枸杞脂溶性物質(zhì)的中試提取、成分分析及主要類胡蘿卜素單體的制備

米 佳，羅 青，祿 璐，金 波，李曉鶯，曹有龍，閆亞美

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002）

枸杞（Lycium barbarumL.）屬于茄科（Solanaceae）枸杞屬（LyciumL.），其果實富含多種功效物質(zhì)，其中包括兩種主要的脂溶性物質(zhì)，一種是類胡蘿卜素類物質(zhì)尤其是玉米黃素雙棕櫚酸酯[1]，多項研究已證實，該物質(zhì)對肝臟具有突出的保護(hù)作用，能夠緩解由四氯化碳引起的小鼠肝細(xì)胞損傷[2]，對一般性肝損傷、肝纖維化程度和肝內(nèi)氧化應(yīng)激壓力[3]，乙肝[4]等引起的肝損傷有緩解和改善作用，其對肝臟的保護(hù)能力與公認(rèn)的肝臟保護(hù)劑-水飛薊素相當(dāng)，且具有良好的抗氧化活性[5]。另一種是脂肪酸，主要存在于枸杞籽中，枸杞籽中脂肪酸的含量大約為12%~17%[6]，這其中大約有90%為不飽和脂肪酸[7]，這類物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的脂類代謝、免疫，具有抗癌、預(yù)防和治療心血管疾病、促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育以及調(diào)控基因的表達(dá)等功能[8]。

超臨界CO2提取技術(shù)是利用CO2在超臨界狀態(tài)下對溶質(zhì)有很高的溶解能力，而在非超臨界狀態(tài)下對溶質(zhì)的溶解能力又很低的這一特性，來實現(xiàn)對目標(biāo)成分的提取和分離[9]。近年來逐漸應(yīng)用于具有高附加值的油脂類物質(zhì)的提取，如類胡蘿卜素[10]、脂溶性維生素[11]、咖啡豆油[12]等，具有傳質(zhì)速率快、提取率高、操作條件溫和、無有機(jī)溶劑殘留等特點(diǎn)。該項技術(shù)在枸杞脂溶性物質(zhì)，包括枸杞籽油、枸杞類胡蘿卜素的提取中已有應(yīng)用。目前超臨界CO2應(yīng)用于枸杞研究中多為單一玉米黃素或脂肪酸的提取，例如Guo 等[13]用正交試驗優(yōu)化了枸杞籽油的提取工藝；周學(xué)義[14]以乙醇為夾帶劑，獲得了從枸杞中提取玉米黃質(zhì)的超臨界提取方法；牛東玲等[15]獲得了枸杞脂溶性色素的超臨界小量制備工藝，所得脂溶性成分為β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)和玉米黃素。而對于同時提取包括玉米黃素雙棕櫚酸酯等類胡蘿卜素和脂肪酸的中試提取工藝研究極少報道。

枸杞富含水溶性的小分子糖（主要是果糖和葡萄糖）[16]，在實際生產(chǎn)中，伴隨著提取壓力或溫度的升高，料渣易黏結(jié)，一方面造成提取不完全、提取率降低，另一方面，粘結(jié)在萃取釜中的料塊難以取出，嚴(yán)重影響了生產(chǎn)。本研究在項目組現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上，將枸杞子原料進(jìn)行降糖處理后，以乙醇為助溶劑，研究枸杞脂溶性物質(zhì)的超臨界提取中試生產(chǎn)工藝，對其類胡蘿卜素和脂肪酸成分進(jìn)行分析，并制備了主要類胡蘿卜素-玉米黃素雙棕櫚酸酯的單體。為枸杞子脂溶性化合物的研究和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞（統(tǒng)貨） 購自寧夏中寧枸杞交易市場；超純CO2純度>99.99%，寧夏寧豐制氧廠；β-胡蘿卜素（HPLC 純度≥96%）、玉米黃素雙棕櫚酸酯（HPLC 純度≥98%） 瑞士Carote Nature；甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚、二氯甲烷 色譜純，F(xiàn)isher chemical；正庚烷、甲苯、異辛烷 色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；單個脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、37 種脂肪酸甲酯混標(biāo) 上海安譜實驗科技股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

