東莞地區(qū)腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶的表型與基因型分析

黃亞，謝樹金，林偲思，朱 艷，王套瑞，呂飛，程理維，方穎，黃曉君，謝佩，陳青詩，郭主聲

1.中山大學(xué)附屬東莞東華醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 東莞 523110；

2.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室，廣東 湛江 524000；

3.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫教研室，廣東 湛江 524000

碳青霉烯類抗菌藥物包括亞胺培南、美羅培南和厄他培南等，是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌所致感染最有效的抗菌藥物之一[1]。隨著該類藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率呈逐年上升趨勢，產(chǎn)碳青霉烯酶是腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類藥物耐藥最主要的機(jī)制[2]。起初所有的碳青霉烯酶都被認(rèn)為是具有物種特異性和染色體編碼的β-內(nèi)酰胺酶。但是，在銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌的質(zhì)粒上分別發(fā)現(xiàn)了blaIMP-1[3]、blaOXA-23[4]和blaKPC-1[5]。最初，肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(KPC)是在肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)，隨后在大腸桿菌、腸桿菌、腸沙門氏菌和非發(fā)酵菌中也有檢出KPC基因的報道[6]，有研究發(fā)現(xiàn)KPC基因通常位于Tn4401轉(zhuǎn)座子上[7-8]。這意味著碳青霉烯酶基因可通過質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子等轉(zhuǎn)移元件在不同菌種間轉(zhuǎn)移，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌引起的感染形勢已經(jīng)十分嚴(yán)峻。耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)主要分離自尿路、肺、腹部、手術(shù)部位和血液，免疫功能低下、機(jī)械通氣和高齡的患者容易感染CRE[9]。CRE的治療取決于感染部位，分離的病原體和耐藥性。由于治療方法的復(fù)雜性和可變性，應(yīng)通過體外藥敏試驗(yàn)來制定治療計劃[9]。早期發(fā)現(xiàn)CRE感染有助于改善治療并降低傳播感染的可能性。碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)是目前推薦度比較高的檢測方法，但是存在著耗時長(過夜培養(yǎng))和只能檢測兩種碳青霉烯酶型(A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬β-內(nèi)酰胺酶)的缺點(diǎn)，快速便捷的檢測碳青霉烯酶基因是指導(dǎo)臨床準(zhǔn)確用藥的關(guān)鍵，本研究使用的賽沛GeneXpert Carba-R試劑盒可在1 h內(nèi)檢測5類碳青霉烯酶基因，包括blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIPM和blaOXA。本研究擬探討結(jié)合GeneXpert Carba-R和碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)快速且準(zhǔn)確地鑒定碳青霉烯酶基因型的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株通過東莞耐藥檢測網(wǎng)收集2020年東莞地區(qū)的40株CRE菌株，剔除重復(fù)的樣本。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.1.2 主要儀器與試劑GeneGeneXpert儀器和Carba-R試劑盒由賽沛(上海)商貿(mào)有限公司提供，VITEK 2 Compact儀器為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，藥敏試驗(yàn)紙片和培養(yǎng)基購自英國OXOID公司，替加環(huán)素E-test試紙條購自，緩沖液購自上海原科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的鑒定與藥敏按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》推薦的程序?qū)N鑒定，采用VITEK 2 Compact儀器法與紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，嚴(yán)格按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)判讀藥敏，替加環(huán)素采用E-test試紙條(法國生物梅里埃公司)測定MIC值，結(jié)果判定參照美國食品與藥品監(jiān)督管理局(U.S.Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)。

