太子參復(fù)方對脾虛自汗大鼠的止汗作用及其機(jī)制研究

周春權(quán)　趙立　蔣暢　胡娟

【摘 要】目的：觀察太子參復(fù)方對脾虛自汗大鼠的止汗作用并探討其止汗機(jī)制。方法：采用利血平致脾虛大鼠的方法建立自汗模型，采用著色法觀察太子參復(fù)方對脾虛模型大鼠足趾汗液分泌的影響作用，分別用Western Blot法和RT-PCR法檢測大鼠腦組織中乙酰膽堿受體（AchR）及其受體mRNA的表達(dá)。結(jié)果：與模型對照組比較，太子參復(fù)方高、中劑量組能減少脾虛模型大鼠的汗點(diǎn)數(shù)目（P<0.05）;太子參復(fù)方高、中劑量組腦組織中AchR蛋白的表達(dá)明顯下降（P<0.01）;各給藥組腦組織中AchR mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.01）。結(jié)論：太子參復(fù)方具有一定的止汗效果，其止汗機(jī)制可能是通過抑制腦組織中AchR的蛋白表達(dá)和大腦神經(jīng)遞質(zhì)AChR基因的表達(dá)，從而抑制人外泌汗腺腺上皮細(xì)胞分泌汗液。

【關(guān)鍵詞】 太子參復(fù)方;脾虛自汗;乙酰膽堿;止汗機(jī)制

【中圖分類號】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2022）01-0021-05

Study on the Hidroschesis Effect on Spleen Deficient Rats and its Mechanism by Pseudostellaria Heterophylla Compound

ZHOU Chunquan¹ZHAO Li¹JIANG Chang¹HU Juan

1.Fujian Acaedemy of ?Chinese Medicine Sciences， Fuzhou 350003，China;

2.Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122，China

Abstract：Objective To observe the effect of hidroschesis on spleen deficient rats by Pseudostellaria heterophylla compound and explore its hidroschesis mechanism.?Methods The spleen deficient sweat model rats were established by reserpine.?Colouring method was used to observe sweat secretion by toes.?Acetylcholine receptor and its receptor mRNA expression were detected by Western Blot and RT-PCR method respectively.?Results Compared with model control group， high and middle dose of Pseudostellaria heterophylla compound group compound of can reduce the number of sweat secretion by spleen deficient model rats （P<0.05）; High and middle dose of Pseudostellaria heterophylla compound group reduced AchR protein expression in brain tissue significantly （P<0.01）; Each dosage group decreased AchR mRNA expression significantly in brain tissue （P<0.01）.Conclusion Pseudostellaria heterophylla compound has the effect of hidroschesis.?And its hidroschesis mechanism may be through inhibiting AchR protein expression in brain tissue and brain neurotransmitter AchR gene expression， thus inhibiting people outside secrete sweat gland secretion of sweat gland epithelial cells.

Key?words：

Heterophylla Compound;Spleen Deficiency and Spontaneous Sweating;Acetylcholine; Antiperspirant Mechanism

中醫(yī)認(rèn)為，汗是人體內(nèi)的津液受到陽氣的蒸騰氣化作用而從汗孔排出來的水液。在炎熱的天氣、室內(nèi)溫度過高、衣褥過厚或者精神緊張等情況下常常出現(xiàn)生理性多汗。如果出汗的部位、出汗量的多少、以及汗液的顏色和汗液的氣味發(fā)生改變，可以通過這些來判斷身體可能患的一些疾病。汗液生成與排泄的異常將導(dǎo)致多種汗證。自汗是由于人體陰陽失衡，腠理不固，而引起人體津液外泄失常所產(chǎn)生的病證。

太子參復(fù)方以福建道地藥材太子參、藍(lán)花參為原料。太子參具有益氣補(bǔ)脾和生津潤肺的功效;藍(lán)花參具有補(bǔ)虛健脾，補(bǔ)虛損，止自汗、盜汗，除虛熱，止咳化痰等功效。在中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論的指導(dǎo)下，合理組方;二者配伍共奏益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)虛健脾，具有治療脾虛自汗之功效。本文通過建立脾虛自汗大鼠模型，觀察太子參復(fù)方對脾虛自汗大鼠的止汗作用以及探討其止汗的機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量（180±20）g，上海伊萊克斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號：Scxk（瀘）2017-0005。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 和田-高垣氏試劑A、B（A液：碘濃度為2%無水乙醇溶液;B液：稱取可溶性淀粉50 g，加入100 mL花生油中混勻），硝酸毛果蕓香堿（國藥準(zhǔn)字 H42021102，批號：13110401，武漢五景藥業(yè)有限公司）;利血平注射液（國藥準(zhǔn)字 H12020905，批號：1210111，天津金耀氨基酸有限公司）; AchR抗體（Cell Signaling）、β-Actin抗體（Cell Signaling）、二抗（SAB））均購自CWbio.Co.Ltd公司。