HA220-40-48 超臨界萃取裝置 江蘇南通市華安超臨界萃取有限公司；TU-1810 紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；R-300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士步琪有限公司；BS224S 電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；1260 高效液相色譜儀（包括G1311C 泵，G1329B 自動進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1315D DAD 檢測器） 美國安捷倫科技有限公司；SZM-20 超微粉碎機(jī) 山東泰安正信科技有限公司；超純水制備系統(tǒng) 美國Millipore 公司；GC-2010 Plus 氣相色譜儀 日本島津；SP-2560（100 m×0.25 mm，0.2 μm）毛細(xì)管色譜柱 上海安譜實驗科技股份有限公司；DZKW-D-1 恒溫水浴 上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司；LD5-2B 離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞原料的預(yù)處理 參考文獻(xiàn)方法[17]，將枸杞子除雜后取20 kg 置于6 倍質(zhì)量的、45 ℃溫水中，攪拌并浸泡30 min，瀝水，重復(fù)操作4 次，瀝水后50 ℃熱風(fēng)烘干，粉碎過100 目篩后備用。

1.2.2 預(yù)處理前后枸杞總類胡蘿卜素、總糖及多糖含量的測定 預(yù)處理前后枸杞中的總類胡蘿卜素、總糖和多糖用下列方法進(jìn)行測定，測定前將樣品放置烘箱50 ℃烘至恒重。

1.2.2.1 總類胡蘿卜素的測定 參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行測定[18]。稱取枸杞樣品約2 g，加3 粒BHT 后加液氮研磨，用10 mL 四氫呋喃超聲（功率為360 W）提取10 min，過濾后收集濾液，濾渣用相同提取工藝提取至無色，合并濾液后，加20 g 無水硫酸鈉脫水過濾，于35 ℃濃縮蒸干。然后用石油醚溶解并定容至25 mL，紫外分光光度計測定在460 nm 處的吸光度A。同法制備不同濃度的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.0127x+0.029，決定系數(shù)R2=0.9993，x 為類胡蘿卜素含量（μg/mL），線性范圍為0.5~5.0 μg/mL，y 為吸光值，并由此計算總類胡蘿卜素的含量。

1.2.2.2 總糖和多糖含量的測定 總糖的測定參考文獻(xiàn)方法[19]，以1:10 的料液比，沸水提取20 min，再重復(fù)提取兩次后合并濾液即得到總糖提取液。以蒽酮比色法進(jìn)行測定，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0603x+0.0312，其中y 軸為630 nm 處的吸光度值，x 軸為葡萄糖的濃度，x 軸的線性范圍為0~16 μg·mL?1，決定系數(shù)R2=0.9991。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中總糖的含量。

枸杞多糖的測定參考文獻(xiàn)方法[20]，以1:25 的料液比，用90 ℃的水超聲（240 W）提取20 min 后濃縮，以4 倍體積的無水乙醇醇沉過夜即得到枸杞多糖，以苯酚硫酸法進(jìn)行測定，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=48.921x?0.0023，其中y 軸為490 nm處的吸光度值，x 軸為葡萄糖的濃度，x 軸的線性范圍為1~18 μg·mL?1，決定系數(shù)R2=0.9991。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中多糖的含量。

1.2.3 超臨界CO2提取枸杞脂溶性物質(zhì)的工藝流程及優(yōu)化

1.2.3.1 工藝流程 稱取枸杞粉10 kg，按照比例加入乙醇，裝入20 L 的萃取釜內(nèi)，設(shè)定溫度，通入CO2氣體并設(shè)定壓力，待壓力穩(wěn)定開始計時，進(jìn)行一定時間的靜態(tài)提取，然后打開氣體出口閥門，開始動態(tài)提取，收集提取產(chǎn)物，減壓濃縮除去乙醇后即得到枸杞脂溶性物質(zhì)。

1.2.3.2 單因素實驗 分別考察提取提取壓力（24、26、28、30、32 MPa），溫度（35、40、45、50、55 ℃），乙醇添加量（0、5%、10%、15%、20%）和提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）對枸杞脂溶性物質(zhì)得率的影響?？疾炷骋粏我蛩貢r，其他因素的固定水平為：提取溫度45 ℃，提取時間2 h，提取壓力28 MPa，乙醇添加量10%。

1.2.3.3 正交試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，并考慮能耗，選用正交表進(jìn)行實驗，考察脂溶性物質(zhì)的得率，所采用的因素和水平見表1。

表1 正交設(shè)計試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment list

1.2.3.4 枸杞脂溶性物質(zhì)得率的計算 將1.2.3.1 中的枸杞脂溶性物質(zhì)稱重后計算得率，枸杞脂溶性物質(zhì)得率（%）=脂溶性物質(zhì)的質(zhì)量/裝料量×100。