1.2.2 碳青霉烯酶的表型檢測采用碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)。具體方法：使用0.9%的生理鹽水將待測菌液調(diào)成0.5麥?zhǔn)蠞岫?，均勻涂布在MH瓊脂平板上，然后在瓊脂平板表面貼4張亞胺培南碳青霉烯抗菌藥物紙片。第一張紙片不添加任何液體，第二張紙片上滴加APB溶液10μL，第三張紙片上滴加EDTA溶液10μL，第四張紙片上同時滴加APB溶液10μL和EDTA溶液10μL，過夜孵育，測量紙片抑菌圈直徑，判定結(jié)果，滴加APB試劑的亞胺培南抑菌圈比亞胺培南單藥的抑菌圈擴(kuò)大5 mm以上，提示產(chǎn)A類絲氨酸碳青霉烯酶，主要為KPC型碳青霉烯酶；滴加ETDA試劑的亞胺培南抑菌圈比亞胺培南單藥的抑菌圈擴(kuò)大5 mm以上，提示產(chǎn)B類金屬內(nèi)酰胺酶，主要為NDM型金屬酶；滴加APB試劑或ETDA試劑的亞胺培南抑菌圈比亞胺培南單藥的抑菌圈直徑?jīng)]有明顯變化，但滴加APB試劑和ETDA試劑的亞胺培南抑菌圈比亞胺培南單藥的抑菌圈直徑擴(kuò)大5 mm以上，提示該菌同時產(chǎn)A類絲氨酸碳青霉烯酶與B類金屬內(nèi)酰胺酶。

1.2.3 碳青霉烯酶的分子檢測采用GneXpert Carba-R方法檢測。具體方法：用生理鹽水稀釋將菌液至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，吸?0μL樣品至樣本處理液中，旋渦震蕩10 s，吸取1.7 mL混合液加入到GeneXpert Carba-R試劑盒內(nèi)，啟動檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用WHONET 5.6軟件對菌株分布及藥敏結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。使用SPSS23.0軟件，并采用Fisher確切概率法對CRE菌株的耐藥率差異進(jìn)行統(tǒng)計分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRE的樣本分布和構(gòu)成比40株CRE菌株中肺炎克雷伯菌27株(占67.50%)，大腸埃希菌10株(占25.00%)，黏質(zhì)沙雷菌1株(占2.50%)，斯氏普羅威登菌1株(占2.50%)，陰溝腸桿科細(xì)菌1株(占2.50%)。

2.2 CRE菌株的標(biāo)本分布CRE菌株主要來源于呼吸道標(biāo)本(16株，占40%)、尿液標(biāo)本(7株，占17.5%)、血液標(biāo)本(4株，占10%)、分泌物標(biāo)本(4株，占10%)和其他標(biāo)本(9株，占22.5%)。

2.3 CRE菌株對常用抗菌藥物的耐藥情況40株CRE菌株的常見抗菌藥物的藥敏結(jié)果顯示：亞胺培南的耐藥率為92.5%，美羅培南的耐藥率為97.5%，替加環(huán)素的耐藥率較低為40.0%，見表1。

表1 CRE菌株的藥敏結(jié)果

2.4 碳青霉烯酶表型檢測40株CRE菌株的碳青霉烯酶型檢測結(jié)果顯示：有37株(92.5%)產(chǎn)生碳青霉烯酶，其中產(chǎn)A類絲氨酸碳青霉烯酶的有24株(60%)，產(chǎn)B類金屬β內(nèi)酰胺酶的有13株(32.5%)和未檢出碳青霉烯酶菌株3株(7.5%)。未發(fā)現(xiàn)同時產(chǎn)A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬β-內(nèi)酰胺酶的菌株。不同表型分布見表2。

表2 CRE菌株的表型分布情況

2.5 CRE菌株的碳青霉烯酶基因型的分布GeneXpert Carba-R測定法共檢測出攜帶碳青霉烯酶基因的有37株(占92.5%)，其中13株blaNDM(占32.5%)、24株blaKPC(60.00%)，未檢出blaVIM、blaIPM和bla-OXA基因，未發(fā)現(xiàn)檢出同時擁有blaNDM和blaKPC的菌株，見表3。

