氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺對斑馬魚胚胎氧化應(yīng)激的影響

賀琳娟 張 琳 李亞夢 卯明彩 錢永忠 邱 靜

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081）

氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)F）又稱氟甲砜霉素，屬于第3代酰胺醇類抗生素，與氯霉素相比不再具有致再生障礙性貧血的毒副作用。氟苯尼考具有抗菌活性高、抗菌范圍廣、毒副作用小的優(yōu)點，被廣泛用于畜禽和水產(chǎn)動物養(yǎng)殖生產(chǎn)中，從而容易進入水體在食物鏈中富集[1]。BU等[2]的研究結(jié)果表明，氟苯尼考在地表水中的濃度范圍為14.8～46.6 ng/L。ZONG等[3]對我國大連的水產(chǎn)養(yǎng)殖場附近水樣進行調(diào)查，其中檢測到29.8～1.1×104μg/L的氟苯尼考，而在沉積物中并未檢測到。LU等[4]在我國膠州灣河口水中測得的氟苯尼考濃度范圍為4.95～64.80 ng/L，海灣水中為2.90～25.70 ng/L。在動物源性食品中，氟苯尼考的檢出率較高，禽蛋中氟苯尼考?xì)埩舫瑯?biāo)的情況時有發(fā)生[5]。長期食用氟苯尼考超標(biāo)的食品會對人體健康造成潛在威脅，因此有必要對其毒性作用展開深入研究。

氟苯尼考進入動物體內(nèi)會產(chǎn)生代謝物。在牛體內(nèi)氟苯尼考會產(chǎn)生氟苯尼考胺、單氟苯尼考、氟苯尼考草酸和氟苯尼考醇，其中氟苯尼考胺（Florfenicol amine，F(xiàn)FA）是主要的代謝物[6]。研究表明，一些化合物的母體和代謝物在毒性上存在著一定的差異，兩種化合物在結(jié)構(gòu)上雖具有相似性，但由于化學(xué)基團的改變，其理化性質(zhì)也會隨之發(fā)生變化[7～8]。YANG等[9]比較了FF和FFA在3種不同溫度下的藥代動力學(xué)過程，發(fā)現(xiàn)FF在25℃下被吸收和消除的速率更快，這說明FF和FFA的理化性質(zhì)不同。

近年來，由于水環(huán)境及食品基質(zhì)中氟苯尼考?xì)埩舻牟粩鄼z出，關(guān)于氟苯尼考的毒性研究也在顯著增加。急性毒性研究結(jié)果表明，氟苯尼考對微藻的96 h半數(shù)抑制濃度（IC50）為6.06 mg/L[10]，對羅非魚幼魚的96 h半數(shù)致死濃度 （LC50）為349.94 mg/L[11]。此外，氟苯尼考也會對小鼠的腸道黏膜屏障、免疫系統(tǒng)以及腸道微生物產(chǎn)生負(fù)面影響[12]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，氟苯尼考會影響非目標(biāo)生物的光合作用，抑制微藻生長[13～14]。在環(huán)境濃度下，氟苯尼考會引起羅非魚幼魚的微核及其他紅細(xì)胞核異常[15]，使斑馬魚體內(nèi)產(chǎn)生代謝紊亂[16]。在畜禽養(yǎng)殖中，氟苯尼考會抑制雞胚胎的發(fā)育，誘導(dǎo)早期胚胎死亡，具有一定的胚胎毒性[17]。同時，其暴露會引起肉雞脂質(zhì)過氧化和凋亡性肝損傷[18]。治療劑量下的氟苯尼考會引起造血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞濃度降低，影響造血和免疫功能，但隨著時間的推移，這種變化會得到緩解[19]。因此，研究氟苯尼考和氟苯尼考胺的毒性效應(yīng)差異，具有重要的現(xiàn)實意義。

