脈沖電磁場通過Wntβ-catenin信號通路改善膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥反應(yīng)的機制

柏中喜，方興剛，馬龍祥，賀昱霖

十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院）康復(fù)中心水療理療科，湖北十堰 442000

前言

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（膝骨關(guān)節(jié)炎）作為最常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，嚴(yán)重影響患者的正常生活，導(dǎo)致活動受限，生活無法自理等［1］。脈沖電磁場對患者的初期病癥有一定的治療作用［2-3］。有研究表明，Wntβ-catenin信號通路在膝骨關(guān)節(jié)炎中易被激活，從而調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)等的分解和代謝［4-5］。將Wntβ-catenin信號通路作為治療膝骨關(guān)節(jié)炎的靶點是目前亟待解決的關(guān)鍵性問題。本研究選取90只SD大鼠構(gòu)建膝骨關(guān)節(jié)炎模型，探討脈沖電磁場通過Wntβ-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制改善膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥反應(yīng)的機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

本實驗選用SD 大鼠90 只，雌性，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所（北京華阜康生物科技有限公司），飼養(yǎng)環(huán)境為室溫，相對濕度控制在（50±5）%左右，12 h光照與12 h 黑夜交替。每天正常自由飲水進食并保持正?；顒樱∈筮m應(yīng)環(huán)境1周后開始實驗。所有大鼠的鼠齡及體重之間的差異不存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本實驗經(jīng)十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院）倫理委員會批準(zhǔn)進行，均按美國《實驗動物使用和處理指南》實施。

1.2 實驗分組

90 只大鼠隨機分為為正常組（n=30）、模型組（n=30）和脈沖電磁場組（n=30）。各組大鼠采用分籠飼養(yǎng)，除正常組，其他各組均進行膝骨關(guān)節(jié)炎建模。

1.3 膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型的構(gòu)建

實驗前各大鼠禁食禁水。將超凈工作臺紫外殺菌30 min，取濃度為10%的水合氯醛對大鼠做麻醉處理，將麻醉后的大鼠仰臥于實驗臺上，用碘伏消毒左后肢，于左側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)做長度約為2 cm 的縱形切口，分離皮下及肌肉組織，將關(guān)節(jié)囊打開后外翻髕骨，露出膝關(guān)節(jié)，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶同時切除掉內(nèi)側(cè)1/3的半月板，避免關(guān)節(jié)軟骨面出現(xiàn)損傷，將切口縫合后再次用碘伏消毒［6］。術(shù)后第2 天促進大鼠運動，每天30 min，連續(xù)4周即可。

1.4 脈沖電磁場治療

構(gòu)建大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型6周之后，用電腦骨傷治療儀（型號：XY-K-GS-III；生產(chǎn)廠家：河南翔宇醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）對大鼠進行脈沖電磁場治療：將兩個磁極分別固定于右膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)，設(shè)置頻率20 Hz，強度為8 mT，每次干預(yù)40 min，1 次/d，5 d/周，共計干預(yù)2 周即可。脈沖磁場的頻率、強度、作用時間、間隔等參數(shù)的選擇均來自文獻［7］。

1.5 觀測指標(biāo)及方法

1.5.1 大鼠局部皮溫、膝關(guān)節(jié)周徑和Lequesne MG 評分測定使用紅外測溫儀測量各組大鼠的左側(cè)膝關(guān)節(jié)局部溫度，用卷尺測量各大鼠的左膝關(guān)節(jié)周徑，局部溫度和膝關(guān)節(jié)周徑均測量3次，計算平均值。從局部疼痛刺激反應(yīng)、關(guān)節(jié)腫脹程度和關(guān)節(jié)活動范圍這3個方面完成Lequesne MG測定［8］。

1.5.2 大鼠Mankin's 評分制備切片后用二甲苯脫蠟，然后在不同濃度的酒精中浸泡5 min，蒸餾水沖洗2 min 后用甲苯胺藍染液染色10 min，將多余染液除掉，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片備用。于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠標(biāo)本軟骨以及基質(zhì)的失染程度。參照Mankin's評分標(biāo)準(zhǔn)，所得分值越高說明軟骨基質(zhì)失染程度越高，關(guān)節(jié)退變越嚴(yán)重；反之則表明軟骨基質(zhì)失染程度低，關(guān)節(jié)退變程度輕［9］。

1.5.3 大鼠軟骨細胞凋亡調(diào)控蛋白Western Blot檢測取各組大鼠右脛骨平臺全層軟骨，提取總蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別加入Caspase-3 和Caspase-8 單克隆抗體，在4℃的溫度下孵育24 h，再加入二抗在常溫下孵育2 h，DAB 顯色后，以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為參照，根據(jù)圖像分析軟件測定電泳條帶的光密度值（OD值），蛋白相對表達量=目的蛋白條帶OD值/GAPDH蛋白條帶OD值。

