食品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株的管理和質(zhì)量控制

詹清 鄭孝賢 王海龍 林夢丹 方東升

摘 要：標(biāo)準(zhǔn)菌株是微生物檢測實(shí)驗(yàn)室不可或缺的物質(zhì)之一，穩(wěn)定和有效的標(biāo)準(zhǔn)菌株對微生物檢測質(zhì)量的有效性起到了至關(guān)重要的作用。本文從標(biāo)準(zhǔn)菌株的選擇、驗(yàn)收、傳代及確認(rèn)、保藏、期間核查、領(lǐng)用以及銷毀等方面，分析了食品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株的規(guī)范化管理程序和質(zhì)量控制要素，為食品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株的管理提供參考和借鑒。

關(guān)鍵詞：食品微生物檢測;標(biāo)準(zhǔn)菌株;管理;質(zhì)量控制

Management and Quality Control of Standard Strains in Food Microbiology Testing Laboratory

ZHAN Qing， ZHENG Xiaoxian， WANG Hailong， LIN Mengdan， FANG Dongsheng*

（Fujian Institute of Microbiology， Fuzhou 350000， China）

Abstract： Standard strains are one of the indispensable elements of a microbiological testing laboratory. Stable and effective standard strains play a crucial role in the effectiveness of microbiological testing quality. In this paper， the standardized management procedures and quality control elements of standard strains in food microbiology testing laboratory are discussed from the aspects of selection， acceptance， passage and confirmation， preservation， period verification， acquisition and destruction of standard strains. The works provide reference for the management of standard strains in food microbiological testing laboratory.

Keywords： food microbiological testing; standard strains; management; quality control

隨著人們對食品安全問題的日漸關(guān)注，食品微生物檢驗(yàn)的市場需求擴(kuò)大，同時(shí)也對檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的人員和專業(yè)技術(shù)手段提出了更嚴(yán)格的要求。標(biāo)準(zhǔn)菌株作為微生物檢測工作的關(guān)鍵因素，是檢測質(zhì)量內(nèi)部控制的一部分[1]。標(biāo)準(zhǔn)菌株是一類遺傳學(xué)特性已得到確認(rèn)和保證，并且可溯源的模式菌株，其在培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量驗(yàn)收、檢測方法的確認(rèn)和證實(shí)以及確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性等各方面都具有不可替代的重要作用[2]。本文結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的檢測工作實(shí)際，對食品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株的日常規(guī)范化管理以及質(zhì)量控制進(jìn)行探討。

1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的來源

依據(jù)《檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》（CNAS—CL01-A001：2018）的規(guī)定，實(shí)驗(yàn)室必須有保藏滿足實(shí)驗(yàn)需要的標(biāo)準(zhǔn)菌株，除特殊檢測方法（如抗菌實(shí)驗(yàn)或藥敏實(shí)驗(yàn)）用到的菌株外，還需具備用于培養(yǎng)基（試劑）驗(yàn)收/質(zhì)量控制、方法確認(rèn)/證實(shí)、陽、陰性對照、人員培訓(xùn)考核和結(jié)果質(zhì)量的保證等需要的菌株，且標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)該從國際或國家認(rèn)可的菌種保藏機(jī)構(gòu)購買[3]。目前，我國的微生物檢測實(shí)驗(yàn)室所用的標(biāo)準(zhǔn)菌株主要來自以下機(jī)構(gòu)，美國典型菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）、中國普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）、中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）、中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）和廣東省微生物菌種保藏中心（Guangdong Microbial Culture Collection Center，GDMCC）[4]。

2 標(biāo)準(zhǔn)菌株的選擇

由于標(biāo)準(zhǔn)菌株種類繁多，同種或同一亞種的不同菌株的某些生物學(xué)特性可能會存在一些差別。因此，在選擇菌株的時(shí)候不僅要注意菌株的名稱，還要注意菌株的編號。如銅綠假單胞菌ATCC27853和銅綠假單胞菌ATCC15442二者產(chǎn)生綠膿菌素的能力差異較大。食品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)所開展的檢測項(xiàng)目，參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789系列，選擇標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的菌株作為檢測實(shí)驗(yàn)的陰、陽性對照[5]。另外，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2013）規(guī)定了不同種類培養(yǎng)基的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，并指定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控菌株[6]。

3 標(biāo)準(zhǔn)菌株的驗(yàn)收

實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)準(zhǔn)菌株時(shí)，首先應(yīng)核對菌株的數(shù)量和名稱，同時(shí)檢查菌株附有的相關(guān)資料以及每一支菌株包裝的完整性，并在菌株接收記錄上登記相關(guān)信息，如菌株名稱、數(shù)量、菌號、來源途徑和接收日期等。同時(shí)給每支菌株粘貼標(biāo)簽，標(biāo)簽內(nèi)容包括菌種名稱、菌號、代次、接收日期、接收人、貯存條件及有效期至，新購入的原始菌株依照隨產(chǎn)品附有的菌株儲存方法進(jìn)行儲存。

