固、液兩種培養(yǎng)方式下蟲草粗多糖提取研究

朱 燕，鄧春英 ，康 超

（1.貴陽(yáng)學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550005；2.貴州科學(xué)院 貴州省生物研究所，貴州 貴陽(yáng) 550001）

蟲草是對(duì)整個(gè)蟲草屬真菌的通稱，隸屬于子囊菌亞門，肉座菌目、麥角科、蟲草屬。蟲草菌不僅被用于有害昆蟲的生物防治，而且也是有名的珍貴食用藥用菌。尤其近年來(lái)對(duì)蟲草的藥用研究更加深入，開發(fā)利用也是大力推廣。自然界中野生蟲草資源有限，市場(chǎng)中的蟲草主要依靠人工培植。目前蟲草的培植方法主要有以下3 種：一是將蟲草菌接種于固體（大米）培養(yǎng)基上，控制培養(yǎng)條件來(lái)生產(chǎn)蟲草子實(shí)體；二是制備液體培養(yǎng)基，采用液體發(fā)酵的方式培養(yǎng)蟲草；三是將蟲草菌接種于柞蠶、家蠶幼蟲活蛹體內(nèi)，控制培養(yǎng)條件以獲得完整的蛹蟲草。本實(shí)驗(yàn)選用第一種和第二種方式培養(yǎng)蟲草，培養(yǎng)結(jié)束后用熱水浸提法對(duì)其子實(shí)體、菌絲球、發(fā)酵液及大米培養(yǎng)基進(jìn)行粗多糖的提取。蛹蟲草多糖可活化巨噬細(xì)胞刺激抗體產(chǎn)生，提高人體免疫能力，其抗腫瘤活性也逐漸被人們公認(rèn)。本次實(shí)驗(yàn)中所得菌種也包含蛹蟲草菌種在內(nèi)，其他蟲草多糖也同樣有廣泛應(yīng)用。為了能從蟲草中獲得更多粗多糖，本文提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、馬鈴薯葡萄糖瓊脂，上海博微生物科技有限公司；無(wú)水乙醇，重慶川東化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

141L 冰箱：青島海爾股份有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；1-5mL 單道可調(diào)移液器：上海寶予德科學(xué)儀器有限公司；電子天平：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；高速冷凍離心機(jī)：四川蜀科儀器有限公司；中草藥粉碎機(jī)：北京市泰和格潤(rùn)儀器有限公司；人工氣候箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；0～150 mm 數(shù)顯卡尺：桂林廣陸數(shù)字測(cè)控股份有限公司；電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 菌種

菌種采用樣本編號(hào)為：

1.蟬花 Isaria farinosa GY2019 072801；

2.蟬花 Isaria farinosa LGS2019 062008；

3.新古尼蟲草Metacordyceps neogunnii GN16-1-F6；

4.蛹蟲草Cordyceps militaris B1528；

5.蟬花 Isaria farinosa LGS2019062114

1.4 方法

1.4.1 PDA 平板培養(yǎng)

制備培養(yǎng)基：稱取12.03 g PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）倒入燒杯中加蒸餾水?dāng)嚢枋蛊淙芙猓偌诱麴s水定容至330 mL 即得。以同樣方式制備3瓶，用硅膠塞塞住錐形瓶瓶口，報(bào)紙封口，用皮筋固定報(bào)紙后，放入高壓滅菌鍋里滅菌30 min，溫度為121℃。滅菌后每個(gè)平板中倒入20 mL 左右的PDA 培養(yǎng)基，放冷。活化：將保存好的5 個(gè)種的試管菌種轉(zhuǎn)接到PDA 培養(yǎng)基上置于人工氣候箱中培養(yǎng)1 周（溫度25℃）。活化后用0.6 cm 打孔器在活化好的菌種上打孔后挑取菌塊放于已凝固的PDA 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2 周，詳細(xì)記錄生長(zhǎng)特征，測(cè)量菌塊長(zhǎng)度。

