遺傳多樣性改變了臨床現(xiàn)象，讓甲型流感病毒檢測(cè)充滿挑戰(zhàn)

菲利普·高格爾，獸醫(yī)學(xué)博士，理學(xué)碩士，博士，愛荷華州州立大學(xué)副教授

甲型流感病毒仍然是美國(guó)養(yǎng)豬業(yè)面臨的最嚴(yán)峻的健康挑戰(zhàn)之一，更糟糕的是，患病風(fēng)險(xiǎn)可能還在增加。根據(jù)愛荷華州州立大學(xué)獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室的豬呼吸道樣本數(shù)據(jù)，在過去的七年里，與流感相關(guān)的豬呼吸道病例數(shù)量一直在上升。(圖1)。

甲型流感病毒是目前被診斷為單一病原體或vdL.2混合感染的豬呼吸道疾病的第二常見病因，這是一項(xiàng)基于對(duì)病毒和相關(guān)的、肺部微小病變的檢測(cè)。（圖2）。眾所周知，甲型流感病毒也是導(dǎo)致豬呼吸道疾病的一個(gè)重要成分。

世界各地流行的三種甲型流感病毒亞型分別是H1N1、H1N2和H3N2。雖然流感是一種人畜共患病，可以從豬傳染給人類，但我們應(yīng)該清楚的是，人類流感病毒也可以傳染到豬。1930從豬中分離出的第一株H1N1病毒，起源于1918年的西班牙人類流感大流行。H3N2是一種重組甲型流感病毒，最初起源于1998.4，由人類傳染給豬。自那時(shí)以來(lái)，人類流感病毒繼續(xù)影響豬體內(nèi)傳播的甲型流感病毒毒株，包括2009年H1N1流感大流行，隨后又傳染給豬。另外基因重組和突變導(dǎo)致豬體內(nèi)循環(huán)的不同基因菌株的數(shù)量顯著增加。

圖1 2003年至2016年間，愛荷華州大學(xué)獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室型流感病毒呈陽(yáng)性的診斷病例數(shù)

圖2 2016年愛荷華州州立大學(xué)獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室診斷的豬呼吸道病例百分比

有幾個(gè)因素使情況更加復(fù)雜：

1.這種病毒很容易傳播。

2.大量的豬進(jìn)行遠(yuǎn)距離移動(dòng)以供飼養(yǎng)和加工，從而使地方病的甲型流感病毒能夠傳播到偏遠(yuǎn)地區(qū)的其他豬群。

3.在豬密度較低的地區(qū)，有少數(shù)豬場(chǎng)能夠在它們的畜群中預(yù)防流感，但這種感染在其他地方是普遍存在的。

4.臨床表現(xiàn)可能不同。

豬肉行業(yè)的許多人都記得多年前暴發(fā)的流感。豬出現(xiàn)深層次的陣發(fā)性或“吠叫”性咳嗽，這種咳嗽很快影響到大多數(shù)的豬群。由于肺炎的嚴(yán)重程度，豬可能會(huì)出現(xiàn)呼吸窘迫。發(fā)病率通常很高，但死亡損失很低，豬很快就恢復(fù)了免疫力，感染也因此消失。

今天，流感的典型臨床表現(xiàn)各不相同。豬的臨床癥狀可能較輕，只會(huì)輕微咳嗽。任何年齡的豬都可能感染甲型流感病毒，包括哺乳仔豬。甲型流感病毒感染初期可能只是輕微但持續(xù)的咳嗽，生產(chǎn)者通常不會(huì)將這種咳嗽與流感聯(lián)系起來(lái)，從而忽視了這種疾病。當(dāng)同一群仔豬斷奶并轉(zhuǎn)移到苗圃時(shí)，隨著病毒在母親抗體下降的同時(shí)傳染給易感仔豬，咳嗽可能會(huì)變得更加普遍。

在其他情況下，母豬抗體的下降可能導(dǎo)致其在懷孕后期感染流感。在這個(gè)年齡，流感的臨床表現(xiàn)可能不那么引人注目，但可以持續(xù)到最后階段，與幾年前觀察到的快速發(fā)病不同，這對(duì)甲型流感病毒的臨床表現(xiàn)、生產(chǎn)及經(jīng)濟(jì)損失有重要意義。

