慢性腦缺血及急性缺血性腦卒中患者循環(huán)內(nèi)皮祖細胞及其誘導因子的表達變化

李盈潔，王 盧，楊 旭，楊 波，章 鑫，張 靜，張 琦，成旭東，余能偉，

(1.西南醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，四川 瀘州 646000；2.電子科技大學醫(yī)學院，四川 成都610054；3. 四川省樂山市中醫(yī)院，四川 樂山 614099；4.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 成都 610072)

慢性腦缺血(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)是腦整體水平血液供應減少狀態(tài)，但無局灶性神經(jīng)功能缺損[1]。根據(jù)CCH按缺血程度分型[2]可知，隨缺血程度分級的升高，發(fā)生急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)風險越大，由此可見CCH是卒中前狀態(tài)，若為腦血管狹窄所致的CCH可導致卒中發(fā)生。CCH發(fā)生后，缺血腦組織會有代償毛細血管新生[3]，此機制尚不明確。目前認為內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在缺血性腦血管病組織修復和再生中起關鍵作用[4]。EPCs的表達與其誘導因子：血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[5]、低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)[6]、基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)[7]的表達具有密切關系。本研究探討CCH及AIS患者EPCs及其誘導因子的表達情況，探索EPCs及其誘導因子在CCH中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料2021年2月至2021年7月四川省人民醫(yī)院門診就診的CCH患者34例(CCH組)，納入標準：年齡45～80歲[2，8]；符合《慢性腦缺血中西醫(yī)結合診療專家共識》中提出的診斷標準[2]。排除標準：近期大面積腦梗(超過大腦中動脈供應區(qū) 1/3)；結締組織病、血管炎；急性心肌梗死；近期房顫或心瓣膜疾??；嚴重肝腎功損傷；嚴重感染；女性患者懷孕或備孕；幽閉恐懼癥；近三月內(nèi)有服用他汀、阿司匹林、泰嘉藥物史；其他嚴重合并癥；不愿意入組者。同期于四川省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科綠色通道收治、影像學提示為急性腦梗死、發(fā)病在24小時內(nèi)的住院AIS患者31例(AIS組)，納入標準：符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》提出的AIS診斷標準；發(fā)病24小時內(nèi)。排除標準：結締組織病、血管炎；急性心肌梗死；近期房顫或心瓣膜疾病；嚴重肝腎功損傷；嚴重感染；女性患者懷孕或備孕；幽閉恐懼癥；近三月內(nèi)有服用他汀、阿司匹林、泰嘉藥物史；其他嚴重合并癥；不愿意入組者。對照組為同期四川省人民醫(yī)院健康體檢人群25例。本研究經(jīng)四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院倫理委員會審核通過，所有患者或家屬簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1臨床資料收集 收集所有研究對象的年齡、性別、吸煙、飲酒、既往史(高血壓、糖尿病、高血脂)等臨床資料。

1.2.2采用動脈自旋標記(ASL)檢查證實CCH患者具有腦血流低灌注區(qū) 使用美國3.0T GE Discovery MR750W磁共振掃描儀對CCH患者進行核磁共振成像檢查。掃描時取仰臥位，囑患者盡可能減少頭部運動。常規(guī)行顱腦磁共振掃描：T1W圖像的采集參數(shù)為：TR 250.00 ms，TE 2.50 ms；T2W圖像的采集參數(shù)為：TR 5744.40 ms，TE 95.00 ms；T2W FLAIR圖像的采集參數(shù)：TR 10500.00 ms，TE 94.00 ms；3D-ASL的采集參數(shù)：TR 2824.5 ms，TE 11 ms，F(xiàn)OV 192mm×192 mm，矩陣64×64，層厚5.0 mm，激勵次數(shù)1次，掃描層數(shù)25層，標記時間為 700 ms、1600 ms、1800 ms，掃描時間4 min 29 s 。ASL圖像分析：采用ASL專用的分析軟件產(chǎn)生灌注彩圖，灌注彩圖中紅色代表高灌注，藍色代表低灌注。2名影像科副主任醫(yī)師及1名神經(jīng)內(nèi)科副主任醫(yī)師采用盲法觀察ASL圖像，確定有無腦血流低灌注區(qū)。

