節(jié)方式。方法：按照隨機(jī)數(shù)字表將63只日本大耳白兔分為正常對(duì)照組、模型組、干預(yù)組，每組各21只。采用頸椎前屈位固定法建立家兔頸后肌慢性損傷模型，模型組、干預(yù)組家兔均采取此法造模，模型組在每天造模結(jié)束后不予任何處理。干預(yù)組在每天造模結(jié)束后給予理筋手法干預(yù)，直至60 d觀察結(jié)束。正常對(duì)照組家兔不進(jìn)行造模干預(yù)。每組分別在觀察期的第20天（早期）、40天（中期）、60天（晚期）各處死7只家兔。通過HE染色光鏡下觀察頸后肌肌組織形態(tài)學(xué)變化，采用ELISA法檢測各組家兔中樞（脊髓、下丘腦）β-EP與ENK和外周（頸后肌組織、血漿）中β-EP與5-HT的在各觀察點(diǎn)處的含量。結(jié)果：HE染色光鏡下，模型組及各干預(yù)組可見不同程度的肌纖維損害;ELISA檢測：理筋手法干預(yù)后與模型組第20天、40天相比，干預(yù)組脊髓與下丘腦中β-EP、ENK含量有不同程度升高（P<0.05）;干預(yù)組外周頸后肌組織與血漿β-EP含量升高（P<0.05），5-HT含量降低（P<0.05）。結(jié)論：通過早中晚三期的動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)。理筋手法中早期干預(yù)能通過調(diào)節(jié)中樞ENK、β-EP及外周β-EP、5-HT的含量，減輕無菌性炎癥對(duì)局部組織的炎癥刺激，減緩機(jī)體對(duì)疼痛刺激感受，緩解慢性靜力性損傷導(dǎo)致的疼痛。

【關(guān)鍵詞】 理筋手法;慢性損傷;中早期干預(yù);β-EP;5-HT;ENK

【中圖分類號(hào)】R228?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2022）06-0029-06

Effect of Li Jin Manipulation on Chronic Injury of Posterior Cervical Muscle

in Rabbits β-EP、ENK and 5-HT on the Dynamic Changes

YUAN Lanying1 MA Huisheng1，2* MU Jing1 LI Manman1 LI Yanshuang1 SUN Wenjing1

School of traditional Chinese medicine， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004，China

Abstract：Objective To dynamically observe the central and peripheral pain regulatory factors in rabbits with chronic injury of posterior cervical muscle by LiJing manipulation β- Ep，to investigate the effect of tendon regulating manipulation on the expression of EP， enkephalin （ENK） and 5-hydroxytryptamine （5-HT） in rabbits with chronic neck injury. Methods according to the random number table， 63 Japanese white rabbits were divided into normal control group， model group and intervention group， 21 rabbits in each group. The chronic injury model of posterior cervical muscle in rabbits was established by cervical anteflexion fixation. The model group and intervention group were established by this method， and the model group was not treated at the end of each day. The intervention group was given LiJing manipulation intervention at the end of modeling every day until the end of observation for 60 days. The rabbits in the normal control group were not intervened. Seven rabbits in each group were killed on the 20 th day （early）， 40th day （middle） and 60 th day （late） of the observation period. He staining was used to observe the morphological changes of posterior cervical muscle under light microscope， and ELISA was used to detect the central nervous system （spinal cord， hypothalamus） of rabbits in each group β- EP was correlated with ENK and peripheral （posterior cervical muscle tissue， plasma） β-EP and 5-HT were determined. Results HE staining light microscope， different degrees of muscle fiber damage could be seen in the model group and the intervention groups; ELISA detection： compared with the model group 20 days and 40 days after the intervention， there was no significant difference between the spinal cord and hypothalamus in the intervention group β- EP and ENK increased in different degrees （P<0.05）; Peripheral posterior cervical muscle tissue and plasma in intervention group β-EP content increased （P<0.05）， 5-HT content decreased （P<0.05）. Conclusion through the dynamic observation of the early， middle and late stages， it is found that. Early intervention can regulate central ENK、β-EP and peripheral β-EP and 5-HT can reduce the inflammatory stimulation of aseptic inflammation to local tissue， slow down the bodys feeling of pain stimulation， and relieve the pain caused by chronic static injury.3279B876-4376-42C3-901C-A70546950AAD

