青蒿抑制煙曲霉和黃曲霉的實驗研究

毛麗旦?熱合木吐拉　阿地拉?艾斯卡爾　汪建平

【摘 要】 青蒿（Artemisia annuaL.）具有解暑、截瘧的功效，其對真菌的抑制效果未見報道。本實驗以中藥青蒿為原料，通過抑制煙曲霉（Aspergillus fumigatus）和黃曲霉（Aspergillus flavus）的實驗研究，考察其抑制真菌的效果，為其抗真菌的臨床應(yīng)用提供參考。

【關(guān)鍵詞】 青蒿;煙曲霉;黃曲霉

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2022）15-0022-04

Experimental Study onArtemisia annuaL. InhibitingAspergillus fumigatusandAspergillus flavus

REHMUTULLA Mewlude ESQER Adile WANG Jianping*

School of Pharmacy， Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Abstract：Pathogenic microorganisms in the air and environment seriously affect human health. Blocking the transmission route can effectively prevent the occurrence and prevalence of diseases. In this study，Artemisia annuawas used and its fungal inhibition effect was investigated through the experimental study onAspergillus fumigatusandAspergillus flavus. This experimental study may provide reference for its clinical antifungal application.

Key words：Artemisia annuaL.;Aspergillus fumigatus;Aspergillus flavus

病原性真菌時常出現(xiàn)在大眾的視線里，它們以潮濕的地方為生存環(huán)境，在適宜條件下大量繁殖，嚴重威脅著人類的健康。據(jù)全球真菌感染行動基金會（GAFFI）統(tǒng)計，每年約有3億人感染真菌，其中約135萬人死亡^[1]。環(huán)境病原真菌對人類健康威脅巨大，由于致死率高、治療藥物有限、自然界分布廣泛且流行病學特點不清等原因，對其防控十分困難^[2]。因此，切斷其傳播途徑在感染控制方面意義重大。目前，醫(yī)院和其他公共場所如高校、社區(qū)等，常采用紫外線進行空氣消毒，存在消毒時間維持不長且不適合在有人環(huán)境下作業(yè)等問題，且化學消毒制劑具有腐蝕性、刺激性等缺陷，噴灑后易對人體和醫(yī)療設(shè)備造成損害^[3]。反觀天然藥物，其來源豐富、成本低廉，在殺菌過程中不會造成二次污染，且氣味芳香、高效安全，適合作為空氣和環(huán)境消毒產(chǎn)品研發(fā)。

青蒿為菊科植物黃花蒿Artemisia annuaL.的干燥地上部分，秋季花盛開時采割，除去老莖，陰干^[4-6]。其味苦、辛，性寒，歸肝、膽經(jīng)，具有“清虛熱，除骨蒸，解暑熱，截瘧，退黃”的功效，用于溫邪傷陰、夜熱早涼、陰虛發(fā)熱、骨蒸勞熱、暑邪發(fā)熱、瘧疾寒熱、濕熱黃疸^[6]。

青蒿化學成分多樣，包括倍半萜、二萜、黃酮、苯丙酸、香豆素和揮發(fā)油等類成分^[7-8]。其中倍半萜類既是青蒿的主要成分也是重要的有效部位，藥理作用豐富，如解熱、抗炎、抗病原微生物、抗哮喘、抗氧化、抗腫瘤等^[8]。

本實驗以中藥青蒿為原料，通過抑制煙曲霉（Aspergillus fumigatus）和黃曲霉（Aspergillus flavus）的實驗研究，為其抑制真菌的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與試劑

青蒿（Artemisia annuaL.），購自安徽毫州（批號：20200916），由本實驗室汪建平教授鑒定;受試真菌煙曲霉（Aspergillus fumigatus）和黃曲霉（Aspergillus flavus）由本室從環(huán)境中分離。

2 方法

2.1 真菌的鑒定 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)真菌;取新鮮真菌，利用微波法提取真菌DNA;利用ITS1和ITS4引物PCR擴增真菌核糖體間區(qū)DNA片段;PCR片段回收后序列測定;利用NCBI的Blast對所得的序列進行比對。

2.2 提取物與供試液的制備 取青蒿50 g，于體積分數(shù)為80%的乙醇溶液1000 mL浸沒后，回流提取，用時1.5 h。提取液過濾、待旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)掉大部分溶劑后，得深褐色濃稠液50 mL，貯藏于陰涼處。

以青蒿提取物濃度（V青蒿/V乙醇）為5%、10%、15%和20%，乙醇體積分數(shù)為10%、20%和30% 配置12組供試液。

2.3 體外抑菌活性研究

2.3.1 接種 將供試菌用接種環(huán)挑取，分別接種于20個普通瓊脂培養(yǎng)基上，置于霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄菌落生長情況。

2.3.2 抑菌效力測定 在無菌條件下將圓形濾紙用配置好的供試液潤濕，以乙醇體積分數(shù)為單一變量將已經(jīng)被供試液潤濕的濾紙片平放在平板上，使其形成透明的抑菌圈，濾紙片周圍有抑菌圈者為陽性，無抑菌圈者則為陰性。根據(jù)抑菌圈的大小可判斷相應(yīng)濃度提取液抑菌作用的強弱，同時進行兩組平行實驗，以確定結(jié)果的一致性。在同一霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)48 h，每12 h觀察結(jié)果并記錄。