1.3 儀器 電子天平（德國Sartorius），脫色搖床（海門其林貝爾），電泳儀（北京六一儀器廠），垂直電泳槽、轉(zhuǎn)印模塊（美國Bio-Rad），高速離心機(jī)（Thermo），NanoDrop 2000型分光光度計(jì)（Therno scientific），7500熒光定量PCR儀（ABI）。

1.4 藥物 太子參復(fù)方，本實(shí)驗(yàn)室自制，按專利進(jìn)行制備。全腦組織：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠處死，在冰面上迅速取出全腦，分裝于EP管內(nèi)，-80 ℃保存，備用。

2 方法

2.1 止汗作用實(shí)驗(yàn)

2.1.1 脾虛自汗大鼠模型的建立 采用利血平所致脾虛大鼠的方法建立模型，動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按體重隨機(jī)分成5組，即：正常對照組，模型對照組，太子參復(fù)方高、中、低組。除正常對照組外，其余各組每天上午，以利血平0.5 mg·kg腹腔注射，連續(xù)14 d，制備脾虛型大鼠，并觀察動(dòng)物行為。

2.1.2 給藥與實(shí)驗(yàn) 給藥組于造模的第8天開始，每天下午灌胃給藥，正常對照組和利血平組給等體積的蒸餾水，太子參復(fù)方高、中、低組（2.4、1.2、0.6 g·kg），分別按成人臨床推薦劑量的5倍、10倍、20倍灌胃，連續(xù)給藥14 d。分別在開始給藥的第1、7、14天，末次給藥后45 min皮下注射毛果蕓香堿液35 mg·kg （正常組注射生理鹽水），15 min將動(dòng)物轉(zhuǎn)入固定器內(nèi)，右后足固定籠外，適應(yīng)15 min，用棉簽蘸上無水乙醇輕輕將足跖部污物擦拭干凈，于大鼠足跖部皮膚涂上和田-高恒氏試劑A液，待干燥后，再薄薄涂上B液，然后于15 min后用10倍放大鏡計(jì)數(shù)深紫色著色點(diǎn)（即汗點(diǎn)）的數(shù)目。

2.2 Western Blot法檢測乙酰膽堿受體的表達(dá)量實(shí)驗(yàn) 將腦組織剪切成小塊，稱重，按每20 mg組織加400 μL的比例加入裂解液，提取總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白含量，取相同質(zhì)量蛋白變性上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。封閉液封閉 2 h后置于一抗稀釋液[AchR（1∶300），β-actin（1∶1 000）]4 ℃過夜。次日洗膜，加入二抗稀釋液[SAB（1∶3000）]孵育 1 h，用化學(xué)發(fā)光法于暗室中曝光、顯影、定影。凝膠成像儀攝像后用image J軟件分析灰度值。

2.3 RT-PCR法檢測乙酰膽堿受體mRNA的表達(dá)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 引物設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)采用的AchR基因及內(nèi)參基因的引物序列。見表1。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟 將腦組織剪切成小塊，稱重，用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA;取RNA進(jìn)行電泳，檢測RNA的完整性;用DNase Ⅰ試劑盒對RNA中殘留的基因組DNA進(jìn)行消化處理;用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

2.3.3 Real-Time PCR進(jìn)行分析 用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采用2法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用 SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組數(shù)據(jù)間差異用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 太子參復(fù)方對脾虛自汗大鼠模型的影響 由表2可知，正常對照組與模型組比較，均有顯著性差異;而給藥組的高、中劑量組在第7天和第14天，止汗效果明顯，與模型組比較具有顯著性差異，低劑量組則差異不顯著。