Key words：Li Jin Manipulation; Chronic Injury; Intervention; β-EP;5-HT;ENK

隨著工作和生活中電子設(shè)備的廣泛應(yīng)用，教師及職場工作者等人群持續(xù)長時(shí)間低頭伏案工作頻率大大增加[1]。頸部采取低頭位、頸前伸的姿勢(shì)，來代償頸部胸鎖乳突肌、斜方肌、頸后肌群高度緊張現(xiàn)象，造成出現(xiàn)頸部自覺不適、頸后肌群僵硬疼痛、頭痛等問題[2-3]。雖然在疼痛初期經(jīng)休息后可緩解，但是易復(fù)發(fā)，長期持續(xù)會(huì)誘發(fā)頸部疾病產(chǎn)生，增加了治療成本，又對(duì)人們的工作生活產(chǎn)生長期的影響[4-5]。唐代孫思邈在《備急千金要方·卷九》中指出：“凡人有少苦似不如平常，即須早道，當(dāng)若隱忍不治，希望自差，須臾之間，已成痼疾?！盵6]也認(rèn)為當(dāng)身體出現(xiàn)不適時(shí)，如果勉強(qiáng)忍受不進(jìn)行干預(yù)，過不了多久不適感就會(huì)形成頑疾。因此，當(dāng)處于未病的狀態(tài)時(shí)就要通過干預(yù)防止其進(jìn)一步發(fā)展成為疾病，實(shí)現(xiàn)“上醫(yī)醫(yī)未病之病”理念的同時(shí)解除患者的痛苦。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，中樞鎮(zhèn)痛機(jī)制中激活內(nèi)源性阿片肽ENK與β-EP能夠達(dá)到鎮(zhèn)痛的作用，外周中β-EP、5-HT作為經(jīng)典的致痛遞質(zhì)，也參與痛敏形成的過程。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)理筋手法干預(yù)治療頸后肌慢性損傷療效顯著[9]，但其如何發(fā)揮干預(yù)疾病形成的機(jī)制尚不明確。本研究通過建立家兔頸后肌慢性損傷模型，研究理筋手法對(duì)家兔頸后肌慢性損傷相關(guān)因子β-EP、ENK、5-HT含量的影響，探索理筋手法對(duì)人頸后肌慢性損傷的干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用普通級(jí)健康日本大耳家兔63只，6月齡，雌雄各半，體重（2.0±0.5）kg，由陜西君行生物科技有限公司提供[許可證號(hào)：SCXK（陜）2017-001]，在寧夏醫(yī)科大學(xué)雙怡校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用家兔分籠飼養(yǎng)，食用標(biāo)準(zhǔn)兔飼料和水，自由飲食。室溫15～20 ℃，濕度50%～60%。

1.2 分組及造模方法 63只成年家兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，在觀察其飲食、糞便、活動(dòng)均無異常后開始實(shí)驗(yàn)。按照標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)數(shù)字表法，將63只家兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組組、模型組、干預(yù)組，每組21只。由專人定時(shí)定量喂養(yǎng)。根據(jù)前期課題組實(shí)驗(yàn)，參照劉志華等[10]所改良的頸部模型固定架建立兔頸后肌慢性損傷模型。根據(jù)前期課題組對(duì)兔慢性靜力性損傷造模方式、造模持續(xù)時(shí)間的反復(fù)研究，最終采用每日1次，一次5 h，固定60 d的方式進(jìn)行慢性靜力性損傷造模。

1.3 干預(yù)方法 正常對(duì)照組組家兔正常飼養(yǎng)，不進(jìn)行造模與干預(yù)。模型組家兔在每天造模結(jié)束后不予任何處理。干預(yù)組家兔在每天造模結(jié)束后，立即給予理筋手法干預(yù);由專業(yè)人員先在推拿手法測定儀上進(jìn)行手法力量、頻率等動(dòng)力學(xué)參數(shù)訓(xùn)練，待松筋、順筋手法的動(dòng)力學(xué)參數(shù)穩(wěn)定后對(duì)家兔頸后肌處施以松筋、撥筋、順筋的手法治療，治療時(shí)手法刺激量以家兔不躁動(dòng)為宜。理筋手法干預(yù)每天1次，每次10～15 min。

