lncRNA BLACAT1在下咽鱗狀細胞癌中介導(dǎo)自噬調(diào)控腫瘤細胞的化療敏感性

迪麗努爾·尼加提，楊 娜，古麗娜爾·吐爾地

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院放療中心，新疆 烏魯木齊 830000)

下咽鱗狀細胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma，HSCC)是一種發(fā)生于下咽部的侵襲性惡性腫瘤，約占所有頭頸部鱗狀細胞癌的5%。近年來，由于診斷技術(shù)和治療方式的改進，HSCC患者的生存率有所提高，但由于下咽組織結(jié)構(gòu)特殊，發(fā)病部位較為隱匿，多數(shù)患者確診時已處于晚期，并伴腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，導(dǎo)致其5年生存率低于50%[1-2]?；熓荋SCC的有效輔助治療手段；然而，化療抗性的出現(xiàn)和發(fā)展在很大程度上限制了其治療效果[3]。因此，深入了解HSCC化療抗性產(chǎn)生的分子機制對于HSCC的診斷、治療和預(yù)后至關(guān)重要。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一種長度超過200個核苷酸且沒有蛋白質(zhì)編碼潛力的調(diào)控型RNA，在各種基因表達和生物過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在包括HSCC在內(nèi)的癌癥發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，且其介導(dǎo)的化療抗性在大量研究中均有報道。如lncRNA UCA1在口腔鱗狀細胞癌的進展中發(fā)揮致癌作用，可調(diào)控腫瘤細胞的增殖、侵襲和凋亡，其表達降低可增強順鉑(cisplatin，DDP)誘導(dǎo)的細胞凋亡和化療敏感性[4]；lncRNA膀胱癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(bladder cancer associated transcript 1，BLACAT1)在喉鱗狀細胞癌中高表達，可通過促進腫瘤細胞遷移和抑制腫瘤細胞凋亡來觸發(fā)細胞對化療藥物的耐受性[5]。

lncRNA BLACAT1位于人類染色體1q32.1的基因座上，最初被發(fā)現(xiàn)于膀胱癌中，隨后研究發(fā)現(xiàn)其在胃癌、小細胞肺癌和結(jié)直腸癌等多種癌癥中過表達，并可促進癌細胞的增殖、遷移及侵襲等惡性行為過程[6-8]。然而，lncRNA BLACAT1在HSCC中的表達、功能以及對化療敏感性的作用尚不清楚。因此，本研究擬探討lncRNA BLACAT1在HSCC組織中的表達及其對腫瘤細胞DDP敏感性的影響，初步探究可能的作用機制，旨在為HSCC的靶向診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年6月至2020年12月在我院耳鼻咽喉科就診且接受HSCC腫瘤手術(shù)切除的患者40例，其中男33例，女7例；年齡35～68歲，平均(54.22±5.71)歲。收集術(shù)中切除的HSCC腫瘤組織標(biāo)本及對應(yīng)癌旁正常黏膜組織(癌旁組織，距離腫瘤外緣2 cm以上)，迅速置于液氮中冷凍后移至-80 ℃冰箱保存，所有腫瘤組織標(biāo)本經(jīng)病理科2位醫(yī)師證實為HSCC。患者術(shù)前均未行放療、化療或免疫治療等，臨床資料完整，本研究經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核(KY20180423031)，病例標(biāo)本收集前均告知患者或家屬。

1.2 主要材料與試劑

人HSCC細胞株FaDu及DDP耐藥細胞株FaDu/DDP(武漢淼靈生物)，DDP(美國Sigma公司)，胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)液(美國GibcoBRL公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量測定試劑盒(大連Takara公司)，TRIzol試劑和LipofectAMINE 3000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Invitrogen公司)，CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC/PI試劑盒(日本同仁化學(xué)公司)，免疫熒光染色試劑盒(北京索萊寶生物公司)，BCA蛋白測定試劑盒和ECL發(fā)光液(上海碧云天生物研究所)，兔抗人LC3B多克隆抗體、兔抗人Beclin-1多克隆抗體、兔抗人p62多克隆抗體、FITC偶聯(lián)的山羊抗兔、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠以及兔抗人GAPDH多克隆抗體(英國Abcam公司)。引物序列及siRNA序列由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。

1.3 RNA提取及qRT-PCR檢測

應(yīng)用TRIzol法分別提取HSCC組織、癌旁組織、FaDu細胞和FaDu/DDP細胞的總RNA，NanoVueTM Plus光度計檢測RNA的純度和濃度，取合格的RNA樣品(A260/A280為1.8～2.1)進行逆轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒說明書合成cDNA，再以cDNA為模板，使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行qRT-PCR擴增。擴增條件為：95 ℃ 5 min，循環(huán)1次；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s，循環(huán)40次。采用比較循環(huán)閾值2-ΔΔCt計算基因的相對表達水平，以GAPDH為內(nèi)參，各組設(shè)置3個復(fù)孔。引物序列如下：lncRNA BLACAT1上游5’-TGACGTCTTACTACACCCATCCT-3’，下游5’-CTGCCACCTATAGGAAATGCG-3’；GAPDH上游5’-TGTGA-AGGTCGGTGTGAAC-3’，下游5’-CAGATGGTGATGGG-CTGCC-3’。

