TRPV1在小兒支氣管哮喘中的表達以及與B7-H3和miR-29c相關(guān)性分析

張志英，靳秀紅，張小寧，張向峰，羅青林，張松林

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院·河南省兒童醫(yī)院·鄭州兒童醫(yī)院 呼吸科，河南 鄭州450000)

小兒支氣管哮喘是臨床常見慢性呼吸道疾病，兒童肺功能尚未完全發(fā)育成熟，是導(dǎo)致支氣管哮喘發(fā)病加重的主要原因，且易造成反復(fù)發(fā)作[1]。病情加重可并發(fā)呼吸衰竭，對患兒生命安全造成威脅[2]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，隨全球氣溫變暖、空氣環(huán)境惡化，小兒支氣管哮喘發(fā)病率呈逐年上升趨勢。相關(guān)研究顯示，支氣管哮喘的發(fā)生與變態(tài)反應(yīng)有關(guān)，且支氣管哮喘沒有特定時間限制，可在不同年齡段發(fā)病，但多數(shù)始發(fā)于4歲前[3-4]。相關(guān)資料顯示，哮喘嚴重程度不同，其病理結(jié)果、治療及預(yù)后均存有一定差異[5]。本研究對支氣管哮喘患兒TRPV1、B7-H3、miR-29c水平進行檢測，報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年4月—2020年4月在鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院收治的支氣管哮喘患兒172例作為研究對象，男94例，女78例，患兒年齡4-11歲，平均年齡7.5±2.1周歲。另選取同時段接受常規(guī)檢查的健康兒童172例為健康志愿者，男90例，女82例，兒童年齡5-10歲，平均年齡7.5±2.9周歲。所有研究兒童性別、年齡、病歷資料比較，無統(tǒng)計學(xué)差異，具有可比性。納入標準：所有患兒均符合中華醫(yī)學(xué)會對支氣管哮喘的診斷標準[6]；伴有急性喘氣、呼吸困難、咳嗽等癥狀出現(xiàn)。排除標準：①病歷資料不全兒童；②合并先天性心臟病，肺、肝腎等重要臟器功能不全者；③合并其他哮喘癥狀樣疾病或慢性肺疾病者；④合并血液系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者；⑤合并過敏性疾病者。本文研究內(nèi)容均已告知患兒家屬知情同意，并獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1肺功能檢測 使用肺活量檢測儀對患者FVC(用力肺活量)、FEVI(第一秒用力呼吸容積)、PEF(最大呼吸流量)進行檢測。

1.2.2指標檢測 抽取所有研究兒童空腹靜脈血液5 ml，在室溫下離心5 min，離心半徑為5 cm、轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，分離上清至無RNA酶的EP管中，于4℃環(huán)境下再次離心10 min，離心半徑為5 cm、轉(zhuǎn)速為1 200 r/min，分離上層血清并收集上清至無RNA酶的EP管中，-70℃保存，待用。(1)酶聯(lián)免疫吸附法檢測IgE、IFN-γ、EOS、TRPV1、H7-B3水平。按試劑盒說明書操作。(2)使用RT-PCR檢測miR-29c表達：首先提取TTK細胞總RNA，對提取總RNA的純度、含量進行檢測，隨后逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA后使用Primer5.0軟件設(shè)計引物，內(nèi)參為U6。設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25℃ 10 min,40℃ 60 min,85℃ 5 min；設(shè)置擴增條件:94℃ 20 s、72℃ 30 s、60℃ 30 s,35個循環(huán)，采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的miR-29c表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS21.0軟件分析。計量資料比較進行重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析，多組間比較進行F檢驗，組間兩兩比較采用獨立t檢驗，P值<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義的標準。相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 健康兒童與支氣管哮喘兒童肺功能比較

如表1所示，與健康志愿者相比，支氣管哮喘兒童FVC、FEVI、PEF水平明顯較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表1 健康兒童與支氣管哮喘兒童肺功能比較

2.2 健康兒童與支氣管哮喘兒童TRPV1、B7-H3、miR-29c表達比較

如表2所示，與健康志愿者相比，支氣管哮喘患兒TRPV1、B7-H3、miR-29c水平較高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表2 健康兒童與支氣管哮喘兒童TRPV1、B7-H3、miR-29c表達比較

2.3 兩組兒童哮喘相關(guān)細胞因子水平比較

如表3所示，與健康志愿者相比，支氣管哮喘兒童血清IgE、EOS水平較高，INF-γ水平較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表3 兩組兒童哮喘相關(guān)細胞因子水平比較

2.4 不同病情嚴重程度支氣管哮喘患兒TRPV1、B7-H3、miR-29c表達比較

如表4所示，與急性期患兒相比，緩解期患兒TRPV1、B7-H3、miR-29c表達均較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表4 不同病情嚴重程度支氣管哮喘TRPV1、B7-H3、miR-29c表達比較

2.5 TRPV1、B7-H3、miR-29c與小兒支氣管哮喘的相關(guān)性分析結(jié)果

如圖1所示，TRPV1、B7-H3呈正相關(guān)(r=0.254，P=0.001)；TRPV1、miR-29c呈正相關(guān)(r=0.286，P=0.001)；B7-H3、miR-29c呈正相關(guān)(r=0.214，P=0.004)。

圖1 TRPV1、B7-H3、miR-29c表達相關(guān)性圖

3 討論

支氣管哮喘作為常見兒科呼吸道疾病，由多種細胞及細胞因子參與[7]。哮喘已經(jīng)成為全世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題[8-9]。相關(guān)研究顯示，哮喘形成遺傳因素為主要致病原因，環(huán)境因素為重要外因，因此，對支氣管哮喘進行正確診斷及評估具有重要意義[10-11]。

哮喘由多種細胞和細胞因子共同參與[12]。香草醛亞型1受體又稱辣椒素受體，具有離子通道的特性，屬于瞬時感受電位離子通道超家族并廣泛存在于哺乳動物呼吸系統(tǒng)[13]。相關(guān)研究表明，TRPV1在支氣管哮喘兒童外周血中呈異常高表達。同時，TRPV1在支氣管狹窄、氣管黏膜水腫、咳嗽反射等方面發(fā)揮重要作用[14]。TRPV通道激活后可促進細胞鈣離子內(nèi)流，TRPV1在小兒支氣管哮喘發(fā)病調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[15-16]。

支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展與炎癥和免疫反應(yīng)具有密切聯(lián)系[17]。B7-H3作為共刺激分子B7家族成員，具有雙向調(diào)節(jié)T細胞作用。在急性期、緩解期患兒B7-H3水平呈異常高表達，且急性期高于緩解期；同時研究顯示，與健康兒童相比，支氣管哮喘患兒肺功能較低，且急性期低于緩解期，并與肺功能指標呈負相關(guān)[18-19]。本文研究結(jié)果顯示，通過B7-H3水平檢測對支氣管哮喘患兒病情評估具有一定參考價值。

研究資料表明，miRNA通過對下游靶基因調(diào)控參與機體生長發(fā)育、疾病發(fā)生等多種生理病理過程[20]。miR-29是與感染疾病具有密切聯(lián)系的miRNA家族，miR-29c在肺細胞感染患者外周血中呈異常升高，提示miR-29c水平變化與小兒支氣管哮喘的發(fā)生及其嚴重程度具有相關(guān)聯(lián)系[20-21]。