1.4 組織標(biāo)本的采集 在造模后的第20天、40天、60天對(duì)各組家兔經(jīng)耳緣靜脈采集靜脈血10 mL，于-20 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆??？諝馑ㄈㄌ幩栏鹘M家兔，剝離頸后皮膚充分暴露頸后肌，取1 cm×1 cm×0.5 cm頸后肌組織，生理鹽水沖洗后放入標(biāo)記好的包埋盒中，然后置于4%的多聚甲醛固定液中，用于HE染色。將頸段的肌肉與脊柱撥離，用咬骨剪小心剪下頸段脊柱，并用棉簽取出頸段脊髓快速置于EP管中。再取出兔的下丘腦置于EP管中。將取好的樣本快速放入-80 ℃低溫冰箱保存，用于ELISA檢測。

1.5 HE染色觀察頸后肌組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化 將4%的多聚甲醛固定液中的肌組織，按照操作順序，依次脫水、浸蠟、包埋、切片、染色后，再經(jīng)脫水、透明、封固后在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞核、胞漿、纖維組織染色情況，觀察炎癥、炎細(xì)胞浸潤情況。

1.6 ELISA分別檢測頸部中樞β-EP、ENK及外周β-EP與5-HT含量 檢測頸后肌組織、脊髓、下丘腦中β-EP、ENK與5-HT含量時(shí)，從-80°低溫冰箱中快速取出各類待測標(biāo)本，融化后維持在4 ℃左右，加入一定量PBS將標(biāo)本進(jìn)行勻漿處理，勻漿充分后，2000 r·min-1離心20 min，收集上清。按照β-EP、ENK、5-HT的ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，于450 nm波長處在酶標(biāo)儀上讀取各孔的吸光度（OD）值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

檢測血漿中β-EP與5-HT含量，取出-80 ℃存放的血漿，恢復(fù)至4 ℃左右后添加抗凝劑EDTA混合15 min，2000 r/min離心20 min，收集上清。使用ELISA試劑盒檢測血漿中β-EP與5-HT含量，方法同上。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。區(qū)組間多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組內(nèi)不同觀察點(diǎn)采用重復(fù)測量的方差分析，假設(shè)檢驗(yàn)采用雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 家兔頸后肌局部組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化 在光學(xué)顯微鏡下觀察肌纖維如圖1所示，正常對(duì)照組處頸后肌肌纖維整齊排列，間隙大致相同。第20天時(shí)模型組出現(xiàn)肌原纖維排列紊亂、肌絲扭曲的現(xiàn)象;干預(yù)組相較于模型組，肌原纖維紊亂程度較輕;第40天模型組可見肌原纖維排列紊亂、疏松，肌間隙不規(guī)則增寬變窄，有少量炎性細(xì)胞浸潤;干預(yù)組可見局部肌原纖維排列紊亂、扭曲程度較輕，肌間隙增寬;第60天模型組可見肌原纖維排列紊亂、大幅度扭曲變形，間隙不規(guī)則變窄，大量炎性細(xì)胞浸潤;干預(yù)組肌纖維變化較模型組肌纖維排列紊亂、扭曲幅度小。

2.2 各組家兔頸部中樞（脊髓與下丘腦）內(nèi)β-EP含量的比較 如表1所示，組間比較中，與正常對(duì)照組兔中樞β-EP含量相比，同期三個(gè)觀察點(diǎn)處模型組β-EP含量均降低（P<0.05）;與模型組中樞β-EP含量相比，第40天時(shí)，干預(yù)組脊髓β-EP含量升高（P<0.05）;第60天時(shí)，干預(yù)組下丘腦β-EP 含量升高（P<0.05）。組內(nèi)比較中，與模型組第40天中樞β-EP含量相比，第60天脊髓β-EP含量升高（P<0.05）。與干預(yù)組第40天中樞β-EP含量比較，第20天下丘腦β-EP含量升高（P<0.05）。3279B876-4376-42C3-901C-A70546950AAD

2.3 各組家兔頸部中樞（脊髓與下丘腦）內(nèi)ENK含量的比較 如表2所示，組間比較中，與正常對(duì)照組兔中樞ENK含量相比，同期三個(gè)觀察點(diǎn)處模型組含量均降低（P<0.05）;與模型組中樞ENK 含量相比，同期三個(gè)觀察點(diǎn)處，干預(yù)組ENK 含量升高（P<0.05）。組內(nèi)比較中，與模型組第40天中樞ENK含量相比，第60天ENK含量降低（P<0.05）。與干預(yù)組第40天比較，第20天、 60天下丘腦ENK含量均降低（P<0.05）。