1.4 CCK-8檢測細胞存活率

取生長狀態(tài)良好的FaDu細胞和FaDu/DDP細胞，按照1×104/孔的密度單層接種于96孔板，于37 ℃、5% CO2的孵育器中培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度(3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L)的DDP進行處理，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑液混勻繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用全自動酶標(biāo)儀在450 nm處檢測各孔細胞光密度(OD)值，計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗OD值-背景OD值)/(未經(jīng)處理OD值-背景OD值)×100%。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染、分組與DDP處理

轉(zhuǎn)染前24 h，取狀態(tài)良好的FaDu/DDP細胞按照1×104/孔的密度單層接種于24孔板，置于37 ℃、5% CO2的孵育器中培養(yǎng)。采用LipofectAMINE 3000轉(zhuǎn)染siRNA序列至FaDu/DDP細胞，其中對照組FaDu/DDP細胞正常培養(yǎng)；si-NC組FaDu/DDP細胞轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照；si-BLACAT1組FaDu/DDP細胞轉(zhuǎn)染siRNA-BLACAT1。轉(zhuǎn)染后收集細胞，qRT-PCR測定各組細胞內(nèi)lncRNA BLACAT1 mRNA表達量，以確定轉(zhuǎn)染是否成功。

使用不同濃度(3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L)的DDP處理各轉(zhuǎn)染組FaDu/DDP細胞，其中DDP組FaDu/DDP細胞僅加入不同濃度DDP處理，si-NC+DDP組FaDu/DDP細胞轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照后加入不同濃度DDP處理；si-BLACAT1+DDP組FaDu/DDP細胞轉(zhuǎn)染siRNA-BLACAT1后加入不同濃度DDP處理。培養(yǎng)48 h后，CCK-8檢測細胞存活率，非線性回歸計算si-BLACAT1+DDP組的IC50值。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況

收集轉(zhuǎn)染后經(jīng)DDP處理的各組FaDu/DDP細胞，胰酶消化，重懸于500 μL結(jié)合緩沖液中，接著在細胞懸浮液中依次加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI雙染色劑，混勻后室溫避光孵育15 min，流式細胞儀測定細胞凋亡情況。

1.7 自噬結(jié)構(gòu)分析

PBS洗滌各組FaDu/DDP細胞，加入含4%多聚甲醛和0.2%戊二醛的PBS固定，再用1%四氧化鋨固定，采用乙醇和丙酮進行分級脫水，包埋后切成超薄切片，采用3%檸檬酸鉛—醋酸雙氧鈾染色，銅網(wǎng)烤干，透射電子顯微鏡下成像，觀察細胞自噬情況。

1.8 免疫熒光染色觀察自噬斑點

各組FaDu/DDP細胞進行爬片，PBS洗滌后，4%多聚甲醛固定20 min，配制0.3% Triton X-100溶液并加入細胞中透化處理10 min，再用山羊血清封閉10 min，于4 ℃下加入兔抗人LC3B多克隆抗體(1∶200)反應(yīng)過夜；次日PBS洗滌，添加FITC偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(1∶500)室溫避光反應(yīng)1 h，再以DAPI復(fù)染5 min，封片。在共聚焦激光熒光顯微鏡下計數(shù)細胞內(nèi)LC3B熒光斑點數(shù)。

1.9 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達

收集各組FaDu/DDP細胞，采用RIPA裂解細胞，離心收集蛋白樣品，BCA法測定蛋白濃度。制備10% SDS-PAGE，按照每個泳道40 μg蛋白的量上樣，進行電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；TBST洗滌后置于5%山羊血清中室溫封閉2 h，棄去封閉液，TBST洗滌，加入一抗(LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1和p62)，均按照1∶1 000稀釋，4 ℃下孵育過夜。次日TBST洗膜后，與對應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫共同孵育2 h，結(jié)束后取膜，TBST再次洗滌，ECL試劑液顯影，Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，計算各蛋白表達量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HSCC組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA BLACAT1的表達

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，HSCC組織中l(wèi)ncRNA BLACAT1 mRNA相對表達量顯著高于癌旁組織(P<0.01)，見圖1。