1.5.4 大鼠滑膜IL-1β、MMP-13、TNF-α表達測定取各組大鼠滑膜組織，加入磷酸鹽緩沖（1 g：10 mL）粉碎，于4°C 條件下以2 500 r/min 離心10 min，取上清液通過ELISA法同時結(jié)合促炎大鼠試劑盒分析炎性細胞因子表達，包括白細胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor α,TNF-α）和基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase,MMP-13）。在測定之前，均質(zhì)化冷凍組織樣品（50 nM Hepes，1 mM EDTA，150nM NaCl和1%Triton-X）。

1.5.5 大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt 和β-catenin mRNA 表達測定加入Trizol 試劑，從各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中提取總RNA。用分光光度法和1%瓊脂糖凝膠電泳測定RNA 的濃度和純度。利用PrimescriptTM RT 試劑盒和寡核苷酸引物將分離出的RNA反轉(zhuǎn)錄到cDNA，利用實時定量PCR 技術(shù)做分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參，采用2-△△ct 法分析Wnt 和β-catenin mRNA表達。

1.5.6 大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt 和β-catenin 蛋白表達測定取各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨，提取總蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別加入Wnt 和β-catenin 單克隆抗體，在4℃下孵育24 h，再加入二抗在常溫下孵育2 h，DAB顯色后，以GAPDH 作為參照，根據(jù)圖像分析軟件測定電泳條帶的OD 值，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶OD值/GAPDH蛋白條帶OD值。

1.5.7 大鼠線粒體膜電位的檢測利用熒光探針經(jīng)過JC-1 熒光染色對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞線粒體進行染色標(biāo)記后進行流式細胞儀測定，線粒體膜電位經(jīng)過流式細胞儀測定后可反映JC-1熒光染色強度變化，JC-1在線粒體內(nèi)形成的聚合物在流式細胞檢測中主要表現(xiàn)為紅色熒光染色。當(dāng)線粒體膜電位去極化發(fā)生異常改變時，線粒體以綠色熒光染色為主。對檢測得到的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞胞漿流式圖進行卡門的設(shè)置，可進一步將分離提純后大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞胞漿中所含有的關(guān)節(jié)軟骨細胞分離出來；再次進行流式細胞分析繪制流式圖，通過對比染色呈現(xiàn)紅色熒光線粒體與綠色熒光線粒體的熒光強度來反映大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞胞漿中線粒體的膜電位。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用%表示，組間比較用χ2分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠局部皮溫、膝關(guān)節(jié)周徑和Lequesne MG評分測定

相較于正常組，其余2組的局部皮溫、膝關(guān)節(jié)周徑和Lequesne MG評分均上調(diào)；脈沖電磁場組與模型組相對比，局部皮溫、膝關(guān)節(jié)周徑和Lequesne MG評分均下調(diào)，脈沖電磁場組優(yōu)于模型組。3組大鼠膝關(guān)節(jié)周徑和Lequesne MG評分的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；局部皮溫的差異則不存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.2 大鼠Mankin's評分

大鼠關(guān)節(jié)組織標(biāo)本染色圖顯示相比較于正常組，模型組和脈沖電磁場組大鼠的軟骨結(jié)構(gòu)、軟骨細胞、潮線完整性、甲苯胺藍染色加深（圖1）。由表2可知，模型組和脈沖電磁場組大鼠的Mankin's評分的總評分均上調(diào)。脈沖電磁場組與模型組相比，上述各指標(biāo)評分均下調(diào)，脈沖電磁場組優(yōu)于模型組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠局部皮溫、膝關(guān)節(jié)周徑和Lequesne MG評分（± s,n=30）Table 1 Local skin temperature,knee circumference and Lequesne MG score of rates in each group(Mean±SD,n=30)

表1 各組大鼠局部皮溫、膝關(guān)節(jié)周徑和Lequesne MG評分（± s,n=30）Table 1 Local skin temperature,knee circumference and Lequesne MG score of rates in each group(Mean±SD,n=30)

*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組脈沖電磁場組F值P值局部皮溫/℃36.98±0.22#38.77±0.39*37.10±0.85*0.554 0.721膝關(guān)節(jié)周徑/cm 9.92±0.85#12.58±0.51*11.09±0.34*#8.012 0.002 Lequesne MG評分/分0.00±0.00#5.17±0.43*2.50±1.27*#6.009 0.001

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)組織標(biāo)本染色圖Figure 1 Staining of rat joint tissue specimens in each group

2.3 大鼠軟骨細胞凋亡調(diào)控蛋白Western Blot檢測

相較正常組，其余2 組的軟骨細胞凋亡調(diào)控蛋白Caspase-3 和Caspase-8 均上調(diào)；脈沖電磁場組與模型組相比，上述各指標(biāo)評分均下調(diào)，脈沖電磁場組優(yōu)于模型組（P＜0.05）。詳見表3、圖2。