斑馬魚作為世界上第3大模式生物，其胚胎透明易觀察、產(chǎn)卵量大、發(fā)育周期短，并且與人類基因具有87%的高度同源性，被廣泛用于毒理學(xué)領(lǐng)域的研究中[20～21]。LEE等[22]以斑馬魚為模式生物，研究了多種有機氯農(nóng)藥的線粒體毒性機制，對耗氧量、線粒體復(fù)合體活性、抗氧化反應(yīng)等指標(biāo)進行了全面的分析和評估。NI等[23]探究了馬杜霉素對斑馬魚產(chǎn)生的急性毒性、組織病理學(xué)損傷和氧化應(yīng)激損傷。通過獲取生物標(biāo)志物的含量信息，研究人員揭示了莫西菌素對斑馬魚早期生命階段的影響[24]。

目前的研究主要聚焦于氟苯尼考，而針對其代謝物的毒性研究報道仍較少。本文以斑馬魚為模式生物，從氧化應(yīng)激損傷入手，探索氟苯尼考及其主要代謝物氟苯尼考胺影響斑馬魚胚胎發(fā)育及氧化應(yīng)激的潛在機制，并分析兩種化合物的毒性效應(yīng)差異，為食品安全監(jiān)管和風(fēng)險評估提供理論參考依據(jù)。

一、材料與方法

（一）試劑與儀器氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：73231－34－2，純度>99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：76639－93－5，純度>99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；二甲基亞砜（DMSO，純度99.9%，北京百靈威科技有限公司）；Bradford蛋白濃度測定試劑盒、活性氧檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC－1）、生理鹽水（碧云天生物技術(shù)有限公司）；還原性谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測試盒（南京建成生物工程研究所）；吖啶橙（AO）染料、三卡因、甲基纖維素（北京索萊寶科技有限公司）。

斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（上海海圣生物實驗設(shè)備有限公司）；人工氣候箱（寧波江南儀器廠）；光學(xué)顯微鏡［SZX2－ILLT，奧林巴斯（中國）有限公司］；熒光顯微鏡［SZX7，奧林巴斯（中國）有限公司］；酶標(biāo)儀［Infinite 200 Pro，帝肯（上海）貿(mào)易有限公司］；超聲破碎儀（Q800R3，美國QSonica公司）。

（二）實驗動物成年斑馬魚（AB型）購自國家斑馬魚資源中心，養(yǎng)殖水溫控制在（28±2）℃，光周期14 h/10 h（光/暗），每天飼喂兩次飼料和豐年蝦。按照雌雄比為1∶1的比例分隔兩室置于產(chǎn)卵盒內(nèi)，第2天早上9∶00抽取隔板。在顯微鏡下挑選同一時期且發(fā)育正常的胚胎，用于后續(xù)的實驗操作。

（三）實驗方法

1.斑馬魚胚胎染毒。將受精后4 h（Hour post fertilization，hpf）的斑馬魚胚胎，隨機放入12孔板內(nèi)，每孔20顆。用胚胎培養(yǎng)水和二甲基亞砜（最終濃度0.1%）配制1 000 mg/L的母液，并逐級稀釋至實驗濃度。向12孔板內(nèi)分別加入2 mL濃度為0、0.01、0.1、1、10、100 mg/L的氟苯尼考和氟苯尼考胺暴露液，其中每個濃度設(shè)置3組平行。為確保暴露液濃度的穩(wěn)定性，每隔24 h更換1次暴露液。在人工氣候箱內(nèi)28.5℃連續(xù)培養(yǎng)120 h。

2.形態(tài)學(xué)觀察。在藥物暴露后24 h（Hour post exposure，hpe）記錄胚胎的死亡數(shù)，并統(tǒng)計48、72 hpe的孵化數(shù)以及72、96、120 hpe的心跳次數(shù)。在120 hpe用三卡因麻醉仔魚，甲基纖維素固定，對斑馬魚進行拍照觀察，并記錄相應(yīng)的畸形情況。

