足細(xì)胞蛋白Podocalyxin水平在兒童紫癜性腎炎中的臨床意義及與臨床病理特征關(guān)系

龍安予，王玉，滑洋洋

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 病理科，河南 鄭州 450000)

紫癜性腎炎(HSPN)在腎病科臨床上屬于一種繼發(fā)性的腎小球腎炎，也是一種毛細(xì)血管的變態(tài)反應(yīng)性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要為過(guò)敏源引起免疫復(fù)合物形成累積于腎臟，誘發(fā)免疫性損傷及血管性炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致腎損傷。該疾病多見(jiàn)于兒童群體與青少年群體，其表現(xiàn)特點(diǎn)為腎功能異常﹑蛋白尿﹑血尿及浮腫等，同時(shí)可能出現(xiàn)發(fā)熱﹑關(guān)節(jié)痛﹑消化道癥狀﹑四肢深側(cè)面出血性紫癜等癥狀。多數(shù)患者預(yù)后良好，但也有部分患者發(fā)展為尿毒癥。經(jīng)過(guò)分析相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，兒童繼發(fā)性腎炎當(dāng)中有78.9%的患兒為HSPN。另外，在兒童過(guò)敏性紫癜之中，有40%左右的患兒在發(fā)病之后的4～6周的范圍之內(nèi)，會(huì)逐步的轉(zhuǎn)化成為HSPN，而過(guò)敏性紫癜患兒本身的腎損傷嚴(yán)重程度是決定患兒預(yù)后的關(guān)鍵，也是導(dǎo)致兒童期慢性腎臟疾病的重要原因之一。也有研究表明HSPN患者腎臟受累程度與發(fā)病年齡﹑腹痛癥狀﹑凝血因子X(jué)2活性等具有相關(guān)性。

腎活檢是目前判斷腎臟是否受累及受累程度的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于腎活檢的有創(chuàng)性，和無(wú)法進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察的特點(diǎn)，部分患兒家屬拒絕患兒接受該檢查，給HSPN早期診斷治療增加些許難度。臨床上腎小球疾病活動(dòng)和病變嚴(yán)重程度均以尿蛋白水平﹑血尿及白細(xì)胞尿出現(xiàn)為準(zhǔn)，尿蛋白也是被公認(rèn)為和腎臟疾病進(jìn)展有關(guān)的獨(dú)立因素之一。有研究結(jié)果表明足細(xì)胞數(shù)減少到一定比例后腎小球開始出現(xiàn)硬化過(guò)程，且足細(xì)胞可攝取濾過(guò)蛋白，對(duì)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行改變。足細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Podocalyxin也是目前人們較為關(guān)注的重點(diǎn)蛋白，其表達(dá)與腎臟病理﹑蛋白尿﹑血尿程度密切相關(guān)。足細(xì)胞腎小囊臟層上皮細(xì)胞，附著于腎小球基底膜的外側(cè)，連同腎小球基底膜和毛細(xì)血管內(nèi)皮一起構(gòu)成了腎小球血液濾過(guò)屏障。足細(xì)胞損傷，使其從腎小球基底膜脫落，破壞腎小球血液濾過(guò)屏障，導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生。由此可見(jiàn)，足細(xì)胞對(duì)維持腎小球正常生理功能也有著重要意義?；诖耍疚囊越谑罩蔚腍SPN患兒作為臨床研究對(duì)象，探究足細(xì)胞蛋白Podocalyxin與HSPN患兒足細(xì)胞損傷﹑病理分級(jí)以及臨床分型之間的關(guān)聯(lián)，探討足細(xì)胞蛋白Podocalyxin對(duì)兒童HSPN的診斷價(jià)值。