表3 CRE菌株的碳青霉烯酶基因型的分布

2.6 不同碳青霉烯酶基因型的CRE菌株的藥敏結(jié)果由于臨床針對不同的碳青霉烯酶型采用的治療方案不同，為了了解CRE菌株的耐藥情況，本研究檢測了攜帶blaKPC和blaNDM的CRE菌株的藥敏，結(jié)果顯示：CRE菌株對常用的抗生素的耐藥率普遍很高，其中攜帶blaKPC的CRE菌株對替加環(huán)素(54.17%)的耐藥率較低，攜帶blaNDM的CRE菌株對阿米卡星(23.07%)和替加環(huán)素(15.38%)的耐藥率較低。通過Fisher精確檢驗(yàn)，攜帶blaKPC的CRE菌株對阿米卡星、替加環(huán)素和氨曲南的耐藥比攜帶blaNDM的CRE菌株的高，兩者間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，對其他抗生素的耐藥率兩者間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表4。

表4 攜帶blaKPC和blaNDM的CRE菌株的藥敏結(jié)果

3 討論

按照Ambler分子分類方法，碳青霉烯酶可分為A、B和D類。A類為絲氨酸碳青霉烯酶，以blaKPC(blaKPC-2-blaKPC-55)、blaSME(blaSM E-1-blaSME-5)、blaI-MI(blaIMI-1-blaIMI-18)、blaNMC和blaGES(blaGES-1-blaGES-43)型為主；B類為金屬β-內(nèi)酰胺 酶，以blaNDM(blaNDM-1-blaNDM-29)、blaIMP(blaIMP-1-blaIMP-85)、blaVIM(blaVIM-1-blaVIM-69)、blaGIM(blaGIM-1-blaGIM-2)和blaSPM型為主；D類為OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶，以blaOXA-181和blaOXA-232為主[10]。除產(chǎn)生碳青霉烯酶外，少數(shù)菌株對碳青霉烯類藥物耐藥的機(jī)制是產(chǎn)生超廣譜β內(nèi)酰胺酶和/或AmpC酶合并外膜孔蛋白表達(dá)下調(diào)或缺失[10]。

我國臨床分離的CRE菌株產(chǎn)生的碳青霉烯酶以KPC和NDM型為主，少數(shù)菌株產(chǎn)生OXA-48、IMP和VIM型碳青霉烯酶[11-13]。KPC型碳青霉烯酶最主要的亞型為KPC-2型，NDM型金屬酶中最主要的亞型為NDM-1和NDM-5型，OXA-48型碳青霉烯酶中最主要的亞型是OXA-181和OXA-232型酶[10]。

2005—2019年CHINET克雷伯菌屬細(xì)菌耐藥性監(jiān)測藥敏結(jié)果顯示[14-15]，我國臨床上分離的肺炎克雷伯菌株對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥率從2005年的3%上升至2019年的25%以上，增加了8倍。2018年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CARSS)數(shù)據(jù)顯示，全國1429所醫(yī)院臨床分離的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物的平均耐藥率為10.1%，部分省市甚至超過20%[16]。由于不同地區(qū)不同細(xì)菌的產(chǎn)碳青霉烯酶型呈現(xiàn)出一定的差異，并且臨床針對不同碳青霉烯酶型的治療方案也不同，所以急需實(shí)驗(yàn)室快速檢測并鑒定碳青霉烯酶型，指導(dǎo)臨床采取正確的治療方案，可以及早的選擇合適的抗生素，有效治療患者的感染。