2.4 大鼠滑膜IL-1β、MMP-13、TNF-α表達測定

相較正常組，其余2 組的滑膜IL-1β、MMP-13、TNF-α 表達均上調(diào)；脈沖電磁場組與模型組相比，上述各指標(biāo)評分均下調(diào)，脈沖電磁場組優(yōu)于模型組（P＜0.05）。詳見表4。

2.5 大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt和β-catenin mRNA表達測定

相較正常組，其余2組的關(guān)節(jié)軟骨Wnt和β-catenin mRNA 表達均上調(diào)；脈沖電磁場組與模型組相比，上述各指標(biāo)評分均下調(diào)，脈沖電磁場組優(yōu)于模型組（P＜0.05）。詳見表5。

2.6 大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt和β-catenin蛋白表達測定

相較正常組，其余2 組的關(guān)節(jié)軟骨Wnt 和βcatenin 蛋白表達均上調(diào)；脈沖電磁場組與模型組相比，上述各指標(biāo)評分均下調(diào)，脈沖電磁場組優(yōu)于模型組（P＜0.05）。詳見表6、圖3。

2.7 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中線粒體膜電位的比較

相較正常組，其余2 組的關(guān)節(jié)軟骨線粒體膜電位

均下調(diào)；脈沖電磁場組與模型組相比，線粒體膜電位有所上調(diào)，脈沖電磁場組優(yōu)于模型組中（P＜0.05）。詳見表7。

表2 各組大鼠Mankin's評分（± s,n=30）Table 2 Mankin's score of rats in each group(Mean±SD,n=30)

表2 各組大鼠Mankin's評分（± s,n=30）Table 2 Mankin's score of rats in each group(Mean±SD,n=30)

*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組脈沖電磁場組F值P值軟骨結(jié)構(gòu)1.06±0.21#3.24±0.92*1.71±0.67*#20.012 0.001軟骨細胞0.95±0.13#2.43±0.57*1.38±0.41*#16.441 0.002潮線完整性0.52±0.09#1.66±0.52*1.10±0.34*#12.325 0.011甲苯胺藍染色0.12±0.09#2.71±0.65*1.24±0.43*#19.431 0.001總評分0.12±0.09#10.04±2.39*5.43±1.08*#26.003 0.001

表3 大鼠軟骨細胞凋亡調(diào)控蛋白表達（± s,n=30）Table 3 Expressions of proteins regulating chondrocytes apoptosis in rats(Mean±SD,n=30)

表3 大鼠軟骨細胞凋亡調(diào)控蛋白表達（± s,n=30）Table 3 Expressions of proteins regulating chondrocytes apoptosis in rats(Mean±SD,n=30)

*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組脈沖電磁場組F值P值Caspase-3/GAPDH 1.14±0.13#1.48±0.14*1.39±0.07*#16.723 0.001 Caspase-8/GAPDH 0.76±0.11#1.20±0.14*1.00±0.12*#19.002 0.001

圖2 大鼠軟骨細胞凋亡調(diào)控蛋白表達Figure 2 Expressions of proteins regulating chondrocytes apoptosis in rats

表4 大鼠滑膜IL-1β、MMP-13、TNF-α表達（± s,n=30）Table 4 Expressions of synovial IL-1β,MMP-13,TNF-α in rats(Mean±SD,n=30)

表4 大鼠滑膜IL-1β、MMP-13、TNF-α表達（± s,n=30）Table 4 Expressions of synovial IL-1β,MMP-13,TNF-α in rats(Mean±SD,n=30)

*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組脈沖電磁場組F值P值IL-1β（ng/mL）3.13±1.59#25.63±4.31*7.46±2.00*#18.435 0.001 TNF-α（ng/mL）0.73±0.03#2.53±0.24*1.04±0.89*#15.942 0.003 MMP-13（ng/mL）0.12±0.03#0.28±0.05*0.17±0.01*#18.115 0.001

表5 大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt和β-catenin mRNA 表達（± s,n=30）Table 5 Wnt and β-catenin mRNA expressions in rate articular chondrocytes(Mean±SD,n=30)

表5 大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt和β-catenin mRNA 表達（± s,n=30）Table 5 Wnt and β-catenin mRNA expressions in rate articular chondrocytes(Mean±SD,n=30)

*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組脈沖電磁場組F值P值Wnt mRNA 0.38±0.05#1.02±0.29*0.69±0.09*#19.880 0.001 β-catenin mRNA 0.26±0.05#1.59±0.21*0.93±0.12*#16.731 0.001

表6 大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt和β-catenin蛋白表達（± s,n=30）Table 6 Wnt and β-catenin protein expressions in rat articular chondrocytes(Mean±SD,n=30)