1 資料及方法

1.1 基本資料

將鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院自2018年1月～2020年6月間經(jīng)腎活檢最終確診為HSPN的患兒63例作為臨床研究對(duì)象，患兒在過(guò)敏性紫癜發(fā)病之后的6個(gè)月之內(nèi)，產(chǎn)生蛋白尿或(和)血尿的狀況，并給排除血小板減少性紫癜﹑系統(tǒng)性紅斑狼瘡﹑乙肝病毒相關(guān)的腎炎﹑IgA腎炎。依照《中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科腎臟學(xué)指定的HSPN診斷與治療草案》(2000年11月版)，將HSPN患兒分為：腎病綜合征﹑血尿和蛋白尿﹑孤立性蛋白尿癥；孤立性血尿癥。所有入組的63例患兒包括49例男性，14例女性，患兒的男女比例為3.5∶1；患兒年齡2～15歲，平均(8.51±3.24)歲。

1.2 研究方法

1.2.1 病理檢查方法

所有納入本研究的患兒均需要進(jìn)行經(jīng)皮腎臟活檢術(shù)，將腎活檢組織使用甲醛進(jìn)行固定，切片的厚度應(yīng)該控制在2 μm以內(nèi)，分別針對(duì)切片進(jìn)行Masson﹑PASM﹑PAS以及HE染色。除此之外，還需要針對(duì)腎組織展開免疫病理﹑電鏡以及光鏡檢查。所有的病理診斷均需要在同一具備診斷資格的機(jī)構(gòu)進(jìn)行，而且所有的病理診斷都需要由同一醫(yī)師來(lái)完成，并且確定病理分級(jí)。腎小球輕微異常值則判定為Ⅰ級(jí)；細(xì)胞單純性增生則判定為Ⅱ級(jí)，主要分成：(1)局灶/節(jié)段，(2)彌漫性；系膜增生，節(jié)段性病變(血栓﹑粘連﹑硬化﹑壞死)/伴有50%的腎小球新月體形成則為Ⅲ級(jí)，同樣分成兩種：(1)局灶/節(jié)段，(2)彌漫性；病變情況與Ⅲ級(jí)相同，腎小球新月體形成量50%～75%則為Ⅳ級(jí)，分成：(1)局灶/節(jié)段，(2)彌漫性；病變與Ⅲ級(jí)相同，腎小球呈現(xiàn)新月形病變的數(shù)量超過(guò)75%，則判定為Ⅴ級(jí)，分成：(1)局灶/節(jié)段，(2)彌漫性；膜增生性腎小球腎炎則為Ⅵ級(jí)。在電鏡觀察之下，腎小球足細(xì)胞損傷狀況，主要分成：無(wú)足突融合﹑足突階段融合(融合低于50%)﹑足突的廣泛融合(融合率超過(guò)50%)三種類型。

1.2.2 Podocalyxin檢測(cè)

檢驗(yàn)試劑盒選擇GBD公司生產(chǎn)的Podocalyxin ELASA試劑盒，所有患者均在腎組織活檢術(shù)之前的3 d之內(nèi)收集患兒起床后首次清潔中段尿液10 mL。之后將在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)經(jīng)過(guò)2 500 r/min，離心半徑12 cm的離心之后，取上清，并且將其置入-20℃環(huán)境之中，在此過(guò)程當(dāng)中需要避免反復(fù)的進(jìn)行融凍，待標(biāo)本收集量達(dá)到20例之后展開統(tǒng)一的檢驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 足細(xì)胞損傷與患兒尿液中Podocalyxin的檢測(cè)值相關(guān)性

以電鏡方式觀察腎小球足細(xì)胞損傷情況：18例患者的足突呈現(xiàn)出廣泛融合態(tài)勢(shì)，32例患兒呈現(xiàn)出足突的節(jié)段融合，9例無(wú)足突融合，另外4例患兒在電鏡觀察下未見(jiàn)腎小球。使用單因素方差分析足細(xì)胞損傷與患兒尿液中Podocalyxin的檢測(cè)值的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，隨著腎小球足細(xì)胞損傷的加重，患兒尿液中Podocalyxin的檢測(cè)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 足細(xì)胞損傷與患兒尿液中Podocalyxin的檢測(cè)值相關(guān)性(± s )

