孫邦耀 邵昱昊 高琦 李海 劉勝旺

摘要[目的]研究抑癌基因p53小分子抑制劑PFT-α對ILTV侵染宿主細(xì)胞的影響。[方法]用PFT-α處理LMH（雞肝癌細(xì)胞），通過結(jié)晶紫染色技術(shù)檢測細(xì)胞感染ILTV 24 h后的細(xì)胞死亡情況，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測PFT-α對ILTV吸附、進(jìn)入LMH細(xì)胞的影響，通過倒置熒光顯微鏡和高內(nèi)涵細(xì)胞篩選系統(tǒng)檢測PFT-α對ILTV在細(xì)胞間擴(kuò)散的影響。[結(jié)果]結(jié)晶紫染色表明，PFT-α促進(jìn)了ILTV感染后的細(xì)胞死亡，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，PFT-α對ILTV吸附細(xì)胞沒有影響，但是促進(jìn)了ILTV進(jìn)入細(xì)胞。同時，倒置熒光顯微鏡和高內(nèi)涵細(xì)胞篩選系統(tǒng)檢測結(jié)果表明，PFT-α對ILTV在細(xì)胞間擴(kuò)散沒有影響。[結(jié)論]研究初步檢測了PFT-α對ILTV侵染LMH細(xì)胞過程的影響，為進(jìn)一步研究ILTV與宿主互作過程提供了理論補(bǔ)充。

關(guān)鍵詞傳染性喉氣管炎病毒；病毒吸附；病毒進(jìn)入；病毒擴(kuò)散

中圖分類號S852.65文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2018）05-0087-04

Abstract[Objective]To research the effect of PFTα， a p53 inhibitor， on laryngotracheitis virus（ ILTV） infecting host cells.[Method]In present study， we detected the effect of PFTα on cell death， ILTV binding and penetration as well as transmission between LMH cells by stained with 0.1% crystal violet， flow cytometry and observing expression of EGFP using fluorescence microscopy and Operetta CLS highcontent analysis system. [Result]Crystal violet staining result showed that PFTα promoted LMH cells death after ILTV infection. Flow cytometry results showed that PFTα had no effect on viral binding but promoted penetration of ILTV. Results of both fluorescence microscopy observation and Operetta CLS highcontent analysis system showed that PFTα had no effect on ILTV transmission between LMH cells. [Conclusion]Our findings have advanced our understanding about how ILTV infection host cells and provided another promising option for controlling AILT.

Key wordsInfectious laryngotracheitis virus；Virus binding；Virus penetration；Virus transmission

雞傳染性喉氣管炎（avian infectious laryngotracheitis，AILT）是雞的一種高度接觸性傳染病，其臨床癥狀主要包括呼吸困難、咳嗽和產(chǎn)蛋下降等[1]。該病于1925年被首次報道于美國，目前分布于世界各地[2]。AILT的病原為傳染性喉氣管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus，ILTV），屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）α亞科（Alphaherpesvirinae）中的雞皰疹病毒1型（Gallid herpesvirus 1）[3]。ILTV為線性雙股DNA囊膜病毒，直徑為195～250 nm。

和其他α皰疹病毒一樣，ILTV在急性入侵上呼吸道后會潛伏于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，從而逃避宿主免疫監(jiān)視，當(dāng)宿主免疫力低下時ILTV又從潛伏狀態(tài)中激活，造成疫情暴發(fā)。當(dāng)前，AILT防疫主要依靠接種減毒活疫苗所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，但給雞群注射減毒活疫苗時也存在散毒的風(fēng)險，引起機(jī)體潛伏感染，從而逃避宿主免疫監(jiān)視，使得清除困難[4]，因此難以長效地防制AILT。研究ILTV侵染宿主細(xì)胞的過程能幫助人們更深入地理解ILTV的傳播與致病機(jī)理[5]，從而為AILT的防制提供新的思路。有研究表明，在ILTV感染機(jī)體的過程中，細(xì)胞免疫應(yīng)答而非體液免疫應(yīng)答起到?jīng)Q定性作用[6]，因此研究ILTV在細(xì)胞間的擴(kuò)散顯得尤為重要。該研究通過結(jié)晶紫染色、流式細(xì)胞術(shù)、倒置熒光顯微鏡以及高內(nèi)涵細(xì)胞篩選系統(tǒng)檢測了抑癌基因p53小分子抑制劑PFT-α對ILTV吸附和進(jìn)入LMH細(xì)胞、ILTV在LMH細(xì)胞間擴(kuò)散以及ILTV感染后的細(xì)胞死亡的影響，以期為研究ILTV侵染宿主過程提供試驗基礎(chǔ)，也為完善現(xiàn)有AILT防控體系提供新的思路。