3.氧化應(yīng)激指標(biāo)測定。收集一定量的斑馬魚仔魚樣本，設(shè)置3個平行重復(fù)，放入凍存管內(nèi)，液氮速凍5 min，－80℃保存。樣本置于冰上化凍后，按照質(zhì)量（mg）：體積（μL）＝1∶9的比例，加入生理鹽水超聲破碎制成10%組織勻漿液。酶活性測定的具體操作步驟遵循試劑盒說明書，需首先檢測樣本組織中蛋白質(zhì)的含量，隨后開展過氧化氫酶（CAT）、還原型谷胱甘肽（GSH）活性的測定和丙二醛（MDA）含量的測定。

4.活性氧測定。在藥物暴露后120 h，利用熒光探針DCFH－DA法檢測斑馬魚活性氧（ROS）的含量變化，具體步驟參考試劑盒說明書及相關(guān)文獻[25～27]。本實驗采用濃度為40μmol/L的DCFHDA探針，在28.5℃避光下孵育斑馬魚仔魚30 min。然后用胚胎培養(yǎng)水清洗3次，用三卡因麻醉，甲基纖維素固定，在熒光顯微鏡下拍照記錄。

5.吖啶橙染色。參照試劑說明書，將吖啶橙（AO）染料配制為一定濃度的工作液。然后將120 hpe的斑馬魚仔魚置于28.5℃避光孵育30 min。之后用胚胎培養(yǎng)水清洗，搖床輕搖10 min，重復(fù)兩次。麻醉并固定好后，在熒光顯微鏡下觀察。

6.線粒體膜電位測定。為了進一步探究凋亡發(fā)生的時間，同時測定了線粒體膜電位 （JC－1）。JC－1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變，說明線粒體膜電位的破壞。將染料稀釋至合適的倍數(shù)，在28.5℃下避光孵育斑馬魚仔魚30 min。隨后用胚胎培養(yǎng)水清洗，搖床輕搖10 min，重復(fù)2～3次。在熒光顯微鏡下拍攝圖像并記錄。

（四）數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)繪圖用GraphPad Prism 8，組間顯著性差異用IBMSPSS Statistics 26進行單因素ANOVA分析，數(shù)據(jù)均以平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）形式表示。

二、結(jié)果與分析

（一）對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響與空白對照組相比，F(xiàn)F和FFA對斑馬魚胚胎的孵化產(chǎn)生了不同程度的影響（見圖1）。其中，藥物暴露48 h后，F(xiàn)F暴露組未出現(xiàn)顯著影響，F(xiàn)FA暴露組在100 mg/L劑量下對孵化率的影響顯著降低。72 h后，F(xiàn)F暴露組與對照組相比未出現(xiàn)顯著變化，而FFA暴露組在0.01 mg/L的濃度下明顯降低。結(jié)果表明，48 hpe斑馬魚胚胎對FF的敏感性更強，然而隨著時間的推移，藥物的影響逐漸減弱，因此推測48 h是這兩個藥物對斑馬魚胚胎孵化率產(chǎn)生影響的關(guān)鍵時間點。

圖1 氟苯尼考和氟苯尼考胺暴露后48 h和72 h斑馬魚胚胎的孵化率

分別在暴露后不同時間內(nèi)統(tǒng)計斑馬魚仔魚的心率變化，隨著暴露時間的延長，各濃度組仔魚的心率下降（見圖2）。與對照組相比，藥物暴露后72 h和96 h斑馬魚仔魚的心率明顯增加，說明影響更明顯；120 h心率略有下降，說明隨著時間的延長，F(xiàn)F和FFA對斑馬魚心臟發(fā)育的影響減弱。

圖2 氟苯尼考和氟苯尼考胺暴露后72 h、96 h和120 h斑馬魚仔魚的心率

為進一步探究藥物對斑馬魚發(fā)育的影響，對暴露后120 h斑馬魚仔魚的體長及發(fā)育畸形情況（主要為魚鰾缺失）進行統(tǒng)計分析（見圖3）。如圖3所示，兩種藥物的影響程度各有不同。FFA會減少魚鰾缺失發(fā)生的比例，且在0.1 mg/L的濃度下引起斑馬魚體長變短。而FF則會略微增加魚鰾缺失發(fā)生的比例，但無顯著性差異。