2.2 病理分級(jí)與Podocalyxin之間的關(guān)系

經(jīng)過(guò)病理檢驗(yàn)，患兒最終被確診為Ⅱ級(jí)﹑Ⅲ級(jí)HSPN，其中29例病理分級(jí)為Ⅱ級(jí)，占總數(shù)的46.03%；另有34例患兒的病理分級(jí)為Ⅲ級(jí)，占總數(shù)的53.97%，詳見(jiàn)圖1，圖2。通過(guò)針對(duì)納入本研究的63例患者展開尿液的Podocalyxin檢驗(yàn)，并與最終的腎活檢結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ⅲ級(jí)患兒的尿Podocalyxin值顯著高于Ⅱ級(jí)患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 Ⅱ級(jí)病變病理圖示

圖2 Ⅲ級(jí)病變病理圖示

表2 病理分級(jí)與Podocalyxin之間的相互關(guān)系

2.3 臨床分型與Podocalyxin之間的關(guān)聯(lián)

針對(duì)所有參與本臨床研究的63例患兒展開腎病理活檢，隨后進(jìn)行Podocalyxin檢驗(yàn)，在臨床上依照患者的臨床分型，并且經(jīng)過(guò)單方面的因素的方差展開分析，最終發(fā)現(xiàn)不同臨床分型的患兒的尿Podocalyxin值具有差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。

表3 臨床分型與Podocalyxin之間的關(guān)系表

3 討 論

HSPN是一種循環(huán)免疫復(fù)合物疾病，指過(guò)敏性紫癜累及腎臟后含IgA的免疫復(fù)合物沉積于腎小球引起的繼發(fā)性IgA腎病。國(guó)際小兒腎臟病研究協(xié)會(huì)根據(jù)HSPN的病理改變將其分為Ⅰ型﹑Ⅱ型﹑Ⅲ型﹑Ⅳ型﹑Ⅴ型﹑Ⅵ型，其中Ⅱ型﹑Ⅲ型﹑Ⅳ型﹑Ⅴ型又根據(jù)系膜增生程度分為(1)局灶/節(jié)段，(2)彌漫性。HSPN是臨床一種較為常見(jiàn)的血管炎性疾病，其臨床表現(xiàn)包括：腎小球損傷﹑關(guān)節(jié)痛﹑皮疹以及腹痛等。HSPN患者自身的腎小球損傷相對(duì)較為嚴(yán)重，可能會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞從尿液之中排出，因此尿液之中足細(xì)胞的數(shù)量則對(duì)于更好的反應(yīng)疾病的嚴(yán)重程度具備相對(duì)較高的價(jià)值。另外，臨床研究當(dāng)中關(guān)于足細(xì)胞損傷所導(dǎo)致的腎臟纖維化﹑腎小球硬化等相關(guān)的研究也相對(duì)較多，HSPN患兒繼發(fā)性腎臟損害及腎臟損害程度均與其預(yù)后有著密切聯(lián)系，因此HSPN患兒早期診斷對(duì)于其治療具有重要的意義。有研究數(shù)據(jù)表明，如果患者體內(nèi)的足細(xì)胞數(shù)量減少10%～20%，則表明患者自身的腎小球開始出現(xiàn)硬化。足細(xì)胞脫落時(shí)則表示腎小球受損，根據(jù)腎小球足細(xì)胞損傷情況可以很好的反映腎小球疾病的發(fā)展。另外，部分研究認(rèn)為，足細(xì)胞本身的陰電荷水平的整體下降或丟失，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白尿的出現(xiàn)或者足突發(fā)生融合。

