不同激素對蝴蝶蘭葉片類原球莖誘導(dǎo)的影響

朱飛雪 程玉江 寇艷玲 齊陽陽 郭麗

摘要：為提高蝴蝶蘭葉片類原球莖的誘導(dǎo)率，以蝴蝶蘭雜交品種01、02、03、04、05、06、07和08增殖階段組培苗頂部幼嫩葉片為實驗材料，采用1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同激素種類并設(shè)置不同濃度梯度，以探討6-芐基腺嘌呤（6-BA）、腺嘌呤（Ad）、萘乙酸（ NAA）、噻苯?。═DZ）及其組合對蝴蝶蘭葉片類原球莖誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：單獨使用6-BA類原球莖誘導(dǎo)率較低，TDZ的刺激作用強于6-BA;細胞分裂素和生長素的配合使用效果較好，且不同品種所需激素配比具有差異。其中，01、07品種最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+TD20.5mg.L-1，誘導(dǎo)率分別為75.3%、82%; 02品種最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+TD20.5mg.L-1'+NAAO.1mg.L-1，其誘導(dǎo)率為24%; 04、05、08品種最佳的培養(yǎng)基為1/2MS+TD22mg.L-1+NAAO.1mg.L-1，誘導(dǎo)率分別為75.7%、60.7%、73.3%;03、06品種最佳的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA5mg.L一1+NAAlmg.L一1+Ad3mg.L一1，誘導(dǎo)率分別為440/、50.7%。

關(guān)鍵詞：蝴蝶蘭;激素;葉片;類原球莖;誘導(dǎo)率

蝴蝶蘭是單子葉植物綱天門冬目蘭科蝴蝶蘭屬多年生附生植物，主要分布在泰國、菲律賓、馬來西亞、印度尼西亞及中國臺灣等地。其花形奇特，花姿高雅，色澤艷麗，花期持久，有“蘭中皇后”的美譽[1]，在國內(nèi)外花卉市場中，蝴蝶蘭因其花大色艷備受歡迎。因此，蝴蝶蘭已成為蘭科中栽培最廣泛、產(chǎn)業(yè)化技術(shù)最成熟和最受歡迎的花卉之一，具有廣闊的市場前景[2]，隨著人們欣賞水平的提高，人們對花型、花色提出了更高的要求，這就要求蝴蝶蘭育種家能在短時間內(nèi)選育出符合市場需求的新品種[3]。

蝴蝶蘭多以雜交育種為主，但后代花色變異過大，育種周期又過長[4];而轉(zhuǎn)基因育種目標性強[5]，育種周期短[6]，已開始在蝴蝶蘭新品種選育中廣泛應(yīng)用[7-8]。在轉(zhuǎn)基因育種中合適目標基因選擇、高效遺傳轉(zhuǎn)化體系是獲得蝴蝶蘭轉(zhuǎn)基因植物的前提條件[9]。蘭科轉(zhuǎn)基因植物成功的關(guān)鍵在于促進細胞組織再生為植株。研究發(fā)現(xiàn)，由蝴蝶蘭種子[10]、葉片[11]、花梗、腋芽[12]甚至是根部誘導(dǎo)而得到的球形細胞，類似于幼胚發(fā)育成的體細胞——類原球莖，在合適的條件下可以再生為完整的植株。因此，在蝴蝶蘭轉(zhuǎn)基因的研究當中，類原球莖最常被選為受體材料。而原球莖的誘導(dǎo)率是決定轉(zhuǎn)基因成功的關(guān)鍵，很多學者選擇利用蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)出類原球莖。黃磊等[13]、馬生健等[14]、喬永旭等[15]利用蝴蝶蘭葉片來誘導(dǎo)類原球莖，但是類原球莖的誘導(dǎo)率均不高?？梢?，類原球莖誘導(dǎo)的難度仍然很大，建立一個高效、穩(wěn)定的類原球莖誘導(dǎo)體系是亟需的，也在蝴蝶蘭組培快繁體系中始終占有重要地位[16]。為此，本實驗以蝴蝶蘭雜交品種01、02、03、04、05、06、07、08增殖階段組培苗頂部幼嫩葉片為實驗材料，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同種類的激素，以期探究適合蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)原球莖的激素種類、濃度以及配比組合，為蝴蝶蘭原球莖誘導(dǎo)高頻再生體系的建立及轉(zhuǎn)基因育種提供依據(jù)。