1材料與方法

1.1材料與試劑

LMH細(xì)胞（雞肝癌細(xì)胞）、抗ILTV gI糖蛋白多克隆抗體、帶GFP標(biāo)簽的病毒株ILTV-EGFP為哈爾濱獸醫(yī)研究所禽呼吸道病創(chuàng)新團(tuán)隊實驗室保存；ILTV-EGFP的TCID50為10-4.56/0.1 mL；0.1%結(jié)晶紫染色液、紅色熒光染料Dil、R18及生物活性小分子PFT-α、FITC標(biāo)記的抗兔二抗均購自于Sigma公司；0.1 μm PVDF膜濾器購自于美國Millipore公司；所用離心機(jī)為Allegra X-15R臺式冷凍離心機(jī)（美國，Beckman Coulter）。

1.2結(jié)晶紫染色

以ILTV感染復(fù)數(shù)（病毒感染復(fù)數(shù)=感染性病毒顆粒/被感染細(xì)胞數(shù)，感染性病毒顆粒以PFU計算，PFU= TCID50×0.69[7]，下同）為0.1的劑量接種LMH細(xì)胞，并分別在ILTV感染前后各以PFT-α（20 μmol/L）處理細(xì)胞，對照組為相同體積的DMSO，待各個處理組細(xì)胞死亡現(xiàn)象在肉眼觀測下差異明顯時進(jìn)行結(jié)晶紫染色，棄去細(xì)胞上清，用70%乙醇室溫固定30 min，棄掉固定液待室溫下風(fēng)干后用0.1%的結(jié)晶紫細(xì)胞室溫染色40 min，之后回收結(jié)晶紫染色液，用PBS洗去細(xì)胞表面殘留的染色液，室溫風(fēng)干后拍照。

1.3病毒制備

待T25細(xì)胞瓶中LMH細(xì)胞長滿單層后接種ILTV-EGFP，MOI為0.1，待細(xì)胞病變達(dá)70%以上時將細(xì)胞在-80 ℃下反復(fù)凍融3次以充分釋放病毒，將病毒液以12 000 r/min離心10 min，取病毒上清分別用Dil（3 μmol/L）和R18（3 μmol/L）染色，室溫下避光孵育20 min，然后用0.1 μm 的PVDF膜濾器過濾病毒液，此時病毒滯留在濾膜上，再用2 mL左右無血清培養(yǎng)基沖洗濾器，最后將濾器置于無血清培養(yǎng)基中往回倒抽以回收病毒，病毒液過濾體積∶病毒液回收體積為 2∶1。

1.4PFT-α對ILTV吸附細(xì)胞影響的檢測

將PFT-α對ILTV吸附細(xì)胞的影響采取兩種方法進(jìn)行檢測。方法一：待24孔板中LMH細(xì)胞長滿單層后接種PFT-α（20 μmol/L），對照組為相同體積的DMSO，孵育12 h后用胰酶消化細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄掉上清后加入500 μL Dil染色后回收的病毒液，將細(xì)胞懸起混勻，置于4 ℃內(nèi)讓病毒避光吸附1 h，之后1 200 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄掉上清后加入500 μL PBS重懸細(xì)胞并過300目銅篩網(wǎng)置樣品于流式細(xì)胞管中待測。

方法二：待24孔板中LMH細(xì)胞長滿單層后接種PFT-α（20 μmol/L），對照組為相同體積的DMSO，孵育12 h后用胰酶消化細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄掉上清后加入500 μL未染色的病毒液，將細(xì)胞懸起混勻后置于4 ℃內(nèi)讓病毒吸附1 h，之后1 200 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄掉上清后加入1%BSA稀釋的抗ILTV gI糖蛋白的兔多克隆抗體，gI抗體∶1%BSA=1∶10，以兔IgG作為對照，4 ℃孵育1 h后1 200 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄掉上清后加入1% BSA稀釋的FITC標(biāo)記的抗兔二抗，二抗稀釋比例為1∶300，4 ℃內(nèi)避光孵育30 min后1 200 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄掉上清后加入500 μL PBS重懸細(xì)胞并過300目銅篩網(wǎng)置樣品于流式細(xì)胞管中待測。