目前，實(shí)驗(yàn)室檢測碳青霉烯酶型的方法主要分為表型檢測和基因型檢測。表型檢測主要有改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(包括mCIM和eCIM)、碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)和Carba NP試驗(yàn)等，其中碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)推薦度較高[10]?；蛐蜋z測方法主要包括基因檢測技術(shù)和酶免疫層析技術(shù)，推薦度較高的有GeneXpert Carba-R測定法和酶免疫層析技術(shù)檢測碳青霉烯酶基因[10]。受限于實(shí)驗(yàn)條件和檢測成本，實(shí)驗(yàn)室常用的是碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)，但是該試驗(yàn)耗費(fèi)時間較長，而Xpert Carba-R測定法是目前較為推薦的快速檢測方法，可以快速檢測CRE菌株攜帶的碳青霉烯酶的基因型，對指導(dǎo)臨床及時使用合適的抗生素有著重大意義[10]。

本研究結(jié)果顯示，東莞地區(qū)分離的CRE菌株以肺炎克雷伯菌為主，標(biāo)本主要來自呼吸道標(biāo)本，對多種臨床常規(guī)使用抗菌藥物耐藥，體外試驗(yàn)顯示替加環(huán)素對有較好的抑菌作用。碳青霉烯酶表型檢測結(jié)果顯示以產(chǎn)A類絲氨酸碳青霉烯酶和產(chǎn)B類金屬β內(nèi)酰胺酶的CRE菌株為主，GeneXpert Carba-R測定法檢測出碳青霉烯酶基因?yàn)閎laNDM和blaKPC。GeneXpert Carba-R測定法共檢測出攜帶碳青霉烯酶基因的有37株(占92.5%)，其中13株blaNDM(占32.5%)、24株blaKPC(60.00%)，未檢出blaVIM、blaIPM和blaOXA基因，也未發(fā)現(xiàn)檢出同時擁有blaNDM和blaKPC的菌株，其結(jié)果與碳青霉烯酶表型檢測結(jié)果一致，其他未產(chǎn)碳青霉烯酶或者未檢出碳青霉烯酶基因的CRE菌株，可能是高產(chǎn)AmpC酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、外膜蛋白缺失和外排泵過表達(dá)等因素導(dǎo)致的[17]，本次研究結(jié)果顯示如東莞地區(qū)CRE菌株是常見A類絲氨酸碳青霉烯酶或產(chǎn)B類金屬β內(nèi)酰胺酶的CRE菌株，表型檢測和基因型檢測的結(jié)果具有一致性。

相對于碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)，GeneXpert Carba-R可以檢測出5種碳青霉烯酶基因，比碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)鑒定的碳青霉烯酶型的范圍更廣。此外，碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)需要孵育過夜和多個步驟才能獲得結(jié)果，GeneXpert Carba-R檢測只需要一個小時，這意味著GeneXpert Carba-R在鑒定碳青霉烯酶基因型和根據(jù)碳青霉烯酶基因型指導(dǎo)臨床依據(jù)基因型用藥方面有著更佳的優(yōu)勢。本研究發(fā)現(xiàn)攜帶blaKPC和blaNDM的CRE菌株對阿米卡星、替加環(huán)素和氨曲南的耐藥率有明顯差別，攜帶blaNDM的CRE菌株對阿米卡星(23.07%)和替加環(huán)素(15.38%)的耐藥率較低，另外有研究顯示頭孢他啶-阿維巴坦作為一種新型的抗生素，阿維巴坦本身的結(jié)構(gòu)是三乙烯二胺，因?yàn)槠洳痪哂笑聝?nèi)酰胺的骨架結(jié)構(gòu)故不易被水解，對A類、C類和部分D類酶均有較好的活性[18]，但B類的金屬酶沒有效果[19]。建議實(shí)驗(yàn)室結(jié)合自身?xiàng)l件選擇開展碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)或GeneXpert Carba-R測定法檢測CRE菌株，對于急癥患者可通過GeneXpert Carba-R快速鑒定碳青霉烯酶的基因型，為臨床提供早期治療的參考依據(jù)，然后再通過碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)碳青霉烯酶型，避免單一方法出現(xiàn)假陰性，可以為臨床提供更快速且準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果，協(xié)助臨床科室針對性的啟動抗感染治療。