此外，甲型流感病毒的遺傳多樣性有時(shí)會(huì)使甲型流感病毒疫苗難以跟上病毒的流行株，這也是為什么生產(chǎn)者可能使用自體疫苗。甲型流感病毒在美國(guó)及其容易傳播，僅靠生物方法很難預(yù)防感染。此外，iv-S的遺傳多樣性有時(shí)也有變異。商用甲型流感病毒疫苗很難跟上病毒的流行株，這也是為什么生產(chǎn)商可以使用自體疫苗。然而，最近該行業(yè)獲得了含有4至5株甲型流感病毒的商業(yè)疫苗，這是一項(xiàng)非常重要的發(fā)展。

檢測(cè)活動(dòng)性感染

毫無(wú)疑問，新的或正在出現(xiàn)的菌株的存在和該疾病的各種臨床表現(xiàn)使甲型流感病毒的檢測(cè)、診斷和監(jiān)測(cè)更具挑戰(zhàn)性。由于感染時(shí)間相對(duì)較短，或由于甲型流感病毒的發(fā)病率較低，檢測(cè)活動(dòng)性感染和診斷與甲型流感病毒相關(guān)的臨床疾病可能比較困難。此外，選擇哪種豬取樣和正確采集樣本是極其重要的，這就是為什么獸醫(yī)應(yīng)該參與以確保取得最大成效。

適合于在活豬中檢測(cè)甲型流感病毒的樣本包括單個(gè)鼻拭子或鼻拭子。菲利普博士經(jīng)常被問到要用什么類型的拭子來(lái)檢測(cè)像IAV這樣的病毒。診斷實(shí)驗(yàn)室更喜歡帶有塑料軸的合成棉簽(滌綸、人造絲或滌綸)。為防止拭子過于干燥，需要大約1到2毫升的液體，不要使用凝膠材質(zhì)的。鼻巾不太常用，但當(dāng)使用鼻巾時(shí)，用2英寸x2英寸的棉紗擦拭豬的鼻子，然后放入5毫升的液體輸送介質(zhì)中。盡量不要交叉污染豬之間的擦拭物，以保持樣品的完整性。

取樣提示

在感染豬的早期，也就是當(dāng)豬的病毒排出量最大的時(shí)候，檢測(cè)豬流感是最有效的。排出病毒始于感染后的24小時(shí)，持續(xù)時(shí)間大約為5到8天。甲型流感病毒在豬群中的傳播速度取決于豬的年齡、甲型流感病毒毒株、本身的免疫力、是否存在混合感染和其他環(huán)境因素。

當(dāng)從豬的種群中收集個(gè)體樣本時(shí)，重要的是選擇代表種群臨床癥狀的動(dòng)物。例如，如果要觀察呼吸道疾病，就需要從出現(xiàn)昏睡和咳嗽的豬身上采集樣本。根據(jù)預(yù)期的感染率，至少要采集10到30頭受影響的豬。

然而，當(dāng)呼吸道疾病不嚴(yán)重時(shí)，選擇合適的取樣是很困難的，這是典型的乳豬，在產(chǎn)房里有輕微、周期性咳嗽。在這些病例中，我成功地從發(fā)燒的乳豬(104°F或40℃)的鼻拭子中檢測(cè)到流感，

乳豬的甲型流感病毒流行率很低，通常在2%或者更少，因此我們需要從大量仔豬中采集樣本，每個(gè)產(chǎn)房至少要采集60頭豬的鼻拭子。一些診斷測(cè)試可以分成五組，以降低測(cè)試成本。

口服液取樣

口服液樣本也適用于苗圃、種植者或育肥豬的種群監(jiān)測(cè)，這是一種非侵入性的方法。它通常很容易。3周齡以下豬(哺乳豬)的NG口服液可能很困難，需要訓(xùn)練才能成功。使用一根5/8英寸的棉繩掛在豬的肩部高度的一支筆里，允許豬在繩子上咀嚼20到30分鐘。繩子的末端放在塑料袋里，然后擠壓。讓液體收集到袋底。然后，唾液被倒進(jìn)圓錐形管，這個(gè)圓錐形管應(yīng)該被緊緊地固定住，以防止在運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室的過程中泄漏。樣品必須是小心處理以防止交叉污染。收集后應(yīng)盡快冷藏，并隨冰袋運(yùn)出。