1.5PFT-α對ILTV進(jìn)入細(xì)胞影響的檢測

待24孔板中LMH細(xì)胞長滿單層后棄掉上清，用無血清培養(yǎng)基輕輕洗掉細(xì)胞表面殘留的血清，加入500 μL R18染色后回收的病毒，置于4 ℃讓病毒避光吸附1 h，之后加入PFT-α（20 μmol/L），對照組為DMSO，在4 ℃內(nèi)孵育1 h后轉(zhuǎn)移至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h讓病毒進(jìn)入細(xì)胞，待病毒充分進(jìn)入后收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測病毒進(jìn)入情況。

1.6PFT-α對ILTV在細(xì)胞間擴(kuò)散影響的檢測

以MOI為1的劑量給24孔板中長滿單層的LMH細(xì)胞接種ILTV-EGFP，待病毒充分進(jìn)入后將細(xì)胞消化離心，將此感染細(xì)胞與另外未感染病毒的LMH細(xì)胞混勻后共同接種96孔板（6孔板），兩者比例為1∶50，待細(xì)胞貼壁后加入PFT-α（20 μmol/L）及DMSO，并且在細(xì)胞表面鋪一層低熔點瓊脂糖凝膠，另一組不鋪膠作為對照，之后于6、18和24 h在高內(nèi)涵細(xì)胞篩選系統(tǒng)（倒置熒光顯微鏡）下檢測EGFP熒光表達(dá)情況。

2結(jié)果與分析

2.1PFT-α對細(xì)胞感染ILTV后細(xì)胞死亡的影響

以ILTV感染復(fù)數(shù)為0.1的劑量接種LMH細(xì)胞，并分別在ILTV感染前后各以PFT-α（20 μmol/L）處理宿主細(xì)胞，對照組為DMSO，在病毒感染24 h后做結(jié)晶紫染色。結(jié)果如圖1所示，和對照組相比，PFT-α處理組細(xì)胞死亡明顯更多，說明PFT-α促進(jìn)了ILTV感染后的細(xì)胞死亡。

2.2PFT-α對ILTV吸附細(xì)胞的影響

用PFT-α孵育LMH細(xì)胞后用Dil預(yù)染的ILTV吸附細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，和對照組相比，PFT-α處理組的Dil熒光密度均值（MFI）沒有顯著變化（P>0.05），這表明PFT-α對ILTV吸附細(xì)胞沒有影響（圖2a）；應(yīng)用抗ILTV gI糖蛋白的兔多克隆抗體的方式通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，也得到了相似的結(jié)論（圖2b）。綜上所述，PFT-α對ILTV吸附細(xì)胞沒有影響。

2.3PFT-α對ILTV進(jìn)入細(xì)胞的影響

在對LMH細(xì)胞接種R18預(yù)染的病毒后，先使病毒在4 ℃條件下吸附1 h，然后添加PFT-α并4 ℃孵育1 h，之后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)讓R18預(yù)染的病毒進(jìn)入細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，和對照組相比，PFT-α處理組R18的熒光密度均值顯著增加（P<0.05）。以上結(jié)果說明，PFT-α促進(jìn)了ILTV進(jìn)入細(xì)胞（圖3）。

2.4PFT-α對ILTV在細(xì)胞間擴(kuò)散的影響

ILTV在細(xì)胞間以2種方式進(jìn)行擴(kuò)散，即游離擴(kuò)散和細(xì)胞-細(xì)胞間擴(kuò)散，禽呼吸道病實驗室分別對2種方式進(jìn)行了檢測。按照“1.5”中的方法操作，待混合培養(yǎng)的感染細(xì)胞與未感染細(xì)胞在96孔板（6孔板）內(nèi)貼壁后，通過在LMH細(xì)胞表面添加低熔點瓊脂糖凝膠的方式阻斷病毒在細(xì)胞上清中的游離擴(kuò)散，然后通過觀察EGFP熒光信號來檢測PFT-α對ILTV在細(xì)胞-

細(xì)胞間擴(kuò)散的影響，同時通過高內(nèi)涵細(xì)胞篩選系統(tǒng)統(tǒng)計病毒感染后不同時間點的EGFP熒光面積。結(jié)果顯示，隨著病毒感染時間的推移，EGFP表達(dá)逐漸增多，但和對照組相比，PFT-α對EGFP的表達(dá)沒有顯著影響（P>0.05，圖4a和b）。結(jié)果表明，PFT-α對ILTV在細(xì)胞-細(xì)胞間擴(kuò)散沒有影響；另外，在未加低熔點瓊脂糖凝膠的共培養(yǎng)系統(tǒng)里，病毒以2種方式進(jìn)行擴(kuò)散。觀察結(jié)果表明，PFT-α對EGFP的表達(dá)也沒有顯著影響（P>0.05，圖5a和b）。綜上所述，PFT-α對ILTV的游離擴(kuò)散和細(xì)胞-細(xì)胞間擴(kuò)散均沒有影響。