圖3 暴露后120 h氟苯尼考和氟苯尼考胺對斑馬魚魚鰾缺失相對發(fā)生率和相對體長的影響

（二）對氧化應(yīng)激的影響基于以上對斑馬魚胚胎發(fā)育的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，為探究兩種藥物影響斑馬魚胚胎發(fā)育的內(nèi)在機制，測定了氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)（見圖4）。如圖4所示，與對照組相比，經(jīng)過藥物暴露120 h后，處理組均會對斑馬魚胚胎的氧化應(yīng)激產(chǎn)生影響。CAT活性在100 mg/L FF處理下呈現(xiàn)顯著降低的趨勢，而FFA處理組則在1 mg/L的濃度下顯著增加。MDA含量在FF處理后顯著增加，而FFA處理后未出現(xiàn)顯著變化。GSH的活性均出現(xiàn)顯著增加，其中1 mg/L為顯著變化劑量點。根據(jù)實驗結(jié)果，選取0.1、100 mg/L為主要考察劑量，利用DCFH－DA熒光探針測定斑馬魚仔魚體內(nèi)的活性氧含量，結(jié)果見圖5。與對照組相比，藥物處理后斑馬魚體內(nèi)ROS含量增加，但兩種藥物對該指標(biāo)的影響差異較小。綜合以上結(jié)果，F(xiàn)F對斑馬魚體內(nèi)氧化應(yīng)激的影響大于FFA。

圖4 氟苯尼考和氟苯尼考胺對斑馬魚的CAT、MDA和GSH指標(biāo)的影響

圖5 氟苯尼考和氟苯尼考胺對斑馬魚體內(nèi)ROS含量的影響（圖像放大倍數(shù)為32倍）

（三）細(xì)胞凋亡為進一步研究氧化還原系統(tǒng)被破壞對斑馬魚胚胎細(xì)胞凋亡的影響，采用AO染色和JC－1染色開展凋亡染色成像實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FF和FFA均會誘導(dǎo)斑馬魚體內(nèi)產(chǎn)生不同程度的細(xì)胞凋亡。從線粒體膜電位的染色結(jié)果來看，暴露后96 h綠色熒光轉(zhuǎn)變增加，且FF處理下發(fā)生轉(zhuǎn)變的程度大于FFA處理。但在暴露后120 h，被染色的部位主要集中在腸道，這可能與受精后第5天斑馬魚進入開口期有關(guān)（見圖6）。AO染色結(jié)果與JC－1染色結(jié)果一致，其結(jié)果表明，藥物處理組會誘導(dǎo)斑馬魚體內(nèi)發(fā)生凋亡，且主要集中于心臟和腦部（見圖7）。綜上，F(xiàn)F及FFA均會誘導(dǎo)斑馬魚體內(nèi)發(fā)生不同程度的細(xì)胞凋亡。

圖6 氟苯尼考和氟苯尼考胺對斑馬魚線粒體膜電位的影響（圖像放大倍數(shù)為32倍）

圖7 不同暴露時間點的斑馬魚胚胎AO染色圖像（圖像放大倍數(shù)為50倍）

三、討論

氧化應(yīng)激是機體一旦接觸外源性化合物后，所引起的氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡現(xiàn)象。ROS含量的增加，會引起生物大分子損傷（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和脫氧核酸），甚至是更為嚴(yán)重的損害[28]。根據(jù)文獻報道，氟苯尼考增加了肉雞血清和肝臟組織中的MDA的含量，但降低了GSH、超氧化物歧化酶（SOD）和CAT的活性[29]。本文發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過氟苯尼考和氟苯尼考胺處理后，斑馬魚體內(nèi)出現(xiàn)了ROS含量的積累。

抗氧化酶，如GSH和CAT等，在保護機體免受ROS所引起的損害方面發(fā)揮著重要的作用[30]。本實驗中GSH的活性增加，CAT的活性呈現(xiàn)低劑量誘導(dǎo)而高劑量抑制的變化趨勢，說明斑馬魚體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)被充分調(diào)動，并且FFA所引起的抗氧化反應(yīng)水平高于FF。另外，F(xiàn)F會引起MDA含量的顯著增加，說明其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激引發(fā)了脂質(zhì)損傷，而代謝物FFA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷是可逆的。上述結(jié)果與現(xiàn)有的文獻一致，比如氟苯尼考會抑制三疣梭子蟹的解毒功能[31]，引起歐洲鱸魚體內(nèi)的SOD、CAT活性和MDA含量升高[32]。