**：與癌旁組織比較，P<0.01

2.2 FaDu細胞及FaDu/DDP細胞中l(wèi)ncRNA BLACAT1的表達

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與FaDu細胞比較，F(xiàn)aDu/DDP細胞中l(wèi)ncRNA BLACAT1 mRNA相對表達量較高(P<0.05)，見圖2。

*：與FaDu細胞比較，P<0.05

2.3 抑制lncRNA BLACAT1對DDP處理后FaDu/DDP細胞活性的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，si-BLACAT1組細胞lncRNA BLACAT1 mRNA相對表達量低于對照組和si-NC組(P<0.05)，見圖3a。CCK-8檢測結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度DDP處理后FaDu細胞和FaDu/DDP細胞存活率均呈下降趨勢，當(dāng)DDP作用濃度在6.25 μmol/L及以上時，F(xiàn)aDu/DDP細胞存活率高于FaDu細胞(P<0.05)，見圖3b。經(jīng)3.125 μmol/L及以上濃度DDP處理后，si-BLACAT1+DDP組細胞存活率低于DDP組和si-NC+DDP組(P<0.05)，見圖3c。si-BLACAT1+DDP組細胞對DDP的IC50值為24.29 μmol/L，因此后續(xù)選擇25 μmol/L濃度作為DDP的處理濃度。

a：轉(zhuǎn)染后各組FaDu/DDP細胞中l(wèi)ncRNA BLACAT1 mRNA的表達；b：不同濃度DDP處理后FaDu/DDP細胞存活率；c：不同濃度DDP處理后各轉(zhuǎn)染組FaDu/DDP細胞存活率 *：與對照組比較，P<0.05；#：與si-NC組比較，P<0.05；△：與FaDu細胞比較，P<0.05；▲：與DDP組比較，P<0.05；&：與si-NC+DDP組比較，P<0.05

2.4 抑制lncRNA BLACAT1對DDP處理后FaDu/DDP細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組比較，DDP組和si-NC+DDP組FaDu/DDP細胞凋亡率升高(P<0.05)；與DDP組和si-NC+DDP組比較，si-BLACAT1+DDP組細胞凋亡率也升高(P<0.05)，見圖4。

a:流式細胞術(shù)檢測FaDu/DDP細胞凋亡水平；b:FaDu/DDP細胞凋亡率 *：與對照組比較，P<0.05；#：與DDP組比較，P<0.05；△：與si-NC+DDP組比較，P<0.05

2.5 抑制lncRNA BLACAT1對DDP處理后FaDu/DDP細胞自噬的影響

透射電子顯微鏡觀察細胞自噬超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，對照組有一些自噬體和自噬溶酶體形成，DDP組和si-NC+DDP組內(nèi)自噬溶酶體形成均較多，且DDP組可見自噬體，而si-BLACAT1+DDP組細胞中未觀察到自噬體及自噬溶酶體，見圖5。免疫熒光染色結(jié)果顯示，各組細胞均有綠色斑點，DDP組和si-NC+DDP組細胞內(nèi)LC3B熒光斑點數(shù)較對照組增加(P<0.05)；si-BLACAT1+DDP組細胞內(nèi)LC3B熒光斑點數(shù)較DDP組和si-NC+DDP組均減少(P<0.05)，見圖6。說明si-BLACAT1+DDP組細胞自噬受到抑制。Western blot檢測結(jié)果亦顯示，與對照組比較，DDP組和si-NC+DDP組FaDu/DDP細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平上調(diào)，Beclin-1蛋白表達量上升，p62蛋白表達量下降(P<0.05)；與DDP組和si-NC+DDP組比較，si-BLACAT1+DDP組細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平下調(diào)，Beclin-1蛋白表達量下降，p62蛋白表達量上升(P<0.05)，見圖7。

M：線粒體；N：細胞核；紅色箭頭：自噬體；黃色箭頭：自噬溶酶體

a：免疫熒光染色觀察FaDu/DDP細胞中LC3B熒光斑點；b：LC3B熒光斑點數(shù) *：與對照組比較，P<0.05；#：與DDP組比較，P<0.05；△：與si-NC+DDP組比較，P<0.05

a：Western blot檢測FaDu/DDP細胞自噬相關(guān)蛋白表達；b：FaDu/DDP細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平；c:FaDu/DDP細胞中Beclin-1蛋白相對表達；d:FaDu/DDP細胞中p62蛋白相對表達 1:對照組;2:DDP組；3:si-NC+DDP組；4：si-BLACAT1+DDP組；*：與對照組比較，P<0.05；#：與DDP組比較， P<0.05；△：與si-NC+DDP組比較，P<0.05

