RBBP9在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

魏麗萍，岳思琦，何成彥

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長春130033)

結(jié)直腸癌的發(fā)病率在發(fā)達(dá)國家位列第三，死亡人數(shù)在男性排行中最多的是肺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌，女性為肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌[1]。生活方式導(dǎo)致年輕化趨勢且患病率不斷增加[2]，超過90%的胃腸道癌癥是由飲食習(xí)慣引起的。我們實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),通過對10名結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織與癌旁正常組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，隨后對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了差異分析，發(fā)現(xiàn)RBBP9在結(jié)直腸腫瘤中高表達(dá)，是潛在的結(jié)直腸癌標(biāo)記物。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源

我們在此次實(shí)驗(yàn)中所用的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本，是經(jīng)過病理學(xué)檢查證實(shí)的結(jié)直腸癌腺癌組織，在癌組織10 cm外減取癌旁組織。篩選出的患者要求在手術(shù)前未接受任何方式的治療。據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，我們從吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院組織標(biāo)本庫，申請到符合標(biāo)本的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本10例。

1.2 方法

1.2.1蛋白提取及濃度測定 取吉林大學(xué)組織標(biāo)本庫結(jié)直腸癌及正常組織，研磨機(jī)研磨后，加入預(yù)冷的蛋白提取試劑200 μl，在碎冰中裂解30 min，將離心管轉(zhuǎn)移到高速離心機(jī)中，低溫高速離心，留上清用考馬斯亮藍(lán)法測定液體蛋白濃度，其余蛋白提取樣品存于-80℃。

1.2.2二維質(zhì)譜-色譜聯(lián)用技術(shù)鑒定蛋白多肽 多肽溶解于0.1%FA，分離條件：流速2 μl/min洗脫3 h。全掃描，10次二級掃描，碰撞能量35%，進(jìn)行質(zhì)譜儀檢測。

1.2.3免疫印跡實(shí)驗(yàn)鑒定蛋白的表達(dá)水平 SDS-PAGE電泳，配置5%濃縮膠70v電壓30 min，10%分離膠110v電壓將目的蛋白條帶跑至分離膠中下位置按照分子量的不同進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)膜后對其進(jìn)行快速封閉，RBBP9一抗在低溫條件下過夜孵育，洗膜，室溫條件下孵育二抗，再洗膜5次?；瘜W(xué)法(ECI法)發(fā)光顯色，壓片20秒，顯影劑5分鐘，定影劑5分鐘。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織的差異蛋白質(zhì)

結(jié)果要求差異蛋白要求滿足蛋白質(zhì)譜數(shù)比值≥1且蛋白圖譜數(shù)差≥72。我們得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白34個，ATB5B，COL6A3，KRT18，RBBP，CA199，CA153等上調(diào)蛋白18個，CNN1，F(xiàn)LNA，MYL9，MYL6，TUBB2A等下調(diào)蛋白16個。其中RBBP9蛋白質(zhì)譜結(jié)果見圖1。

圖1 RBBP9蛋白質(zhì)譜

2.2 免疫印跡驗(yàn)證蛋白RBBP9表達(dá)

癌組織與癌旁組織的Western blotting檢測結(jié)果如圖2。

圖2 RBBP9在結(jié)直腸腫瘤組織中的表達(dá)量高于癌旁正常組織

3 討論

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白是研究最廣泛的腫瘤抑制基因之一[3]。既往研究的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白中，RBBP4,RBBP6等的研究較多，其中RBBP6的研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期中均發(fā)揮重要調(diào)控作用,乳腺癌[4]，食管癌[5]，宮頸癌[6]等腫瘤中RBBP6高表達(dá)。RBBP4在肝癌患者中高表達(dá)者預(yù)后水平較差，可作為原發(fā)性肝癌的潛在靶點(diǎn)[7],RBBP4 在胃癌中也促進(jìn)癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致患者預(yù)后不良[8]。但是對于RBBP9的相關(guān)研究較少。

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白9，RBBP9——以前稱為 Bog[9]和 RBBP10[10]。

在結(jié)構(gòu)上研究發(fā)現(xiàn)RBBP9含有Rb結(jié)合基序LxCxE，經(jīng)酵母雙雜交和共免疫沉淀研究鑒定可與Rb蛋白結(jié)合[9]。除了結(jié)合 Rb 外，還發(fā)現(xiàn) RBBP9 與 p107(RBL1) 和 p130(RBL2) 形成復(fù)合物，RBBP9 可以與 E2F1-Rb 復(fù)合物競爭并取代E2F1。RBBP9 可能通過與 p107 相互作用來調(diào)節(jié) p107-E2F4/5-DP1-Smad3 復(fù)合物的形成。NESG確定了人類RBBP9的高分辨率 1.72 ?晶體結(jié)構(gòu)，分子量約為 21 kDa[11]，主要位于核外區(qū)。在歸類上，RBBP9是α/β水解酶家族-Pfam家族DUF1234(PF06821)的成員[12]，RBBP9作為伐昔洛韋酶得到化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定[13]。

在功能上，少量研究表明 RBBP9 具有兩種不同的活性：(1)結(jié)合 RB 蛋白并調(diào)節(jié) RB/E2F 細(xì)胞周期通路活性的能力,以及(2)作為絲氨酸水解酶[14]。非癌癥性疾病研究表明RBBP9可能在細(xì)胞對慢性低劑量輻射的反應(yīng)中發(fā)揮作用[15]，并且是造血干細(xì)胞衰老的候選調(diào)節(jié)劑[16]。RBBP9在ALS(肌萎縮側(cè)索硬化)型的人類間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)比非ALS型人類間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)水平比較明顯偏低[17]。Takumi Adachi等推測肺源性損傷相關(guān)分子模式(DAMP) 能誘導(dǎo)活性的IL-33(IL33ia)。蛋白質(zhì)組學(xué)分析將RBBP9鑒定為誘導(dǎo)IL33ia的主要DAMP，并通過實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，RBBP9 刺激通過激活PGE2-EP2/EP4途徑誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞產(chǎn)生 IL-33[18]。癌癥性疾病少數(shù)研究顯示，RBBP9在胰腺癌中顯示出較高的活性，在40%的胰腺腫瘤活檢，絲氨酸水解酶活性升高，RBBP9在胰腺腫瘤增生過程中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[19]。RBBP9在骨肉瘤中過表達(dá)，與朊病毒蛋白(PRNP 和 PRND)在腫瘤發(fā)生和細(xì)胞凋亡相關(guān)[20]。結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[21]，利用生物信息分析方法篩選出RBBP9與CRC肝轉(zhuǎn)移有關(guān)[22]。RBBP9活性在肺癌、乳腺癌和卵巢癌中也可檢測到，這表明這種酶可能影響廣泛的癌癥[19]。然而，人們對RBBP9在癌癥進(jìn)展所起的作用知之甚少。

我們運(yùn)用LC-MS,western bolt方法發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了RBBP9在結(jié)直腸腫瘤中高表達(dá)，RBBP9可能是結(jié)直腸癌潛在生物標(biāo)志物，為進(jìn)一步的探索研究RBBP9在結(jié)直腸癌的作用做出微薄貢獻(xiàn)。