足細(xì)胞是腎小球臟層上皮細(xì)胞，呈趾狀交叉覆蓋于腎小球基底膜最外層，與毛細(xì)血管相連構(gòu)成腎小球血液濾過(guò)屏障來(lái)抵御其血管內(nèi)靜水壓，可以起到維穩(wěn)與調(diào)節(jié)作用。因此，定期檢測(cè)尿中足細(xì)胞的脫落對(duì)評(píng)價(jià)腎小球疾病中的足細(xì)胞損傷具有重要的意義。Podcalyxin是一種富含負(fù)電荷的足細(xì)胞頂端膜蛋白，主要在腎小球上皮細(xì)胞中表達(dá)，是一種重要的足細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白，能在各種不同的腎小球疾病中上調(diào)表達(dá)。此外，Podcalyxin本身是足突頂端質(zhì)膜最為關(guān)鍵的組成部分之一，也是足突頂膜區(qū)主要的帶負(fù)電荷的唾液酸蛋白，其能夠保證足細(xì)胞本身的結(jié)構(gòu)以及其自身的濾過(guò)屏障。在我們的研究中，隨著腎小球足細(xì)胞損傷的加重，患兒尿液中Podocalyxin的檢測(cè)值升高，由此可見(jiàn)，尿液中Podocalyxin的水平可以用于反映HSPN患兒的足細(xì)胞的損傷程度。這個(gè)結(jié)論與彭曉杰等人的研究結(jié)果相一致。同時(shí)，經(jīng)過(guò)病理檢驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)本次研究對(duì)象主要為Ⅱ級(jí)﹑Ⅲ級(jí)HSPN患兒，且Ⅲ級(jí)患兒的尿Podocalyxin值顯著高于Ⅱ級(jí)患兒，差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們推測(cè)足細(xì)胞Podocalyxin與HSPN患兒的病理分級(jí)具有明顯的相關(guān)性，這個(gè)結(jié)論與任獻(xiàn)國(guó)等人的研究結(jié)論一致。由此可見(jiàn)，HSPN患兒尿液中的Podocalyxin的整體檢驗(yàn)價(jià)值相對(duì)較高，有望作為HSPN疾病的分子標(biāo)志物，評(píng)估兒童HSPN的足細(xì)胞損傷程度﹑病理分級(jí)的嚴(yán)重程度，預(yù)測(cè)兒童HSPN的臨床分型。

研究數(shù)據(jù)表明，尿液之中所排泄出來(lái)的Podocalyxin與患者的足細(xì)胞之間具有一定的相關(guān)性。另外，有相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，相較于尿蛋白，尿足細(xì)胞檢測(cè)能夠更直觀的反應(yīng)腎小球細(xì)胞的損傷程度。因此，Podocalyxin作為足細(xì)胞的一種標(biāo)志性蛋白，其檢測(cè)本身已經(jīng)顯示出了較為廣泛的應(yīng)用前景。對(duì)比有創(chuàng)性的腎組織活檢，尿Podocalyxin檢測(cè)的應(yīng)用更加的簡(jiǎn)單而且可行性更高。

通過(guò)針對(duì)本研究的相關(guān)結(jié)果進(jìn)行分析，最終證實(shí)：HSPN患兒自身的足細(xì)胞損傷與臨床病理分級(jí)之間呈現(xiàn)正相關(guān)，而且腎組織呈現(xiàn)病理性改變的患兒自身的足細(xì)胞損傷較為嚴(yán)重。此外足細(xì)胞Podocalyxin與HSPN患兒的足細(xì)胞損傷﹑病理分級(jí)和臨床分型之間具有明顯的相關(guān)性，有望成為HSPN患兒的臨床診斷標(biāo)志物。本研究針對(duì)所有參與本臨床研究的63例患兒展開腎病理活檢，隨后進(jìn)行Podocalyxin檢驗(yàn)，依照患者的臨床分型，并且經(jīng)過(guò)單方面的因素的方差展開分析，最終發(fā)現(xiàn)不同臨床分型的患兒的尿Podocalyxin值具有差異，因此本研究認(rèn)為尿Podocalyxin值，對(duì)于HSPN分型具備重要價(jià)值，可以作為臨床參考依據(jù)。