2.4 各組家兔頸部外周（頸后肌組織與血漿）內(nèi)β-EP含量的比較 如表3所示，組間比較中，與正常對(duì)照組兔外周β-EP含量相比，同期三個(gè)觀察點(diǎn)處模型組含量均降低（P<0.05）;與模型組外周β-EP含量相比，同期三個(gè)觀察點(diǎn)處，干預(yù)組頸后肌組織、血漿β-EP含量升高（P<0.05）。組內(nèi)比較中，與模型組、干預(yù)組第40天外周β-EP含量相比，第20天β-EP含量均升高（P<0.05）。

2.5 各組家兔頸部外周（頸后肌組織與血漿）中5-HT含量比較 如表4所示，組間比較中，與正常對(duì)照組兔外周5-HT含量相比，同期三個(gè)觀察點(diǎn)處模型組頸后肌組織5-HT含量升高（P<0.05），第40天、60天時(shí)，模型組血漿5-HT含量升高（P<0.05）;與模型組外周5-HT含量相比，同期三個(gè)觀察點(diǎn)處，干預(yù)組5-HT含量降低（P<0.05）。組內(nèi)比較中，與模型組第40天外周5-HT含量相比，第20天時(shí)頸后肌組織5-HT含量降低（P<0.05），第60天時(shí)血漿中5-HT含量升高（P<0.05）。與干預(yù)組第40天外周5-HT含量相比，在第20天頸后肌組織5-HT含量升高（P<0.05）。

3 討論

慢性靜力性損傷是一種長期逐漸積累的細(xì)微損傷，國外學(xué)者[11]主要通過物理治療配合藥物治療來緩解局部疼痛不適，物理療法主要依據(jù)肌膜學(xué)、人體力學(xué)、人體解剖學(xué)理論進(jìn)行治療。理筋手法是國外損傷醫(yī)學(xué)與中醫(yī)學(xué)肌膜理論的高度融合形成的專門針對(duì)筋傷類疾病的治療方法，針對(duì)性強(qiáng)，臨床療效顯著。課題組在長期的臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)理筋手法在治療頸椎病中能夠明顯緩解疼痛、提高人們的生活質(zhì)量，能夠治療頸部筋傷，明顯減輕頸部酸痛不適，改善患者頸部活動(dòng)度（總治愈率>90%）[12]。本實(shí)驗(yàn)通過建立家兔頸后肌慢性靜力性損傷模型，采用理筋手法進(jìn)行，通過觀察中樞（脊髓、下丘腦）中β-EP、ENK和外周（頸后肌組織、血漿）中β-EP、5-HT含量的變化，探討采用理筋手法干預(yù)對(duì)慢性靜力性損傷的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)通過一般形態(tài)學(xué)觀察可觀察到干預(yù)組第40天時(shí)肌原纖維紊亂、扭曲程度較模型組有明顯改善，說明理筋手法在損傷中早期時(shí)就進(jìn)行干預(yù)，能夠減輕肌纖維的扭曲、變形，減緩炎性細(xì)胞浸潤的速度，從而縮短骨骼肌靜力性損傷后的修復(fù)時(shí)間。

β-EP亦稱安多芬或腦內(nèi)啡，是一種內(nèi)成性（腦下垂體分泌）的類嗎啡生物化學(xué)合成物激素。β-EP是存在于體內(nèi)鎮(zhèn)痛作用最重要的內(nèi)源性阿片肽，主要作用于β受體而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。由于β-EP肽鏈不易受酶裂解，故較其他種類內(nèi)源性阿片肽增多了與受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)，因此鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)而持久。陳艷偉[13]研究發(fā)現(xiàn)，手法鎮(zhèn)痛是刺激施術(shù)部位局部肌肉內(nèi)β-EP的含量增加而達(dá)到鎮(zhèn)痛的效果。尚坤等[14]通過背部推拿療法有效促進(jìn)β-EP 在體內(nèi)的合成、分泌與分布，從而發(fā)揮其預(yù)防疾病、保健身體的作用。本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)理筋手法干預(yù)后，理筋手法干預(yù)組的β-EP含量均有不同程度的升高，說明理筋手法能夠通過調(diào)控β-EP含量的表達(dá)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用;其中與模型組第40天脊髓β-EP含量相比，干預(yù)組第40天脊髓β-EP含量顯著升高，說明理筋手法在干預(yù)中期能夠通過合成或釋放脊髓中β-EP物質(zhì)，而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。在干預(yù)組中期下丘腦中β-EP含量與模型組相比有所下降，可能是由于局部炎癥刺激所導(dǎo)致。與模型組相比，干預(yù)組早中晚三期外周（軟組織、血漿）中β-EP含量均有顯著差異（P<0.05）;說明理筋手法干預(yù)能夠激活內(nèi)源性鎮(zhèn)痛物質(zhì)，促進(jìn)β-EP的升高，抑制痛覺信號(hào)的釋放和傳遞，實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛作用。