1.2.4 枸杞脂溶性物質(zhì)的成分分析

1.2.4.1 類胡蘿卜素含量的測定 a.總類胡蘿卜素的測定：稱取枸杞脂溶性物質(zhì)0.2 g，用石油醚定容到5 mL 待測，測定方法同1.2.2.1。

b.類胡蘿卜素主要組分的測定：稱取約35 mg 枸杞脂溶性物質(zhì)用二氯甲烷溶解定容至100 mL，參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行測定[18]。對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下，β-胡蘿卜素為：y＝1415.0476x+1.7267，決定系數(shù)R2=0.9996，線性范圍0~0.1 μg；玉米黃素雙棕櫚酸酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=5748.9452x?32.7139，決定系數(shù)R2=1.0000，線性范圍0~3 μg。

1.2.4.2 脂肪酸含量的測定 參照GB 5009.168-2016中的外標(biāo)法進(jìn)行測定。稱取枸杞脂溶性物質(zhì)2 g 加入10 mL 鹽酸，75 ℃振蕩水浴中水解40 min，冷卻后加入95%的乙醇溶液10 mL，用50 mL 石油醚提取3 次后得到脂肪，繼續(xù)用2%的氫氧化鈉甲醇溶液回流皂化后，最后加入15 mL 正庚烷進(jìn)行甲酯化得到待測液。色譜條件：色譜柱：SP-2560 毛細(xì)管色譜柱（100 m×0.25 mm，0.2 μm）；升溫程序：100 ℃保持5 min，10 ℃/min 升至200 ℃，保持2 min，1 ℃/min升至225 ℃，保持8 min，4 ℃/min 升至240 ℃保持5 min；載氣：氮?dú)?；流速?.0 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比：100:1；汽化室溫度：240 ℃；檢測器溫度：260 ℃。

1.2.5 枸杞主要類胡蘿卜素—玉米黃素雙棕櫚酸酯單體的制備 用高效液相色譜法制備枸杞玉米黃素雙棕櫚酸酯單體[18]。稱取枸杞脂溶性物質(zhì)0.2 g 溶解于1 mL 二氯甲烷，過0.22 μm 濾膜后等待進(jìn)樣。色譜條件：色譜柱：YMC C30 色譜柱（250 mm×20 mm，5 μm）；洗脫液：A 相：甲醇:乙腈:水:三乙胺=81:14:5:0.08（v/v），B 相：甲基叔丁基醚:二氯甲烷=1:1（v/v）；洗脫梯度：0~7 min：B 16%~75%，7~11 min：B 75%~49.4%；11~17 min：B 49.4%~16%；進(jìn)樣量：300~800 μL，檢測波長：450 nm；餾分收集以基于色譜峰的模式，采用1.2.4.1b 中的方法進(jìn)行測定分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS 軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），采用Ducan 法對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平為0.05，所有實驗均重復(fù)三次，正交實驗采用Desin-Expert 軟件進(jìn)行設(shè)計，采用Origin軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理對枸杞主要成分的影響

枸杞中含有大量水溶性的小分子糖，而超臨界提取是在高溫和高壓的狀態(tài)下進(jìn)行的，這就使得提取過程中料渣黏結(jié)，影響提取效率，因此，本實驗采用水提法除掉樣品中的部分可溶性糖，以此提高枸杞脂溶性物質(zhì)的得率。如表2 所示，枸杞樣品經(jīng)預(yù)處理后，單位質(zhì)量的原料中總類胡蘿卜素含量較處理前提高2.67 倍，總糖含量降低了約50%，多糖含量降低了21.41%，這是因為樣品在預(yù)處理的時候用水提法去除可溶性糖的同時損失掉了部分多糖?？偺呛康慕档涂梢杂行p少物料在提取時的粘結(jié)，提高得率。

表2 預(yù)處理前后枸杞主要成分含量Table 2 The main contents ofLycium barbarumL. before and after pretreatment

2.2 單因素結(jié)果分析

超臨界提取枸杞脂溶性物質(zhì)的單因素實驗結(jié)果如圖1 所示，隨著提取壓力的增大，得率不斷增大，在壓力為30 MPa 時得率達(dá)到最高值，這是因為增大壓力能夠有效破壞植物組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使得脂溶性物質(zhì)溶出，從而增大了得率[21]，但繼續(xù)增大壓力得率會呈現(xiàn)下降的趨勢，這可能是壓力增大使得粉末的堆密度增加，降低了擴(kuò)散能力，且CO2在物料中的傳質(zhì)時間變短，從而使得率降低[22]。

圖1 單因素對枸杞脂溶性物質(zhì)得率的影響Fig.1 Influence of single factor on the yield of fat soluble substance fromLycium barbarumL.