3 結(jié)果與結(jié)論

3.1 受試菌的鑒定

煙曲霉（Aspergillus fumigatus）檢測序列：

利用NCBI的Blast進行序列比對，相似度為98%，鑒定為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。

黃曲霉（Aspergillus flavus）檢測序列：

利用NCBI的Blast進行序列比對，相似度為99%，鑒定為黃曲霉（Aspergillus flavus）。

3.2 抑菌效果觀察 乙醇體積分數(shù)為10%的一組沒有出現(xiàn)菌絲的繁殖現(xiàn)象。由此確定體積分數(shù)為10%的乙醇作溶劑效果較好。比較不同濃度提取液抑菌情況，進一步觀察到提取液濃度為15%和20%的濾紙片周邊無菌絲，推斷該濃度下的提取液滲透效果較好。

具體的侵染情況見表1、表2。

3.3 驗證 以提取液濃度為15%、20%、25%和30%，乙醇體積分數(shù)為10%配置4組供試液。同法進行三組平行實驗以確定最佳提取物濃度。觀察到提取液濃度為15%和20%的濾紙片周邊無菌絲。

3.4 確定處方 由實驗結(jié)果知，乙醇體積分數(shù)為10%，提取液濃度為15%和20%時，抑制真菌繁殖的能力明顯優(yōu)于其他組?？紤]到提取成本，確定處方為乙醇體積分數(shù)為10%，青蒿提取液濃度為15%。

3.5 灌裝 將配置好的藥液等量裝入一定規(guī)格的噴瓶。噴出的液滴大小均勻、在空氣中分散效果較好，因此，不必加入表面活性劑或助推劑，即可制備成抑制真菌的青蒿噴霧劑。

3.6 青蒿提取液的化學成分預(yù)實驗 取青蒿提取液，分別進行化學成分的初步檢識。

3.6.1 鹽酸鎂粉反應(yīng) 取青蒿提取液，加入少許鎂粉振搖，再滴加幾滴濃鹽酸，1～2 min，顯紫紅色。

3.6.2 異羥肟酸鐵反應(yīng) 取樣品液1 mL，加新鮮的1 moL/L鹽酸羥胺甲醇液0.5 mL、6 mL/L氫氧化鉀甲醇液0.2 mL，加熱至沸，冷后加5%鹽酸酸化，最后加1%三氯化鐵溶液1～2滴，顯紫紅色。樣品液在365 nm紫外燈下顯熒光。

3.6.3 醋酐-濃硫酸顯色反應(yīng) 取樣品少量于試管內(nèi)，用醋酐溶解，進行醋酐-濃硫酸顯色反應(yīng)，溶液最終呈紅色。

綜上，可初步判斷青蒿提取液中含萜類、黃酮類、香豆素類化學成分。

4 討論

本實驗采用的煙曲霉（A.fumigatus）和黃曲霉（A.flavus）， 屬腐生真菌^[9]，為人類常見病原性真菌。全球因血液系統(tǒng)疾病、遺傳免疫缺陷或?qū)嶓w器官移植等相關(guān)免疫抑制所致的侵襲性曲霉菌?。╥nvasive aspergillosis， IA）已超過200 000例/年^[9-10]。霉菌的繁殖能力強，且方式多樣，無性或有性孢子作為其繁殖體具有小、輕、干、多、休眠期長和抗逆性強等特點，這些特點有助于煙曲霉（A.fumigatus）和黃曲霉（A.flavus）在自然界中隨處散播和繁殖，因此切斷其傳播至關(guān)重要^[11-12]。

在提取方面，考慮到乙醚的毒性和易燃性，選擇了乙醇作溶劑。本實驗中，乙醇既作為提取溶劑，也作為噴霧分散劑;乙醇本身有抑菌效果，但本實驗發(fā)現(xiàn)，10%的乙醇，效果更好，說明青蒿提取物能起到真菌抑制作用。

據(jù)文獻報道，青蒿主要含有黃酮類化合物（如蘆丁rutin、雪梨苷cynaroside、異鼠李苷isorhamnetin等）^[13]、香豆素類化合物（如東莨菪苷scopolin、東莨菪素scopoletin等）和倍半萜類化合物（如青蒿素artemisinin、雙氫青蒿酸dihydroartemisinic acid、青蒿酸artemisinic acid等）^[14]。本實驗提取的青蒿提取液化學成分初步檢識試驗表明，提取液也含萜類、黃酮類、香豆素等。

本實驗以青蒿為原料，以乙醇提取的有效部位，具有顯著的抑制真菌煙曲霉（A.fumigatus）和黃曲霉（A.flavus）繁殖的作用。本實驗結(jié)果可為青蒿抑制真菌的臨床應(yīng)用提供參考。

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（收稿日期：2021-12-09 編輯：劉 斌）