ENK又稱腦啡肽，是一種內(nèi)源性阿片肽類物質(zhì)，是中樞系統(tǒng)中主要參與機(jī)體內(nèi)疼痛反應(yīng)調(diào)節(jié)的主要內(nèi)源性鎮(zhèn)痛物質(zhì)。ENK在脊髓中釋放能夠抑制傷害性P物質(zhì)的釋放[15]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組、模型組ENK的含量均降低，可能是慢性靜力性損傷導(dǎo)致的積累性損傷產(chǎn)生痛覺過敏，導(dǎo)致疼痛持續(xù)時(shí)間長，使表達(dá)量均有降低。但是經(jīng)理筋手法干預(yù)后，中早期干預(yù)組ENK的含量均顯著升高;晚期下丘腦ENK的含量降低;理筋手法干預(yù)40 d較干預(yù)60 d ENK的含量有所降低;說明在中期理筋手法干預(yù)能夠促進(jìn)中樞內(nèi)源性阿片肽類物質(zhì)的釋放，鎮(zhèn)痛作用明顯。晚期下丘腦ENK的含量降低可能是由于在干預(yù)晚期ENK上行與內(nèi)源性阿片肽β-EP共同作用使下丘腦中ENK含量降低，共同抑制致痛性物質(zhì)釋放，從而達(dá)到減輕疼痛的目的。

5-HT又稱為血清素（Serotonin），它既是一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，也是一種血管活性物質(zhì)。5-HT作為目前已知的神經(jīng)遞質(zhì)之一，在中樞和外周中均有分布，但是由于分布位置不同所以對(duì)疼痛的刺激性大不相同。其中外周5-HT主要由胃腸道的APUD細(xì)胞產(chǎn)生，釋放入血，由血小板提取并儲(chǔ)存在體內(nèi)，在一定條件下釋放入血，有較強(qiáng)的收縮血管與平滑肌的作用，還能夠促進(jìn)凝血，增加血管內(nèi)膜通透性。同時(shí)外周5-HT受體能夠形成下行的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與疼痛信號(hào)的傳導(dǎo)，在外周的局部能夠起到誘發(fā)甚至加重疼痛的作用[16]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同期三個(gè)觀察點(diǎn)處，模型組5-HT含量均升高，說明外周5-HT在痛覺傳輸中能夠發(fā)揮重要的致痛作用;同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在造模40 d時(shí)，模型組5-HT含量高于正常對(duì)照組5-HT含量、干預(yù)組。說明經(jīng)理筋手法干預(yù)后能夠降低外周5-HT的合成釋放，減少激活神經(jīng)末梢受體產(chǎn)生疼痛刺激。并且中早期就進(jìn)行理筋手法干預(yù)，降低5-HT的合成和釋放的效果顯著。在與前期課題組研究[17]中發(fā)現(xiàn)外周血中游離的5-HT 是強(qiáng)烈的致痛物質(zhì)，當(dāng)機(jī)體受到傷害刺激時(shí)，游離的5-HT含量升高，引起疼痛刺激效應(yīng)的結(jié)論一致，再次印證了降低外周血漿中5-HT含量對(duì)降低疼痛刺激的重要性。3279B876-4376-42C3-901C-A70546950AAD

綜上所述，理筋手法可通過升高中樞（脊髓、下丘腦）β-EP、ENK、外周（頸后肌組織、血漿中）β-EP的表達(dá)量，降低外周（頸后肌組織、血漿中）5-HT的表達(dá)量，參與中樞、外周的鎮(zhèn)痛過程。但是其中影響疼痛遞質(zhì)的具體調(diào)控機(jī)制尚不明確，后期還將對(duì)這一問題進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2021-08-04 編輯：劉 斌）3279B876-4376-42C3-901C-A70546950AAD