HPLC法同時測定烏藥葉中4種倍半萜內(nèi)酯成分的含量

孫崇魯 章璐幸 俞松林 李士敏

【摘 要】 目的：建立高效液相色譜法（HPLC）同時測定不同產(chǎn)地烏藥葉中4種倍半萜內(nèi)酯（hydroxylinderstrenolide，6-acetyl lindenanolide B1 and B2，atractylenolide III，lindenanolide H）的含量。方法：采用 Inertsustain C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫（0～5 min，10% A→30% A;5～40 min，30% A→90% A;40～45 min，90%→10% A;45～50 min，10% A），流速為1.0 mL/min，檢測波長 210 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。結果：4種倍半萜內(nèi)酯在測定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系，相關系數(shù)均在0.9998以上，有良好的精密度、穩(wěn)定性、重復性和回收率;不同產(chǎn)地烏藥葉中倍半萜內(nèi)酯含量差異顯著，4種倍半萜內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù)的總和在0.71～2.43 mg/g之間。 結論：該方法簡單、準確、重復性好，對于烏藥葉的質(zhì)量評價、質(zhì)量標準的建立均具有一定參考意義。

【關鍵詞】 HPLC;烏藥葉;倍半萜內(nèi)酯;定量分析

【中圖分類號】R284?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2022）12-0058-05

HPLC Method for Simultaneous Quantitative Determination of Four Sesquiterpene Lactones in the Leaves of Lindera Aggregata （Sims） Kosterm.

SUN Chonglu ZHANG Luxing YU Songlin LI Shimin

Zhejiang Pharmaceutical College， Ningbo 315100， China

Abstract：Objective To establish an HPLC method for simultaneous determination of four kinds of sesquiterpene lactones including the hydroxylinderstrenolide， 6-acetyl lindenanolide B1 and B2， atractylenolide III and lindenanolide H in the leaves of Lindera aggregata （Sims） Kosterm. from different origins. Methods The HPLC separation was performed on an Inertsustain C18 （ 250 mm×4.6 mm， 5μm） column. Acetonitrile（A）-0.1% phosphoric acid in water（B） was used as gradient mobile phase （0～5 min， 10% A→30% A; 5-40 min， 30% A→90% A; 40-45 min， 90%→10% A; 45-50 min， 10% A）. The flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and the detected wavelength was 210 nm. Results The linear relation of four sesquiterpene lactones measured in the range of mass concentration was good with perfect precision， repeatability， and stability， the value of which was all more than 0.9998. The contents of sesquiterpene lactones in the leaves of Lindera aggregata （Sims） Kosterm. from different origins were significantly different， and the total content of four kinds of sesquiterpene lactones was 0.71～2.43 mg/g. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible， and has certain significance for the quality evaluation and control of the leaves of Lindera aggregata （Sims） Kosterm.

HPLC; Linderae Aggregate Leaf; Sesquiterpene Lactones; Quantitative Analysis

烏藥Lindera aggregate （Sims） Kosterm.系樟科山胡椒屬植物，又名矮樟、香桂樟、銅錢柴，主產(chǎn)于浙江、湖南、廣西、安徽、廣東等地，以浙江省天臺縣較為著名，稱天臺烏藥，2018年入選新“浙八味”[1]。目前烏藥的研究大多集中在其根塊的化學成分和生物活性方面，烏藥根塊提取物具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化等廣泛的活性[2-5]，在中藥市場上已被用作治療藥物。但烏藥的地下塊根生長緩慢，需要8～10年才能達到商品藥材的要求。在漫長的生長過程中，烏藥莖葉部分資源利用率極低，大部分均被丟棄。然而，在民間醫(yī)學中，烏藥葉常用來治療急性蜂窩組織炎、臀癰、胃炎以及風濕性關節(jié)炎等。歷代本草均有記載，烏藥葉具有溫中燥脾、消食殺蛔的功效，用于治療腹中寒痛[6]。浙江民間也常用烏藥葉入茶飲，有降脂、護肝等保健功效。現(xiàn)代藥理學研究表明，烏藥葉具有明顯的抗氧化、降脂、改善記憶及消炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[7-10]。

課題組前期對烏藥葉進行了系統(tǒng)的化學成分研究，從烏藥葉的乙醇提取物中分離得到了4個倍半萜內(nèi)酯類成分，分別鑒定為hydroxylinderstrenolide， 6-acetyl lindenanolide B1 and B2， atractylenolide III， lindenanolide H。結構如圖1所示。其中atractylenolide III， lindenanolide H為首次從烏藥葉中分離得到。

現(xiàn)代藥理學研究[11]表明，倍半萜內(nèi)酯類具有抗腫瘤、抗瘧、抗菌消炎等活性。文獻[12] 報道atractylenolide III具有抗炎、抗腫瘤、健脾運脾以及促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收等功效，提示倍半萜內(nèi)酯可能為烏藥葉所具主要功效的活性成分。本實驗建立HPLC同時測定烏藥葉中主要倍半萜內(nèi)酯類成分含量的方法，為建立全面合理的質(zhì)量控制和評價標準提供研究基礎，并利用此法對10批次不同產(chǎn)地的烏藥葉進行測量，以期為今后在烏藥葉的開發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）;AL204電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司）。