一、材料與方法

（一）實驗材料

實驗材料為蝴蝶蘭8個栽培品種，代號分別為01（黃花紅心）、02（小黃花）、03（黃花）、04（小白花）、05（白底紅點）、06（四季紅）、07（紅玫瑰）、08（黑花）共八個品種。

（二）實驗方法

切取幼嫩葉片基部0.5 - 1.0cm，正面朝上，接種于以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6- BA、TDZ、NAA、Ad，共15種處理，見表1。并附加20%的椰子汁，瓊脂5.0g.L-l，糖20g.L-，pH值5.8。每個處理設(shè)三個重復(fù)，每個重復(fù)接種50個葉片。培養(yǎng)溫度26+1℃，光照強度500 - 600lx散射光，光照時間16h/d，培養(yǎng)50d后統(tǒng)計結(jié)果。

（三）數(shù)據(jù)分析

培養(yǎng)50d后，統(tǒng)計每瓶葉片誘導(dǎo)出的類原球莖、葉片發(fā)黃死亡的數(shù)量，計算出其類原球莖誘導(dǎo)率以及葉片黃化死亡率（文中簡稱黃死率）。誘導(dǎo)率（%）及黃化死亡率（%）的計算公式如下。 誘導(dǎo)率（%）=類原球莖數(shù)/外植體數(shù)X100% 黃化死亡率（%）=黃化死亡數(shù)/外植體數(shù)X100% 實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS16.0軟件處理分析。 二、結(jié)果與分析 （一）不同濃度6-BA對葉片類原球莖誘導(dǎo)的影響 不同濃度6-BA處理下，不同品種的葉片類原球莖的誘導(dǎo)率不同，結(jié)果見表2。由表2可以看出，01-07品種隨著6-BA濃度的增加，類原球莖的誘導(dǎo)率也逐漸增加。8個品種中，01、07品種在6-BA濃度為8mg.L-1時，類原球莖誘導(dǎo)率最高，分別為35.3%和30.0%。尤其07號品種，經(jīng)方差分析，其誘導(dǎo)率顯著高于其它兩個處理。02、04、08品種的誘導(dǎo)率最低，在6-BA濃度（mg.L-1）為3、5時，誘導(dǎo)率均為o;當升至8mg.L-時，02、04品種的誘導(dǎo)率分別增加至11%和6%，08品種的誘導(dǎo)率仍然是0。從實驗結(jié)果可以得出，高濃度的6-BA有利于誘導(dǎo)出葉片原球莖。但是，從表2中可以看出，01品種在3個濃度上較高的原球莖誘導(dǎo)率為35.3%、30.0%、26.0%，其它幾個品種則更低，均不超過20.0%。表明單獨使用6-BA誘導(dǎo)出的葉片原球莖數(shù)量較少。

由表2還能看出，除了6-BA濃度會影響葉片原球莖的誘導(dǎo)之外，品種之間的差異也較大，尤其是08品種，即使6-BA濃度增加至8mg.L-1，其誘導(dǎo)率仍然是0。

（二）6-BA與NAA組合對葉片原球莖誘導(dǎo)的影響

在添加3、5、8 （mg.1-1） 6-BA的基礎(chǔ)上，添加Img.L-1的NAA處理下的葉片原球莖的誘導(dǎo)率不同，結(jié)果見表3。

從表3可以看出，01、03、08品種，在NAA濃度為Img.L-1時，其葉片原球莖誘導(dǎo)率隨著6-BA濃度的增加而增加，最高的誘導(dǎo)率為01號品種，當6-BA濃度為8mg.L-1時，其誘導(dǎo)率為46.0%;其次為03品種，其最高誘導(dǎo)率為36.0%。04、05、07品種，在3個處理上的葉片原球莖誘導(dǎo)率都很低，尤其是04、05品種，其誘導(dǎo)率均為0。