1.2.3流式細胞儀技術檢測EPCs的表達量 采用EDTA管抽取納入患者外周血1 ml。CCH組及對照組采血時間為早上6～8時，抽取空腹血；AIS患者采血時間為入院后半小時內(nèi)。取外周血50 μl，加入PE標記的CD309單克隆抗體20 μl、APC標記的CD133單克隆抗體5 μl和BV421標記的CD34單克隆抗體5 μl，20 ℃避光孵育15 min；加入紅細胞裂解液900 μl，避光孵育10 min；加入磷酸鹽緩沖液 3000 μl混勻，2469rpm離心5 min，去上清；加入 400 μl PBS 緩沖液重新懸??；采用流式細胞儀，收集細胞進行分析。以CD34+細胞表示為干細胞，以CD34+/CD309+/CD133+三陽性細胞表示EPCs，統(tǒng)計CD34+/CD309+/CD133+三陽性細胞占CD34+細胞的百分比，即為 EPCs水平。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附法檢測VEGF、HIF-1、SDF-1表達情況 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測外周血VEGF、HIF-1、SDF-1含量。采用美谷分子儀器有限公司生產(chǎn)的酶標儀(型號SpectraMAX Plus384)在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度。實驗過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD法。非正態(tài)分布或方差不齊的計量資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗法。計數(shù)資料以n(%)表示，組間比較采用卡方檢驗。采用Spearman相關性分析比較變量之間的相關性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組臨床資料比較對照組、CCH組、AIS組年齡、性別、飲酒率、糖尿病患病率、高血脂患病率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。AIS組吸煙率高于CCH組(P<0.05)；CCH組、AIS組高血壓患病率高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 三組臨床資料比較

2.2 CCH組及AIS組主要臨床表現(xiàn)CCH組21例(61.76%)主要臨床表現(xiàn)為頭暈，8例(23.53%)存在頭暈、頭痛、耳鳴、睡眠障礙中的2種或2種以上癥狀， 2例(5.88%)表現(xiàn)為頭痛，1例(2.94%)表現(xiàn)為耳鳴，1例(2.94%)表現(xiàn)為顱鳴，1例(2.94%)表現(xiàn)為記憶力下降。AIS組14例(45.16%)存在肢體麻木、肢體無力、言語不清、頭暈、口角歪斜中的2種及以上癥狀，12例(38.71%)表現(xiàn)為肢體無力，3例(9.68%)表現(xiàn)為言語不清，1例(3.23%)表現(xiàn)為意識障礙，1例(3.23%)表現(xiàn)為視物模糊。AIS組美國國立衛(wèi)生院卒中量表(NIHSS)評分為3(2，6)分。

2.3 CCH組與AIS組影像學表現(xiàn)

2.3.1CCH組影像學表現(xiàn) CCH患者頭顱核磁未見明顯梗塞灶、顱內(nèi)占位性病變、腦出血及顱內(nèi)血管狹窄改變。CCH患者中，多發(fā)腦血流低灌注病灶27例(79.41%)，顱內(nèi)單發(fā)腦血流低灌注7例(20.59%)。腦血流低灌注部位有額葉者21例(61.76%)，有半卵圓中心者13例(38.24%)，有頂葉者8例(23.53%)，有基底節(jié)區(qū)者6例(17.65%)，有側腦室旁者5例(14.71%)，有顳葉者2例(5.88%)，有枕葉者1例(2.94%)，其中腦血流低灌注部位多見于額葉及半卵圓中心。見圖1。

圖1 CCH患者影像學圖像 a：T1W；b：T2W；c：Flair；d：頭顱MRA未見血管狹窄；e：ASL未見腦組織低灌注區(qū)；f、g：ASL可見腦組織低灌注區(qū)(紅色箭頭處，藍色)

2.3.2AIS組影像學表現(xiàn) 患者頭顱CT可見低密度影；頭顱核磁可見長T1及長T2信號，F(xiàn)LAIR像可見高信號影，DWI像可見病變部位彌散受限，行頭頸MRA/CTA/DSA 可見動脈狹窄或閉塞改變?；颊呔蓄^頸動脈血管檢查，其中26例(83.87%)患者頭頸部動脈存在不同程度狹窄和(或)閉塞改變。見圖2。

圖2 AIS組影像學圖像 a：CT ；b：T2W；c：Flair；d：DWI；a～d：右側枕葉、海馬區(qū)急性腦梗死病灶；e：CTA示右側大腦中動脈M1中遠份顯示欠佳，遠段分支稀疏、變少(白色箭頭處)；f：CTA示右側大腦后動脈遠段分支較左側纖細、變少，為此次AIS發(fā)生的責任血管(紅色箭頭處)