1.4.2 固體培養(yǎng)及粗多糖提取

（1）固體培養(yǎng)。配固體培養(yǎng)基：稱取23.1 g葡萄糖，23.1 g 蛋白胨，磷酸二氫鉀1.16 g，硫酸鎂0.5775 g，用蒸餾水定容到1.155 L，分別裝入15個(gè)錐形瓶里（5 個(gè)種，每個(gè)種接3 瓶），每個(gè)錐形瓶裝70 ml，裝好后用硅膠塞塞住錐形瓶瓶口，報(bào)紙封口，用皮筋固定報(bào)紙后，放入高壓滅菌鍋里滅菌30 分鐘，溫度為121℃。

（2）粗多糖的提取。培養(yǎng)3 個(gè)月后，待5 個(gè)菌種子實(shí)體均長(zhǎng)滿后采收，培養(yǎng)基和子實(shí)體分別烘干后用粉碎機(jī)打成粉末，5 個(gè)種每個(gè)種子實(shí)體與培養(yǎng)基做3 組，每組稱取3 g 粉末于燒杯中，加入蒸餾水，放在恒溫水浴鍋中用熱水浸提法進(jìn)行粗多糖的提取（料液比1:80，溫度90℃，時(shí)間3 h，重復(fù)提取3 次）。提取完成后用4 層紗布過(guò)濾，棄去濾渣，濾液裝入離心管離心，轉(zhuǎn)速3000 r/min，時(shí)間10 min，溫度15℃。離心后倒出上清液，棄去沉淀，上清液用電爐濃縮至150 ml，加入3 倍量體積的無(wú)水乙醇過(guò)夜沉淀后離心，轉(zhuǎn)速為5000 r/min，時(shí)間20 min，溫度15℃。棄去上清液，將沉淀用培養(yǎng)皿裝好后放在烘箱中40℃烘干即得粗多糖成品，稱重。

1.4.3 液體發(fā)酵及粗多糖提取

（1）液體發(fā)酵。配制液體培養(yǎng)基：稱取69.3 g葡萄糖，69.3 g 蛋白胨磷酸二氫鉀3.48 g，硫酸鎂1.7325 g，用蒸餾水定容到3.465 L 即得，裝入15個(gè)錐形瓶（5 個(gè)種，每個(gè)種接3 瓶），每個(gè)錐形瓶裝200 mL，用硅膠塞塞住錐形瓶瓶口，報(bào)紙封口，用皮筋固定報(bào)紙后，放入高壓滅菌鍋里滅菌30 min，溫度為121℃。紫外燈消毒后用0.8 cm 打孔器在已培養(yǎng)2 周的PDA 培養(yǎng)基上打孔后挑取菌塊3 塊放入液體培養(yǎng)基中，塞上硅膠塞，對(duì)液體培養(yǎng)基進(jìn)行編號(hào)，編號(hào)要與PDA 培養(yǎng)基編號(hào)對(duì)應(yīng)。用報(bào)紙包住瓶口，放在搖床上培養(yǎng)一周，培養(yǎng)溫度25℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min。

（2）粗多糖的提取。胞外粗多糖：液體發(fā)酵一周后，用濾紙過(guò)濾，過(guò)濾液濃縮至150 mL，加入3 倍量體積的無(wú)水乙醇過(guò)夜沉淀后離心，轉(zhuǎn)速為5000 r/min，時(shí)間20min，溫度為15℃，離心后棄去上清液，用培養(yǎng)皿裝好沉淀后放在烘箱中40℃烘干即得胞外粗多糖成品，稱重。在相同條件下，每個(gè)種分別做3 組。胞內(nèi)粗多糖：濾紙過(guò)濾的菌絲球用培養(yǎng)皿裝好后置于烘箱中50℃烘2 天，烘干后打粉，每個(gè)種分別做2 組，每組稱取2 g 粉末于燒杯中，加入蒸餾水，置于恒溫水浴鍋中熱水浸提（料液比1:80，溫度90℃，時(shí)間3 h，重復(fù)提3次）。提取完成后用4 層紗布過(guò)濾，棄去濾渣，濾液裝入離心管離心，轉(zhuǎn)速3000 r/min，時(shí)間10 min，溫度15℃。離心后倒出上清液，棄去沉淀，上清液濃縮至150 mL，加入3 倍量體積的無(wú)水乙醇過(guò)夜沉淀后離心，轉(zhuǎn)速為5000 r/min，時(shí)間20 min，溫度15℃。棄去上清液，將沉淀用培養(yǎng)皿裝好后放在烘箱中40℃烘干后即得胞內(nèi)粗多糖成品，稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)處理