表6 大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt和β-catenin蛋白表達（± s,n=30）Table 6 Wnt and β-catenin protein expressions in rat articular chondrocytes(Mean±SD,n=30)

*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組脈沖電磁場組F值P值Wnt/GAPDH 0.44±0.10#1.37±0.58*0.82±0.39*#17.935 0.001 β-catenin/GAPDH 0.31±0.14#1.70±0.56*1.31±0.40*#15.031 0.001

圖3 大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt和β-catenin蛋白表達Figure 3 Wnt and β-catenin protein expressions in rat articular chondrocytes

表7 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中線粒體膜電位的比較（AU,± s,n=30）Table 7 Comparison of mitochondrial membrane potential in rat articular chondrocytes(AU,Mean±SD,n=30)

表7 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中線粒體膜電位的比較（AU,± s,n=30）Table 7 Comparison of mitochondrial membrane potential in rat articular chondrocytes(AU,Mean±SD,n=30)

*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組脈沖電磁場組F值P值線粒體膜電位0.51±0.08#0.12±0.02*0.39±0.09*#17.935 0.001

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎作為中老年人群常見的一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，常發(fā)于45 歲以上的人群［10］。目前有關(guān)膝骨關(guān)節(jié)炎的有效治療仍缺乏相應(yīng)的措施，脈沖電磁場在膝骨關(guān)節(jié)炎的治療中應(yīng)用頻率越來越高。然而，脈沖電磁場治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機制尚不完全明確［11］。Wntβ-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路一旦激活就會增加白細胞介素和腫瘤壞死因子的表達，促進MMP-13大量生成［12-13］。而MMP-13水平的異常升高又會作用于細胞外基質(zhì)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞，在促進膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用［14］。本研究表明經(jīng)過脈沖電磁場治療后患者的膝關(guān)節(jié)周徑、Lequesne MG 評分、Mankin's 評分、Wntβcatenin 表達以及滑膜IL-1β、MMP-13、TNF-α 水平均出現(xiàn)顯著的下調(diào)，降低了炎癥因子表達，抑制了Wntβ-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。與模型組比較，脈沖電磁場組膝關(guān)節(jié)周徑、Lequesne MG 評分和Mankin's 評分均下調(diào)（P＜0.05），這些指標(biāo)的變化說明抑制了膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠的炎癥反應(yīng)；與模型組比較，脈沖電磁場組滑膜IL-1β、MMP-13、TNF-α表達均下調(diào)，這些指標(biāo)的具體變化說明有效修復(fù)了軟骨損傷。

脈沖電磁場能在一定程度上促進速關(guān)節(jié)腔組織的有效修復(fù)，其主要原理是通過改變膜電位從而增加關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的通透性［15-16］，使局部組織出現(xiàn)一定程度的軟化，緩解膝關(guān)節(jié)的退行性改變，加速組織的新陳代謝［9］。Wntβ-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對關(guān)節(jié)的形成以及調(diào)控軟骨細胞功能發(fā)揮著重要的作用。βcatenin 作為Wntβ-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵組成部分，其在細胞內(nèi)的表達高低對膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展起著至關(guān)重要的作用［17-18］。Wntβ-catenin基因和蛋白的異常表達會引發(fā)軟骨細胞肥大化，出現(xiàn)終端分化。因此，Wntβ-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是治療膝骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵靶位點。

Wntβ-catenin 信號具有多種下游靶基因，包括控制細胞凋亡和壞死的基因，一旦啟動這些基因，細胞就會啟動凋亡或壞死程序［19-20］。而這些基因的啟動異常會造成細胞凋亡和壞死的異常，目前針對Wntβcatenin 信號對細胞凋亡的調(diào)控作用研究比較多，因其與腫瘤細胞的增殖有關(guān)。Wntβ-catenin 信號可上調(diào)被感染的巨噬細胞的促凋亡蛋白Bax的表達、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xl 和Mcl-1 的表達，并啟動主要依賴于Caspase 途徑的凋亡程序，導(dǎo)致細胞線粒體膜電位下降和Caspase-3 的活化，從而誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡。Wntβ-catenin 信號主要通過調(diào)節(jié)細胞周期調(diào)控基因Cyclin、凋亡抑制基因Survivin 的表達抑制一些癌細胞的凋亡；通過上調(diào)促凋亡蛋白BIM、Bax 和下調(diào)抗凋亡蛋白Mcl-1 的表達促進細胞凋亡；通過抑制炎性因子TNF-α 的過度分泌、下調(diào)活性氧ROS 的含量抑制細胞壞死。

綜上所述，脈沖電磁場能夠通過抑制膝骨關(guān)節(jié)炎中的Wntβ-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而降低骨關(guān)節(jié)細胞中炎癥因子的表達，延緩膝骨關(guān)節(jié)的進一步退化。