4 標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)活、傳代及確認(rèn)

4.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)活

得到標(biāo)準(zhǔn)菌株后，應(yīng)盡早進(jìn)行復(fù)活和保藏。在進(jìn)行復(fù)活前，要根據(jù)菌株的特性，確定培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件。通常從菌種保藏機(jī)構(gòu)購買的標(biāo)準(zhǔn)菌株會附帶操作說明，可直接按照說明書進(jìn)行復(fù)活。若沒有附帶說明書，可通過查閱文獻(xiàn)等方式確認(rèn)菌株?duì)I養(yǎng)需求和生長條件。在復(fù)活標(biāo)準(zhǔn)菌株時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照《人間傳染的病原微生物名錄》《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》《動物病原微生物分類名錄》及《實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求》（GB 19489—2008）的規(guī)定，在相應(yīng)的生物安全水平下操作。從菌種保藏機(jī)構(gòu)購買的標(biāo)準(zhǔn)菌株通常是凍干粉狀態(tài)，可選擇加入少量生理鹽水或復(fù)蘇液（購買菌株包裝中提供），將凍干菌種制成懸浮液，然后用無菌滴管或移液器吸取適量移至固體培養(yǎng)基平板（或液體培養(yǎng)基）中進(jìn)行培養(yǎng)。

4.2 菌株的性能確認(rèn)

為了保證標(biāo)準(zhǔn)菌株的質(zhì)量，菌株經(jīng)過復(fù)活，并在適宜的培養(yǎng)基中生長后，需進(jìn)行純度和性能的確認(rèn)，同時(shí)做好確認(rèn)記錄。純度檢查通常采用平板劃線法，用無菌接種環(huán)將復(fù)活后的菌株劃線于相應(yīng)的鑒別平板或非選擇平板上，分離出單菌落，觀察單菌落形態(tài)是否與菌株特征相符。然后取平板上的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，染色結(jié)果應(yīng)符合要求。最后利用生理生化試驗(yàn)鑒定菌株的性能。常見的生化鑒定產(chǎn)品有API生化鑒定試劑盒和標(biāo)準(zhǔn)菌株生化鑒定試劑盒，也可借助全自動細(xì)菌生化鑒定儀等儀器進(jìn)行鑒定。

4.3 菌株的傳代

從菌種保藏機(jī)構(gòu)購買回來的標(biāo)準(zhǔn)菌種通常為0代，將0代標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)接一代后得到的一套完全相同的獨(dú)立菌株，即標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株。將標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株再轉(zhuǎn)接一代即可獲得工作菌株，理論上工作菌株傳代不超過5代[7]。每次傳代需填寫傳代確認(rèn)記錄表，記錄表內(nèi)容應(yīng)包括菌株名稱、編號、代數(shù)、制成代編號、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度及時(shí)間、純度檢查過程、鏡檢、生化鑒定結(jié)果和操作者等信息，以保證傳代后菌株質(zhì)量的可控性。制備的菌株應(yīng)由管理員統(tǒng)一進(jìn)行標(biāo)簽標(biāo)識，標(biāo)簽內(nèi)容包括菌株名稱、內(nèi)部編號、傳代日期及有效期等信息。內(nèi)部編號規(guī)則通常采用字母加數(shù)字表示，即菌株拉丁文縮寫字母+代次+傳代日期+順序號。

5 標(biāo)準(zhǔn)菌株的保藏

菌株保藏的主要目的是為了保持原菌株的活力和特性，降低菌株的變異和污染[8]。一種良好有效的保藏方法要能保持原菌株的優(yōu)良特性長期穩(wěn)定，同時(shí)操作上還須具備簡便性和經(jīng)濟(jì)性等特點(diǎn)。食品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室常用的菌株保藏方法有以下幾種。

5.1 斜面低溫保藏法

將菌株接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌株生長完全后，轉(zhuǎn)至2～8 ℃的冰箱保藏（需常溫保存的菌株除外，如銅綠假單胞菌和霍亂弧菌等）。此法常用于工作菌株的保藏，一般可保存3個(gè)月左右（不同種類菌株保存周期略有不同）。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、易推廣、存活率高。缺點(diǎn)是保藏周期短、菌株隨著傳代次數(shù)的增加容易發(fā)生變異或引入污染。

5.2 液體石蠟保藏法

在斜面保藏法的基礎(chǔ)上，加入滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟，垂直放置使石蠟高出斜面頂端

l cm，將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以此達(dá)到保藏效果。此方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，保存時(shí)間長，一般可保存1～2年。缺點(diǎn)是不適用于能分解烴類的菌株保存，且斜面占用空間大。

5.3 甘油懸液保藏法

用滅過菌的甘油（濃度為15%～20%），將新鮮的純培養(yǎng)物洗脫下來，混合均勻，再分裝至菌種保藏管中，置于-20 ℃低溫保存，一般可保存1年以上。本方法操作簡單，不需特殊設(shè)備，不需反復(fù)傳代，使用方便。