口服液的優(yōu)點(diǎn)是具有代表性。這有助于檢測(cè)出可能在豬體內(nèi)不均勻地循環(huán)的甲型流感病毒。臨床癥狀出現(xiàn)時(shí)，應(yīng)收集其口服液體，每一百只動(dòng)物使用一根繩子，并應(yīng)將繩索均勻地隔在谷倉(cāng)內(nèi)。

最后，如果豬需要進(jìn)行安樂死，可以收集死后樣本。新鮮的肺樣本提交至病毒檢測(cè)，但是只需要沒有慢性感染或混合感染的豬，最好是來(lái)自未接受抗生素治療的豬。

圖3 不同階段檢測(cè)甲型流感病毒的取樣類型測(cè)試方法

由于甲型流感病毒的流行狀況和疫苗的使用，血清學(xué)診斷甲型流感病毒的價(jià)值值得商榷。例如，ELISA試驗(yàn)(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))不會(huì)區(qū)分由自然感染引起的抗體、疫苗或母體抗體之間的相互作用。因此，ELISA檢測(cè)方法應(yīng)應(yīng)用于確定是否存在甲型流感病毒抗體。

另一項(xiàng)血清學(xué)試驗(yàn)是血凝抑制，也稱為HI。它是檢測(cè)抗甲型流感病毒抗體的良好指標(biāo)。不幸的是，由于不同毒株的甲型流感病毒在這種測(cè)試中可能不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，所以甲型流感病毒的多樣性使得HI擴(kuò)散。因此，使用甲型流感病毒來(lái)檢測(cè)豬的血清是很重要的，如果適當(dāng)?shù)脑?，這種甲型流感病毒可以在畜群中流通，也可以用于特定的農(nóng)場(chǎng)疫苗中?，F(xiàn)場(chǎng)樣品需要針對(duì)代表不同H1和H3病毒的甲型流感病毒毒株進(jìn)行測(cè)試，以提高檢測(cè)靈敏度。

為了監(jiān)測(cè)人群中的甲型流感病毒，我們對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行了基因測(cè)序。這不僅能揭示甲型流感病毒是否存在，而且還能準(zhǔn)確定位循環(huán)亞型和遺傳簇。獸醫(yī)和生產(chǎn)者必須知道哪種病毒在他們的豬體內(nèi)傳播，這增加了對(duì)基因測(cè)序的需求。

在一群甲型流感病毒監(jiān)視器，聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)是對(duì)陽(yáng)性樣品的基因測(cè)序完成，這不僅將揭示是否甲型流感病毒目前也確定循環(huán)目的亞型和遺傳聚類。獸醫(yī)和生產(chǎn)者必須知道哪種病毒在他們的豬體內(nèi)傳播，這增加了對(duì)基因測(cè)序的需求。

無(wú)論生產(chǎn)者和獸醫(yī)決定做什么測(cè)試，重要的是要保存好結(jié)果的記錄，以便與未來(lái)的測(cè)試進(jìn)行比較。你會(huì)想知道甲型流感病毒病毒是否已經(jīng)改變，這顯然會(huì)影響疫苗接種計(jì)劃。

90多年來(lái)，流感已被認(rèn)為是豬的一種呼吸道病原體。盡管病毒在不斷變化，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)來(lái)說，甲型流感病毒的管理仍然是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)，診斷方法也在不斷改進(jìn)。

在未來(lái)，新的疫苗平臺(tái)可能會(huì)被批準(zhǔn)，這可能會(huì)顯著影響我們控制甲型流感病毒的能力。此外，獸醫(yī)和養(yǎng)豬者還需要對(duì)甲型流感病毒進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以檢測(cè)新的或正在出現(xiàn)的病毒株，以便在必要時(shí)能夠更新疫苗。對(duì)于生產(chǎn)者來(lái)說，參與美國(guó)農(nóng)業(yè)部的甲型流感病毒監(jiān)測(cè)計(jì)劃是一種非常好的方法，幫助監(jiān)測(cè)甲型流感病毒在豬群體內(nèi)的存在。