（1）由固體培養(yǎng)粗多糖得率（mg/g）=粗多糖質(zhì)量（g）*1000/稱取子實(shí)體或培養(yǎng)基粉末質(zhì)量（g），總量（mg）=得率（mg/g）*子實(shí)體或培養(yǎng)基干重（g）計(jì)算相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1、表2。

表1 固體培養(yǎng)子實(shí)體中的粗多糖

表2 固體培養(yǎng)培養(yǎng)基中的粗多糖

（2）由液體發(fā)酵菌絲球粗多糖得率（mg/ g）=粗多糖質(zhì)量（g）*1000/稱取菌絲球粉末質(zhì)量（g），發(fā)酵液粗多糖得率（mg/ mL）=胞外多糖質(zhì)量（g）*1000/發(fā)酵液體積（mL）計(jì)算相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3、表4。

（表3 胞外（發(fā)酵液）粗多糖）

表4 胞內(nèi)（菌絲）粗多糖

不同培養(yǎng)方式下粗多糖含量及粗多糖得率比較見(jiàn)表5、表6。

表5 不同培養(yǎng)方式下粗多糖含量的不同

表6 不同培養(yǎng)方式下粗多糖得率的不同

2.2 討論

由表5 和表6 可得，固體培養(yǎng)2 號(hào)和3 號(hào)子實(shí)體粗多糖得率42.87、96.47 均高于液體發(fā)酵物的41.60、18.55。2 號(hào)和3 號(hào)固體培養(yǎng)基粗多糖得率468.70、286.30 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于液體培養(yǎng)基的粗多糖得率0.61、1.32。大米培養(yǎng)基的粗多糖得率之所以最高不僅是培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)給予菌絲充分繁殖時(shí)間，大米中的多糖成分也是導(dǎo)致得率高的原因。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用固體（大米）培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩種不同方式對(duì)蟲草進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)物及培養(yǎng)基進(jìn)行粗多糖提取。兩種培養(yǎng)方式相比較，操作簡(jiǎn)單易行，材料和所需溶液易得且對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染，固體培養(yǎng)相較于液體發(fā)酵來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)（本次實(shí)驗(yàn)固體培養(yǎng)耗時(shí)3 個(gè)月），蟲草生長(zhǎng)經(jīng)歷過(guò)程較多（菌絲長(zhǎng)滿、菌絲轉(zhuǎn)色、形成元基、出子實(shí)體），液體發(fā)酵耗時(shí)短（本次實(shí)驗(yàn)液體發(fā)酵一周）。待培養(yǎng)完成后對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行處理：固體培養(yǎng)對(duì)子實(shí)體及培養(yǎng)基進(jìn)行采收后打粉：液體發(fā)酵對(duì)菌絲球進(jìn)行過(guò)濾、烘干后打粉，打粉后由于量較少，液體發(fā)酵菌絲球每個(gè)種做2 組，每組稱取2 g。液體發(fā)酵液加入3 倍量的無(wú)水乙醇過(guò)夜沉淀得粗多糖。采用熱水浸提法提取子實(shí)體、固體培養(yǎng)基和菌絲球中的粗多糖，得到粗多糖含量后計(jì)算得率。

在提取條件（料液比1：80，溫度90℃，時(shí)間3 h，重復(fù)提取3 次）相同的情況下得到2 號(hào)和3 號(hào)（由于出現(xiàn)污染或其他原因?qū)е轮挥? 號(hào)和3 號(hào)獲得完整的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)）固體培養(yǎng)子實(shí)體中粗多糖得率（mg/g）分別為42.87、96.47；2 號(hào)和3 號(hào)固體培養(yǎng)基中粗多糖得率（mg/g）分別為468.70、286.30；液體發(fā)酵菌絲球粗多糖得率（mg/g）分別為41.60、18.55；液體發(fā)酵液粗多糖得率（mg/g）分別為0.61、1.32。通過(guò)比較得出不管是培養(yǎng)基中粗多糖還是培養(yǎng)物中粗多糖都是采用固體培養(yǎng)得率更高。所以為了獲得更多蟲草粗多糖，可優(yōu)先選用固體培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。