5.4 冷凍真空干燥保藏法

冷凍真空干燥保藏法簡稱凍干法，它是將需保藏菌株的細(xì)胞懸液或孢子懸液與保護(hù)劑混合，然后置于安瓿管中，在低溫條件下快速凍結(jié)，并減壓抽真空，使水分升華將樣品脫水干燥，制成完全干燥的固體菌塊。在真空條件下將安瓿管立即熔封，最后置于低溫冰箱保存。此方法的優(yōu)點(diǎn)是保存周期長，一般可達(dá)5年以上，菌株存活率高、變異率低。缺點(diǎn)是該方法操作煩瑣，且需要凍干機(jī)等專用設(shè)備。

6 標(biāo)準(zhǔn)菌株的領(lǐng)用及銷毀

食品檢測實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)由專人保管，領(lǐng)用標(biāo)準(zhǔn)菌株、標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株和工作菌株時(shí)要做好交接工作，并填寫領(lǐng)用記錄表，記錄表內(nèi)容應(yīng)包括菌株名稱、編號、使用日期、用途、使用人和管理人簽字確認(rèn)等?！秾?shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求》（GB 19489—2008）規(guī)定了生物安全實(shí)驗(yàn)室處置廢棄物的要求，標(biāo)準(zhǔn)菌株使用完畢后相關(guān)污染物品應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的消毒滅菌處理，并記錄。

7 標(biāo)準(zhǔn)菌株的期間核查

標(biāo)準(zhǔn)菌株是一類易發(fā)生死亡、衰退和被污染的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[9]。為確保標(biāo)準(zhǔn)菌株相關(guān)生物學(xué)性能的穩(wěn)定，微生物檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定詳細(xì)的標(biāo)準(zhǔn)菌株期間核查計(jì)劃，對菌株核查的方法、頻次、文件記錄、結(jié)果判定等方面內(nèi)容進(jìn)行合理規(guī)定。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)工作實(shí)際情況對保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行核查，主要包括文件的核查和標(biāo)準(zhǔn)菌株純度、活性、穩(wěn)定性和生化特性等指標(biāo)的核查[10]。文件核查的主要工作是查閱菌株檔案以及相關(guān)記錄的完整性，包括菌株溯源證明、標(biāo)準(zhǔn)菌株臺賬、傳代及確認(rèn)記錄和領(lǐng)用及銷毀記錄等。標(biāo)準(zhǔn)菌株純度、活性、穩(wěn)定性和生化特性的核查可參考菌株的性能確認(rèn)方法，一般情況下，菌株性能的期間核查與常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)菌株的確認(rèn)方法和依據(jù)基本一致，但期間核查可從多方面使用不同的方法進(jìn)行，并不局限于單一的方法。

8 結(jié)語

標(biāo)準(zhǔn)菌株作為重要且特殊的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，貫穿于整個(gè)微生物檢測過程，并起到內(nèi)外部質(zhì)量控制的作用。微生物檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立一套完善的標(biāo)準(zhǔn)菌株管理和質(zhì)量控制程序，確保標(biāo)準(zhǔn)菌株的溯源性和穩(wěn)定性，從源頭上保證檢測結(jié)果的有效性和真實(shí)性。

參考文獻(xiàn)

[1]羅麗珠，陳婉佳.標(biāo)準(zhǔn)菌株在微生物檢測中的作用[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2021，12（8）：3281-3286.

[2]楊文君.食品微生物實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株的瓷珠保藏方法[J].現(xiàn)代食品，2020（12）：47-48.

[3]中國合格評定國家認(rèn)可委員會.檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明：CNAS—CL01-A001：2018[EB/OL].（2018-03-01）[2022-02-11].https：//www.cnas.org.cn/rkgf/sysrk/rkyyzz/2018/03/889076.shtml.

[4]蘇嘉妮，周露.食品微生物實(shí)驗(yàn)室菌種的管理[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2019，29（2）：86-88.

[5]陳茵茵，李娟.質(zhì)控品在食品微生物檢測中的應(yīng)用[J].食品與發(fā)酵科技，2019，55（6）：130-135.

[6]國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會.食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求：GB 4789.28—2013[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

[7]鄭菲.標(biāo)準(zhǔn)菌株在食品微生物檢測中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代食品，2020（7）：44-45.

[8]韓映晨，崔鉉，安賢蘭，等.淺談藥品微生物檢驗(yàn)用菌種保藏方法[J].中國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理，2017，8（20）：104-106.

[9]林嘉欣，安東，劉瑩，等.微生物標(biāo)準(zhǔn)菌株不同保藏方法的比較[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2019（9）：34-35.

[10]許金榜.食品微生物實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株期間核查[J].現(xiàn)代食品，2019（24）：48-50.