2.4 三組EPCs水平、VEGF、HIF-1、SDF-1表達量比較三組EPCs、VEGF、HIF-1、SDF-1表達水平組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CCH組EPCs、VEGF、HIF-1表達均高于對照組(P<0.05)，SDF-1表達量較對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。AIS組EPCs、VEGF、HIF-1表達均高于對照組，SDF-1表達低于對照組(P<0.05)。AIS組與CCH組比較，VEGF表達升高(P<0.05)，EPCs、HIF-1、SDF-1差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、圖3。

表2 三組EPCs水平、VEGF、HIF-1、SDF-1表達量比較

圖3 三組EPCs流式細胞檢測圖 a：對照組；b：CCH組；c：AIS組

2.5 AIS組VEGF與HIF-1的相關性分析AIS組VEGF的變化與HIF-1的變化呈正相關(r=0.513，P=0.004)。

3 討論

缺血性腦血管病按照起病形式主要分為急性起病和慢性起病，急性起病主要包括AIS和短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attack，TIA)，慢性起病主要為CCH，由于AIS和TIA可導致嚴重后果，故目前的研究熱點主要集中于急性缺血性腦血管病，但是二者之間是可以相互轉化的。本研究發(fā)現(xiàn)，CCH患者腦缺血部位多為額葉及半卵圓中心，且多為顱內(nèi)多發(fā)腦組織缺血。楊旭等[9]也發(fā)現(xiàn)CCH患者行影像學檢查可查出多部位缺血灶，多位于半卵圓中心、基底節(jié)區(qū)、額葉等部位，本研究結果與其基本一致。CCH可出現(xiàn)頭暈、頭痛、記憶力下降、認知功能障礙等表現(xiàn)[2，8]，作為一種可逆性疾病，其可干預的時間窗較長。調(diào)查顯示，65歲以上人群中66.7%存在CCH[2，8]，在這種高發(fā)病率的背景下，研究CCH的發(fā)病機制對減輕我國腦血管疾病負擔非常重要。

CCH發(fā)病機制復雜[2,8]，目前認為的機制主要包括膠質細胞增殖活化、氧化應激反應、細胞凋亡、神經(jīng)遞質紊亂等[8，17]。慢性腦缺血發(fā)生后，腦血流灌注降低，缺血腦組織會有代償毛細血管新生[3]，但這樣的新生血管僅能部分代償血流灌注，如果能促進這種代償機制，則可促進慢性腦缺血的防治。本研究提示CCH發(fā)生后EPCs的表達水平升高，提示EPCs可能參與CCH后腦組織血管的新生，改善腦血流；且我們發(fā)現(xiàn)CCH組VEGF、HIF-1的表達量升高，提示CCH發(fā)生后EPCs表達變化的升高可能與VEGF、HIF-1有關。研究顯示慢性腦灌注不足可誘導大鼠腦中VEGF表達的持續(xù)上調(diào)[18]，通過刺激HIF-1α / VEGF信號通路，可促進血管生成，改善慢性腦缺血患者的認知功能障礙[19]。

CCH按缺血程度主要分為3型[2]，其中Ⅰ型主要是臨床癥狀+腦血管病危險因素，Ⅱ型在I型的基礎上合并脫髓鞘病變等影像學改變，Ⅲ型在Ⅱ型基礎上合并血管結構性改變(如血管狹窄或閉塞)，隨分級程度升高，發(fā)生腦卒中的危險性越大。我們發(fā)現(xiàn)，AIS組患者頭頸部動脈存在不同程度狹窄和(或)閉塞改變，認為AIS患者卒中發(fā)生的主要原因為在CCH血管病變的基礎上，突發(fā)血管狹窄和(或)閉塞加重，進而從CCH轉化為AIS。與CCH組比較，EPCs的表達無明顯差異，VEGF的表達升高，提示CCH向AIS早期轉化過程中，雖然EPCs的表達變化不明顯，但其誘導因子VEGF已經(jīng)在發(fā)生變化。但CCH向AIS轉化后，中晚期EPCs及誘導因子如何變化，還需進一步探索。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CCH患者腦缺血部位多見于額葉及半卵圓中心，多為顱內(nèi)多發(fā)腦組織缺血；CCH患者與早期AIS患者EPCs升高，可能與VEGF及HIF-1升高有關，且CCH向AIS早期轉化過程中，雖然EPCs的表達變化不明顯，但其誘導因子VEGF已經(jīng)在發(fā)生變化，提示EPCs及其誘導因子可能在CCH的病理生理學過程中發(fā)揮重要作用，本研究為今后EPCs在CCH中的研究奠定基礎。