3討論

AILT每年都會給世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目

前，疫苗接種仍然是防控AILT的主要措施，它能有效地防止ILTV感染。但和強(qiáng)毒株一樣，疫苗毒也會引起雞群潛伏感染[8]，從而逃避宿主免疫監(jiān)視，使AILT反復(fù)暴發(fā)，很難根除。因此探索一種更為安全有效的AILT防控新策略至關(guān)重要。

研究ILTV與宿主之間的相互作用尤其是ILTV的傳播機(jī)制至關(guān)重要，它可以幫助人們更好地理解ILTV的復(fù)制、毒力和發(fā)病機(jī)理，并為完善現(xiàn)有AILT防控體系提供了新的切入點。病毒吸附、病毒進(jìn)入和病毒在細(xì)胞間擴(kuò)散是病毒侵染宿主細(xì)胞的重要步驟。病毒吸附和病毒進(jìn)入是病毒侵染宿主細(xì)胞的初始環(huán)節(jié)，而病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制后通過擴(kuò)散去感染新的宿主細(xì)胞。在體內(nèi)病毒主要以2種方式進(jìn)行擴(kuò)散，即游離擴(kuò)散和細(xì)胞-細(xì)胞間擴(kuò)散。游離擴(kuò)散是指病毒在感染細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制后釋放至外周環(huán)境中，然后借助外周環(huán)境進(jìn)行遠(yuǎn)端擴(kuò)散；細(xì)胞-細(xì)胞間擴(kuò)散指病毒借助細(xì)胞間形成的通道進(jìn)行擴(kuò)散。和細(xì)胞-細(xì)胞間擴(kuò)散相比，游離擴(kuò)散很容易被體液中的中和抗體所阻斷，不利于病毒的存活[9-10]。目前，關(guān)于人皰疹病毒1型和牛皰疹病毒1型在宿主細(xì)胞間擴(kuò)散的研究均有報道[11-14]，然而，關(guān)于ILTV在細(xì)胞間擴(kuò)散的研究知之甚少。此外，有研究表明，宿主Src（原癌基因酪氨酸激酶）作為主要調(diào)節(jié)因子調(diào)控ILTV感染過程[15]，但該研究并未闡明Src調(diào)控ILTV在宿主細(xì)胞間傳播的具體機(jī)制。該研究中，以ILTV感染LMH細(xì)胞為體外研究模型，初步探討了抑癌基因p53小分子抑制劑PFT-α對ILTV侵染宿主細(xì)胞的影響。通過結(jié)晶紫染色發(fā)現(xiàn)，PFT-α促進(jìn)了ILTV感染后的細(xì)胞死亡。通過對ILTV進(jìn)行Dil染色和應(yīng)用抗ILTV gI糖蛋白抗體2種方式檢測，該研究發(fā)現(xiàn)PFT-α對ILTV吸附細(xì)胞沒有影響。通過R18染色的方式對ILTV進(jìn)入宿主細(xì)胞的影響進(jìn)行檢測。R18是一種二聚體小分子紅色熒光染料，此時本身熒光自淬滅。當(dāng)標(biāo)記有R18染料的ILTV囊膜與細(xì)胞膜發(fā)生融合時，R18在細(xì)胞膜上隨著細(xì)胞膜的流動被稀釋成單體，可以產(chǎn)生熒光信號，直接反映病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的能力。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果指出，PFT-α可促進(jìn)ILTV進(jìn)入細(xì)胞。通過觀察和統(tǒng)計感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)里的EGFP熒光表達(dá)情況表明，PFT-α對ILTV的游離擴(kuò)散和細(xì)胞-細(xì)胞間擴(kuò)散均沒有影響。該研究結(jié)果提示，可通過改變ILTV侵染宿主細(xì)胞的環(huán)節(jié)來影響病毒的致病過程。該研究為研究ILTV侵染宿主過程提供了試驗基礎(chǔ)，也為完善現(xiàn)有AILT防治體系提供了新的思路。

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