1.2 材料 對照品 hydroxylinderstrenolide， 6-acetyl lindenanolide B1 and B2， atractylenolide III， lindenanolide H均自制，經(jīng)ESI-MS，1H-NMR和13C-NMR確認，HPLC測定化合物純度，歸一化法計算純度>95%。流動相所用乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

不同產(chǎn)地烏藥葉經(jīng)浙江大學新藥開發(fā)研究中心彭昕教授鑒定為烏藥葉Linderae aggregate leaf，樣品信息見表1。上憑證標本存于浙江醫(yī)藥高等?？茖W校藥物研究所。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取一定量的hydroxylinderstrenolide， 6-acetyl lindenanolide B1 and B2， atractylenolide III， lindenanolide H對照品，分別加入適量甲醇超聲溶解，使各對照品濃度均為4.0 mg/mL。精密移取各對照品溶液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得各對照品濃度均為0.4 mg/mL的混合對照品儲備液，并于4 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取烏藥葉粉末約1.0 g于50 mL離心管中，加入50 mL甲醇，超聲提取30 min，離心取上清液，重復提取3次，合并上清液，濃縮至干得膏體，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前取溶液?jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件 采用Inertsustain C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min， 10% A→30% A; 5～40 min， 30% A→90% A; 40～45 min， 90%→10% A; 45～50 min， 10% A），檢測波長為210 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，采用外標法計算含量。在上述條件下，混合對照品溶液及樣品溶液的色譜圖如圖2所示。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 分別精密移取混合對照品儲備溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于1 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得濃度分別為20、40、80、160、240、320、400 mg/L的混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定hydroxylinderstrenolide， 6-acetyl lindenanolide B1and B2， atractylenolide III， lindenanolide H的峰面積，每個濃度平行測定3次，得到的峰面積取平均值，然后以對照品濃度（mg/L）為橫坐標（X），色譜峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，結果見表2。由相關系數(shù)值可知4種倍半萜內(nèi)酯的濃度與峰面積之間的線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗 取“2.1”項下制備的混合對照品溶液，按“2.3”項下的色譜條件進行HPLC分析，連續(xù)進樣6次，根據(jù)各個對照品的峰面積計算相應的RSD，分別為1.90%、0.64%、0.57%、1.40%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取烏藥葉粉末（S-8）約1.0 g，精密稱定，按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，于 0、2、4、8、12、24 h后分別按“2.3”項下的色譜條件進行HPLC分析，根據(jù)4種倍半萜內(nèi)酯類化合物的峰面積計算相應的RSD，分別為0.87%、1.31%、1.11%、1.14%，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復性試驗 稱取同一產(chǎn)地的樣品粉末（S-8），精密稱定6份，每份約1.0 g，分別按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行HPLC分析，根據(jù)4種倍半萜內(nèi)酯類化合物的峰面積計算相應的RSD，分別為1.63%、1.54%、2.00%、2.01%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱定已知4種倍半萜內(nèi)酯含量的烏藥葉樣品6份（S-8），分別精密加入對照品適量，然后按“2.2”項所述的方法制備供試品溶液，按“2.3”項條件進行含量測定，計算4種倍半萜內(nèi)酯化合物的平均回收率及RSD，結果見表3。4種倍半萜內(nèi)酯類化合物的平均回收率在96.69%～104.50%，RSD均小于3.0%，表明該方法的回收率良好。

2.5 樣品含量測定 取不同產(chǎn)地的烏藥葉粉末約1.0 g，精密稱定3份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行HPLC分析，記錄各倍半萜內(nèi)酯的峰面積，根據(jù)外標法中的線性回歸方程方法計算樣品中 4 種倍半萜類成分的含量。結果見表4。

3 討論

鑒于倍半萜內(nèi)酯類為脂溶性化合物，重點考察了幾種無水有機溶劑的提取能力，包括乙醇、乙酸乙酯、甲醇、丙酮，結果發(fā)現(xiàn)用甲醇做溶劑時所測各指標平均含量較高。同時也考察了提取方法的影響，包括超聲提取及加熱回流提取，發(fā)現(xiàn)兩者差異不大?？紤]到超聲的簡便易行，所以選擇了超聲提取。

試驗分別對4個倍半萜內(nèi)酯的溶液進行了紫外全波長掃描，其最大吸收波長基本上都在210 nm左右，故選擇210 nm作為檢測波長。另外根據(jù)文獻[13-15]，分別考察比較了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液等多種組合的流動相系統(tǒng)進行洗脫。結果表明，乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相在梯度洗脫情況下，所測的4個倍半萜內(nèi)酯成分分離效果較好，峰形窄而對稱。

對于10批次烏藥葉含量測定的結果表明，不同產(chǎn)地烏藥葉中4種倍半萜內(nèi)酯成分含量差異很大，這可能與不同種植基地其烏藥引種來源以及不同的生態(tài)環(huán)境有關。從收集的10批次烏藥葉中4種倍半萜內(nèi)酯的總含量來看，來自于浙江和安徽的樣品明顯優(yōu)于其它產(chǎn)地。

試驗建立了同時測定烏藥葉中4種倍半萜內(nèi)酯的HPLC分析方法，該法簡單、準確、重復性好，對于評價烏藥葉質(zhì)量評價具有一定的參考價值。

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（收稿日期：2021-11-04 編輯：陶希睿）