脂溶性物質(zhì)的得率隨著提取溫度的增加呈現(xiàn)先升高再降低趨勢，在45 ℃時得率最高。之后隨著提取溫度的增加，得率呈現(xiàn)下降的趨勢，這是因為當(dāng)大于一定溫度時，高溫會對類胡蘿卜素、脂肪酸等物質(zhì)造成破壞，造成類胡蘿卜素的降解和異構(gòu)化[23]。

隨著乙醇添加量的增大和提取時間的延長，得率呈現(xiàn)先迅速增長后趨于平穩(wěn)的趨勢。類胡蘿卜素是一類低極性物質(zhì)，添加乙醇等夾帶劑能夠幫助其在CO2中的溶解，從而提高類胡蘿卜素的得率[24]，增加提取時間能使提取過程更充分，但隨著提取時間的延長，傳質(zhì)達(dá)到了頂點(diǎn)，效率開始降低，單位時間內(nèi)的得率降低[25]。而助溶劑的添加量越多，后期產(chǎn)品中除掉助溶劑所需的能耗也越大，提取時間的不斷延長也會造成能耗與產(chǎn)率不平衡，綜合考慮儀器耐壓和能耗問題，設(shè)計正交試驗繼續(xù)進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化。

2.3 正交試驗結(jié)果分析

2.3.1 正交試驗結(jié)果 以脂溶性物質(zhì)的得率為評價指標(biāo)。表3 結(jié)果表明，在本實驗方案所取得的因素和水平下，最佳處方工藝組合為A2B2C3D1，各因素的重要指標(biāo)程度依次為C>A>B>D。即乙醇添加量>提取溫度>提取壓力>提取時間。

表3 L9（34）正交試驗結(jié)果Table 3 Results of L9(34) orthogonal experiments

2.3.2 驗證試驗 根據(jù)正交試驗的結(jié)果，超臨界CO2提取枸杞脂溶性物質(zhì)的最佳工藝條件為A2B2C3D1，按照此試驗條件進(jìn)行驗證，得到超臨界提取枸杞脂溶性物質(zhì)的得率為8.56%，優(yōu)于正交試驗各組的試驗結(jié)果，表明該優(yōu)化工藝條件結(jié)果可靠。即當(dāng)提取溫度為45 ℃，提取壓力為30 MPa，乙醇添加量為15%，提取時間為1.5 h 時枸杞脂溶性物質(zhì)的得率最高。

2.4 枸杞脂溶性物質(zhì)的成分分析

為考察枸杞脂溶性物質(zhì)的品質(zhì)，選取9 組正交試驗及優(yōu)化試驗的枸杞脂溶性物質(zhì)進(jìn)行類胡蘿卜素和脂肪酸的含量和組分分析。

2.4.1 枸杞脂溶性物質(zhì)中的類胡蘿卜素 將枸杞脂溶性物質(zhì)用二氯甲烷溶解后進(jìn)行HPLC 分析，枸杞脂溶性物質(zhì)中總類胡蘿卜素及主要組分的含量見表4，不同提取工藝下總類胡蘿卜素的含量和組分差異較大，其中類胡蘿卜素的主要成分為玉米黃素雙棕櫚酸酯，部分工藝條件下提取的脂溶性產(chǎn)物中檢測到少量的β-胡蘿卜素，總類胡蘿卜素的含量約為17.59~39.52 mg·g?1，而玉米黃素雙棕櫚酸酯占總類胡蘿卜素的45.01%~82.07%，在6 號實驗工藝條件下獲得的脂溶性物質(zhì)，總類胡蘿卜素含量最高為39.52 mg/g，其次為8 號實驗工藝條件下獲得的脂溶性物質(zhì)，總類胡蘿卜素含量為37.64 mg/g，而得率最高的優(yōu)化工藝，其總類胡蘿卜素含量僅為32.75 mg/g。