3 討論

HSCC是惡性程度較高的頭頸癌之一，近年來其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈升高趨勢。雖然有手術(shù)切除、化療和放療等綜合治療方法，但HSCC患者的預(yù)后仍然很差?；熆剐允菍?dǎo)致HSCC治療失敗的重要因素，盡管目前已經(jīng)進行了大量研究以尋找導(dǎo)致各種腫瘤類型化療抗性的因素，但關(guān)于HSCC化療抗性的潛在機制仍尚未完全明確。DDP是一種鉑類抗癌藥物，可用于多種癌癥的治療，但其存在嚴(yán)重的副作用，且患者長期使用DDP會產(chǎn)生化療抗性，使得該藥物的臨床應(yīng)用受到限制[9]。因此，探究HSCC中DDP抗性獲得的分子機制對于提高HSCC患者的治療效果至關(guān)重要。

本研究結(jié)果顯示，HSCC組織中l(wèi)ncRNA BLACAT1的表達明顯高于癌旁組織，提示lncRNA BLACAT1可能參與調(diào)控HSCC的相關(guān)病理過程。lncRNA在細胞生物學(xué)行為中的分子機制極其復(fù)雜，以往研究表明，lncRNA BLACAT1在不同癌癥組織及細胞中廣泛異常表達，并具有一定的調(diào)控作用。Li等[10]發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織及其5個不同細胞系中l(wèi)ncRNA BLACAT1表達均升高，并可通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲。Xu等[11]發(fā)現(xiàn)，lncRNA BLACAT1的高表達與非小細胞肺癌的總生存期和無進展生存期縮短顯著相關(guān)，沉默lncRNA BLACAT1通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和Wnt/β-catenin信號通路從而抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)aDu/DDP細胞中l(wèi)ncRNA BLACAT1表達水平高于FaDu細胞，由此推測，lncRNA BLACAT1可能參與HSCC細胞DDP化療抗性的產(chǎn)生。以往研究探討了lncRNA BLACAT1在化療敏感性方面的作用，結(jié)果顯示，在阿法替尼耐藥的非小細胞肺癌細胞中l(wèi)ncRNA BLACAT1表達升高，下調(diào)其表達可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對阿法替尼的耐藥性[12]；lncRNA BLACAT1在奧沙利鉑抗性胃癌組織和細胞中的表達均高于奧沙利鉑敏感的胃癌組織和細胞，沉默lncRNA BLACAT1可促進體內(nèi)外奧沙利鉑抗性胃癌細胞的凋亡，并抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[13]。本研究在FaDu/DDP細胞中抑制lncRNA BLACAT1表達，并經(jīng)DDP處理后FaDu/DDP細胞存活率降低，細胞凋亡率升高，提示抑制lncRNA BLACAT1表達可提高HSCC耐藥細胞對DDP的敏感性，進一步明確了lncRNA BLACAT1參與腫瘤細胞化療抗性的產(chǎn)生。

有研究顯示，參與腫瘤細胞化療抗性形成的機制較多，如DNA損傷修復(fù)、細胞凋亡抗性、溶酶體膜透化、細胞周期阻滯和自噬等[14-15]。自噬作為一種高度進化的保守過程，幾乎發(fā)生在所有真核細胞中，并與各種生理和病理過程有關(guān)；在該過程中無功能和受損細胞器被降解，以獲取能量及完成細胞器的更新，滿足細胞的基本代謝需要，自噬介導(dǎo)的強大保護作用使得細胞能夠?qū)Ω鞣N內(nèi)在或外在刺激作出反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，化療可促進自噬過程，而抑制自噬可增加化療誘導(dǎo)的細胞凋亡[16-18]。本研究通過DDP處理FaDu/DDP細胞后發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)自噬體和自噬溶酶體的形成增加，LC3B熒光斑點數(shù)增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平上調(diào)，Beclin-1蛋白表達量上升，p62蛋白表達量下降；而在抑制lncRNA BLACAT1的表達后，細胞內(nèi)未觀察到自噬體及自噬溶酶體，LC3B熒光斑點數(shù)減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平下調(diào)，Beclin-1蛋白表達量下降，p62蛋白表達量上升，表明抑制lncRNA BLACAT1表達可減少FaDu/DDP細胞自噬，從而促進DDP誘導(dǎo)的FaDu/DDP細胞凋亡。

綜上所述，lncRNA BLACAT1在HSCC組織及DDP耐藥細胞株FaDu/DDP中高表達，通過外源性抑制lncRNA BLACAT1的表達能夠減少自噬，逆轉(zhuǎn)FaDu/DDP細胞對DDP的耐藥性，提示lncRNA BLACAT1可作為HSCC化療的耐藥分子標(biāo)志物。但本研究只對lncRNA BLACAT1影響HSCC化療敏感性的可能機制進行了初步探索，后續(xù)需進一步明確其具體分子機制，完善lncRNA BLACAT1在HSCC中的相關(guān)作用，為HSCC的精準(zhǔn)化治療提供有力的實驗依據(jù)。