由此可見，除了6-BA、NAA會影響葉片原球莖的誘導(dǎo)之外，品種之間的差異對誘導(dǎo)率影響也較大，不同品種，葉片原球莖誘導(dǎo)所需激素種類及配比也不同，這和第一個實驗結(jié)果一致。

（三）6-BA、NAA和Ad組合對葉片原球莖誘導(dǎo)的影響

6-BA與NAA、Ad配合使用時，蝴蝶蘭葉片類原球莖的誘導(dǎo)率不同，見圖l。由圖1可以看出，03、04、05、06、07、08品種，三種激素協(xié)同作用較明顯，其中03、05、06品種在6-BA5mg.L-1+NAAlmg.L-1+Ad 3mg.L“時，類原球莖誘導(dǎo)率分別由使用6-BA和NAA組合的36.0%、3.3%、26.7%提高到44.0%，13.0%、50.7%;04、07、08品種，其誘導(dǎo)率隨著6-BA濃度增加而逐漸增加;01品種三者協(xié)同作用不明顯，隨著6-BA濃度的增加，其誘導(dǎo)率逐漸降低，且誘導(dǎo)率低于其他處理;02品種三者協(xié)同作用較差，在三個處理上，其誘導(dǎo)率均為0。

（四）TDZ、NAA對葉片誘導(dǎo)的影響

TDZ對蝴蝶蘭葉片類原球莖誘導(dǎo)具有顯著作用，其與NAA的配合使用表現(xiàn)較強的協(xié)同效應(yīng)，結(jié)果見表4。除01、07品種在單獨使用TDZ 0.5 mg.L-1時，達到最大誘導(dǎo)率75.3%、82.0%外，其他品種均在TDZ、NAA配合使用時有最大誘導(dǎo)率。經(jīng)方差分析，07品種在單獨使用TDZ 0.5 mg.L-l時，其葉片類原球莖誘導(dǎo)率顯著高于其他幾個處理。04、05、08品種，在TDZ2 mg.L-l+NAA 0.1mg.L-1時，類原球莖誘導(dǎo)率最高，分別為76.7%、60.7%、72.7%，方差分析表明，這三個品種在這個處理上的葉片類原球莖誘導(dǎo)率顯著高于其他幾個處理。02、03、06品種在TDZ 0.5 mg.L-l+NAA 0.1mg.L-1時類原球莖誘導(dǎo)率最高，分別為24.0%、28.0%、26.0%，從表4中可以看出，這三個品種在這6種培養(yǎng)基上，其誘導(dǎo)率均較低，從而說明除激素種類、濃度影響類原球莖誘導(dǎo)率外，品種之間的差異對其影響也較大。

實驗過程中觀察發(fā)現(xiàn)，品種不同，葉片黃化死亡率不同（見表5）。由表5可以看出，在M11處理上，其葉片黃化死亡率最低，最高的為03品種，其黃化死亡率為17.0%，其他幾個品種均為0。由表5還可以看出，品種之間差異較大，01、02、06在幾個處理中其黃化死亡率均為0，03品種的黃化死亡率較高，其他幾個品種在不同處理上黃化死亡率不同。

在這6個處理中，從接種到結(jié)果統(tǒng)計觀察發(fā)現(xiàn)，接種外植體的外觀表現(xiàn)無明顯差異，一般是接種1-2周后，葉片切口變黃或變黑，未見褐化;2-3周后，無明顯變化或個別葉片有黃化、褐化;3-4周后，黃化、褐化葉片增多，生成物出現(xiàn);4-6周，生成物數(shù)逐漸增多，褐化、黃化葉片也增多。50d后葉片誘導(dǎo)生成物明顯出現(xiàn)類原球莖。