表4 類胡蘿卜素含量結(jié)果Table 4 Results of carotenoids contents

2.4.2 枸杞脂溶性物質(zhì)中的脂肪酸 枸杞中的脂肪酸主要來自于枸杞籽，枸杞籽油中大約含有12%~17%的脂肪酸，其中約90%為不飽和脂肪酸，其主要成分為亞油酸和油酸，含量分別為63%~72%和15%~21%[6?7,26]。不同提取條件下脂肪酸的組分含量有所差異，已報道含有長碳鏈的甘油酯的溶解度會隨著壓力的升高而增大[27]，隨著提取時間的延長，高碳鏈的脂肪酸甘油酯得率會顯著增大，而碳鏈短、分子量越低的脂肪酸甘油酯在超臨界CO2中的溶解度較大，在提取開始時更容易被提取出[28?29]。本研究采用GC-MS 分析了超臨界CO2提取的枸杞脂溶性物質(zhì)中的脂肪酸種類和含量，枸杞脂溶性物質(zhì)中的脂肪酸種類和含量如表5 所示，不同提取工藝條件下枸杞脂溶性物質(zhì)中的脂肪酸種類和含量有所差異，共檢測出脂肪酸10~11 種，其中不飽和脂肪酸有5 種，不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的79.83%~87.94%。飽和脂肪酸有6 種，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比值為13.71%~25.26%。枸杞果實脂溶性物質(zhì)中的脂肪酸含量最高的成分為亞油酸、油酸和棕櫚酸，分別占總脂肪酸含量的55.53%~65.50%、17.78%~19.11%和8.26%~14.30%。在8 號實驗工藝條件下獲得的脂溶性物質(zhì)，其脂肪酸含量最高，為92.061%，不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的比例也最高，為87.94%；在優(yōu)化工藝條件下獲得的脂溶性物質(zhì)，其脂肪酸含量遠(yuǎn)低于8 號實驗工藝條件。

表5 枸杞脂溶性物質(zhì)中脂肪酸組成及含量Table 5 Composition and content of fatty acids in fat-soluble substances ofLycium barbarumL.

綜上，不同提取工藝條件下枸杞脂溶性物質(zhì)的成分組成有較大的差異，對比9 組正交實驗和優(yōu)化實驗，在8 號實驗工藝條件下脂溶性物質(zhì)的得率為8.55%，僅次于優(yōu)化實驗，而其中的脂肪酸含量最高，不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的比例也最高，為87.94%，總類胡蘿卜的含量相對較高，為37.64 mg/g，該工藝條件下脂溶性物質(zhì)的不飽和脂肪酸含量和總類胡蘿卜素含量均高于優(yōu)化工藝；因此，在綜合考慮脂溶性物質(zhì)的得率和品質(zhì)的情況下，確定枸杞脂溶性物質(zhì)的最佳提取工藝為：提取溫度50 ℃，壓力30 MPa，乙醇添加量15%，提取時間1.5 h。

2.5 枸杞主要類胡蘿卜素單體的制備

用高效液相色譜制備枸杞脂溶性物質(zhì)的主要胡蘿卜素組分Ⅰ，玉米黃素雙棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)品與組分Ⅰ的HPLC 色譜圖見圖2，由圖2 可見，玉米黃素雙棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為50.096 min，枸杞類胡蘿卜素組分Ⅰ的保留時間為50.401 min，標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的保留時間相近，可以判斷組分Ⅰ為玉米黃素雙棕櫚酸酯。利用1.2.4.1b 中的玉米黃素雙棕櫚酸酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計算得出組分Ⅰ的純度為99.13%。玉米黃素雙棕櫚酸酯是枸杞中的特征性類胡蘿卜素，在護(hù)肝、抗氧化等方面具有優(yōu)異的功效，該單體可以為玉米黃素雙棕櫚酸酯的定性、定量分析提供高純度的對照品或用于功效作用的研究等。

圖2 玉米黃素雙棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)品（a）和類胡蘿卜素組分Ⅰ（b）的HPLC 譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of standard zeaxanthin dipalmitate (a) and carotenoids fraction Ⅰ (b)

3 結(jié)論

本文首先將干果枸杞降糖后采用超臨界CO2提取枸杞中的脂溶性物質(zhì)，并分析了脂溶性物質(zhì)中的脂肪酸和類胡蘿卜素的含量，綜合考慮得率，不飽和脂肪酸含量和比例、總類胡蘿卜素含量后，獲得枸杞脂溶性物質(zhì)最佳中試提取工藝：提取溫度為50 ℃，壓力為30 MPa，乙醇添加量為15%，提取時間為1.5 h；并采用高效制備液相制得了純度>99%玉米黃素雙棕櫚酸酯單體。為枸杞果實脂溶性物質(zhì)的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持，為枸杞特征功效成分玉米黃素雙棕櫚酸酯的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。