3.2 太子參復(fù)方對脾虛大鼠體重的影響 由表3可知，實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體重差異無顯著性，造模后，模型組及3個(gè)太子參復(fù)方劑量組大鼠體重增長幅度較正常對照組下降（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)后， 3個(gè)太子參復(fù)方劑量組大鼠的體重略高于模型組，說明本方具有一定健脾效果，但其與模型組之間的差異無顯著性，可能服藥時(shí)間較短，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長，健脾效果更顯著，對大鼠體重影響更大。

3.3 太子參復(fù)方對脾虛自汗模型大鼠的AchR蛋白含量影響 經(jīng)過Western Blot 分析曝光及洗片后結(jié)果如圖1所示。

計(jì)算乙酰膽堿受體的相對灰度值，采用公式：乙酰膽堿受體的相對灰度值=乙酰膽堿受體灰度值/肌動(dòng)蛋白灰度值，計(jì)算結(jié)果見表4。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠腦組織AchR蛋白的表達(dá)明顯增加，不同劑量太子參復(fù)方能不同程度降低模型大鼠腦組織中AchR蛋白的表達(dá)，與模型組比較，太子參復(fù)方高、中劑量組AchR蛋白的表達(dá)明顯下降（P<0.01）。

3.4 RNA完整性及純度檢測 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，28 s和18 s rRNA條帶清晰明亮，表明RNA完整性良好，微量紫外分光光度計(jì)測定RNA的吸光度，其OD260/280值均在1.8～2.1之間，表明RNA純度較高，無雜質(zhì)污染（圖2）。

3.5 Real-Time PCR檢測結(jié)果 各樣本目的基因和內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增曲線和溶解曲線圖（圖3、圖4）顯示引物特異性良好。

3.6 相對定量分析結(jié)果 按照2-相對定量法，計(jì)算各樣品的目的基因相對定量結(jié)果，即各個(gè)樣品對于對照樣品，目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異，與正常對照組比較，模型組大鼠AchR mRNA表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組AchR mRNA表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。提示太子參復(fù)方能夠下調(diào)脾虛自汗大鼠大腦中AchR mRNA，表達(dá)結(jié)果如表5所示。

4 討論

利血平是屬于外圍交感神經(jīng)抑制藥或去甲腎上腺素能神經(jīng)末梢阻斷藥，利血平能夠抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)的功能，使得副交感神經(jīng)系統(tǒng)的功能就相對占優(yōu)，就會(huì)出現(xiàn)和中醫(yī)脾虛證有高度相似的癥狀，如鼻粘膜血管擴(kuò)張而鼻塞，消化功能亢進(jìn)而致大便次數(shù)增多、胃酸分泌增加、潰瘍病等。利血平可用于多種動(dòng)物制成脾虛模型，其表現(xiàn)的癥狀與人類最常見脾虛證型很相似。這種造模方法簡單易行，可靠性和重現(xiàn)性強(qiáng)。同時(shí)其發(fā)病機(jī)制有相當(dāng)一部分與膽堿能神經(jīng)功能亢進(jìn)、植物神經(jīng)功能紊亂有關(guān)。出汗是一種植物神經(jīng)調(diào)控性活動(dòng)，交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)是調(diào)節(jié)人體內(nèi)臟功能的神經(jīng)裝置，其功能為調(diào)節(jié)心肌、平滑肌和腺體（包括消化腺、汗腺、部分內(nèi)分泌腺）的活動(dòng)，一般汗腺由交感神經(jīng)支配。交感和副交感神經(jīng)節(jié)前纖維釋放的遞質(zhì)是乙酰膽堿。故神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的變化可能是調(diào)控機(jī)體汗腺出汗量的機(jī)理之一。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大鼠在經(jīng)過注射利血平之后，出現(xiàn)了明顯的體重下降的情況，說明大鼠產(chǎn)生了脾虛的癥狀，脾虛后的大鼠在注射毛果蕓香堿液之后，汗液的量有明顯的增加，表明脾虛自汗模型大鼠的成功建立。本研究對太子參復(fù)方的止汗機(jī)制進(jìn)行了初步探討，實(shí)驗(yàn)中檢測到正常的大鼠也有微量的AchR mRNA 表達(dá)，刺激脾虛自汗模型造模后，大腦內(nèi)AchR表達(dá)顯著增高，說明脾虛自汗能激活A(yù)chR信號通路的活化，但是否直接激活，還有哪些參與作用的相關(guān)蛋白，有待下一步繼續(xù)研究。

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（收稿日期：2021-05-06 編輯：陶希睿）