斑馬魚體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激后，會誘發(fā)進一步的損害。這些損害反應(yīng)可以通過形態(tài)學(xué)觀察得到，如利用斑馬魚的死亡率、形態(tài)學(xué)異常和運動行為等指標(biāo)可以反映藥物暴露所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)[33]。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，F(xiàn)F和FFA對斑馬魚胚胎的孵化率和仔魚的心率產(chǎn)生了不同程度的影響。與FFA處理相比，F(xiàn)F處理暴露后48 h，斑馬魚胚胎的孵化率出現(xiàn)顯著降低的劑量點更低，暴露后72 h和96 h所引起的心率增加的幅度更大。對于畸形情況，F(xiàn)FA會引起斑馬魚體長變短，F(xiàn)F則對魚鰾缺失有影響。上述形態(tài)學(xué)變化可能是由氧化應(yīng)激引起的。有研究表明，氟苯尼考可通過抑制Nrf2－ARE途徑中相關(guān)因子的表達(dá)來促進雛雞的氧化應(yīng)激反應(yīng)[34]。Nrf2信號通路作為一種應(yīng)激補償機制被激活[35]，而該抗氧化通路Nrf2－Keap1的紊亂，會導(dǎo)致斑馬魚胚胎存活率下降[36]。

氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡之間存在著密不可分的聯(lián)系。機體內(nèi)活性氧的積累和對抗氧化劑的抑制，加劇了氧化應(yīng)激，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生[37]。AO染色結(jié)果表明，F(xiàn)F和FFA均會誘導(dǎo)凋亡的產(chǎn)生，主要集中于心臟和腦部。這兩個部位是斑馬魚體內(nèi)毒性發(fā)揮作用的重要場所。在調(diào)控細(xì)胞凋亡的過程中，線粒體發(fā)揮著重要的作用。線粒體為斑馬魚的胚胎發(fā)育提供能量，線粒體功能受損會造成能量代謝紊亂、細(xì)胞凋亡和氧化損傷[38～39]。本文JC－1染色的結(jié)果表明，兩種化合物均降低了斑馬魚的線粒體膜電位，引發(fā)了線粒體功能損傷。這與之前報道的氟苯尼考對細(xì)胞線粒體功能的影響結(jié)果一致[40]。

FF和FFA具有結(jié)構(gòu)相似性，含氟取代基的化合物更易在生物體內(nèi)積累，在較低劑量水平下呈現(xiàn)出較高的生物積累潛力[41]。但由于氨基基團的存在，F(xiàn)FA的性質(zhì)有所不同。根據(jù)文獻報道，氟苯尼考在鯽魚肝臟組織中的殘留時間長于氟苯尼考胺，該現(xiàn)象與化合物需要被吸收和分布到各個組織系統(tǒng)中才能生物轉(zhuǎn)化為代謝物有關(guān)[42]，這說明氟苯尼考胺更容易在生物體內(nèi)發(fā)生代謝和生物轉(zhuǎn)化?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上的區(qū)別是導(dǎo)致氟苯尼考及其主要代謝物氟苯尼考胺毒性差異的重要原因。

四、結(jié)論

本文從表型指標(biāo)和氧化應(yīng)激的角度，明確了氟苯尼考及其主要代謝物氟苯尼考胺對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響差異。發(fā)現(xiàn)前者主要影響胚胎魚鰾發(fā)育，后者則會導(dǎo)致體長變短，二者均會破壞胚胎體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，并誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞凋亡，且主要集中于心臟和腦部，總體上母體毒性大于代謝物。相關(guān)結(jié)果為深入評估氟苯尼考及其代謝物的毒性風(fēng)險、解析毒性作用機理機制奠定了重要基礎(chǔ)。