三、討論

對不同植物種類而言，能否誘導(dǎo)類原球莖的發(fā)生，主要取決于植物自身基因型和誘導(dǎo)條件兩個方面。培養(yǎng)基種類、激素種類與配比、糖分比例及光照等都是需要考慮的誘導(dǎo)條件，其中，激素種類與配比對誘導(dǎo)效果影響最大。在蝴蝶蘭[17-18]、石斛蘭[19-20]、大花蕙蘭[21-22]和文心蘭[23-24]等蘭花類原球莖誘導(dǎo)過程中，細胞分裂素（6-BA、Ad或KT）與生長素（2，4-D、NAA、IBA）組合有不同誘導(dǎo)效果。

本實驗中使用6-BA、6-BA與NAA組合、6-BA與NAA和Ad組合誘導(dǎo)蝴蝶蘭葉片原球莖，單獨使用6-BA，在8個品種中，01-07號品種隨著濃度的增加，原球莖的誘導(dǎo)率也在增加，其中01、07品種在6-BA濃度為8mg.L-1時，類原球莖誘導(dǎo)率最高，分別為35.3%和30.0%。02、04、08品種的誘導(dǎo)率最低，在6-BA濃度（mg.L-1）為3、5時，誘導(dǎo)率均為0;當6-BA濃度為8mg.L-l時，02、04品種的誘導(dǎo)率分別增加至11.0%和6.0%，08品種的誘導(dǎo)率仍然是0。從實驗結(jié)果可以得出，高濃度的6-BA有利于誘導(dǎo)出葉片類原球莖，這和喬永旭等[25]、張玉等[26]的研究結(jié)果一致。

TDZ因其極高的生物活性，被廣泛應(yīng)用于植物類原球莖的誘導(dǎo)[27]，也被認為是在蘭科植物類原球莖誘導(dǎo)過程中最有效的激素，付雙彬等[28]在誘導(dǎo)虎頭蘭原球莖時，單獨加入3mg.L-1，在30d時即可使80%的組培苗誘導(dǎo)產(chǎn)生類原球莖，而在90d后則可使其達到100%。在本實驗中，單獨使用TDZ和使用TDZ與NAA組合兩種處理，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TDZ對蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)具有顯著作用，其與NAA的配合使用，表現(xiàn)較強的協(xié)同效應(yīng)。這與李娜等[29]的結(jié)果一致。除01、07品種在單獨使用TDZ 0.5 mg.L-1時，達到最大誘導(dǎo)率外，其誘導(dǎo)率分別為75.3%、82%，其他品種均在TDZ、NAA配合使用時有最大誘導(dǎo)率。其中04、05、08品種，在TD22 mg.L-l+NAA O.lmg.L-1時，原球莖誘導(dǎo)率最高，分別為76.7%、60.7%、73.3%;02、03、06品種在TDZ 0.5mg.L-+NAA O.lmg.L-1時原球莖誘導(dǎo)率最高，分別為24.0%、28.0%、26.0%。品種不同，誘導(dǎo)率差異也較大，因此，除了激素種類、濃度會影響原球莖誘導(dǎo)率外，品種不同葉片誘導(dǎo)所需激素種類及配比也不同。

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基金項目：2020年河南省科技廳科技攻關(guān)重點研發(fā)與推廣專項“野生薄皮快繁體系及工廠化育苗關(guān)鍵技術(shù)的研究”，項目編號：212102110188;2021年河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院自然科學基金項目“大巖桐花粉活力檢測及貯藏關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)與應(yīng)用”，項目編號：HNACKY-2021-03;2021年河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院科研創(chuàng)新人才項目“新優(yōu)景觀植物藍花丹快繁體系及工廠化育苗的研究”，項目編號：HNACSRHR-2021-04。

作者簡介：朱飛雪（1979-），女，河南平頂山人，碩士，講師，研究方向：園林植物種質(zhì)資源與育種。

（責任編輯曹雯梅）