LncRNA H19和VEGF-b在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中的表達及臨床意義

唐曉蕾，代 艷，丁 倩，李 倩，蔣 艷，李 建

(1.綿陽市中心醫(yī)院 眼科，四川 綿陽621000；2.巴中市通江縣醫(yī)院 眼科，四川 巴中635700)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病患者最常見的微血管并發(fā)癥之一，已成為全球重要的公共衛(wèi)生和經(jīng)濟問題[1]。其發(fā)病機制復雜，至今尚不明確。有研究表明，新血管形成可引起視網(wǎng)膜靜脈阻塞和糖尿病性視網(wǎng)膜病等多種病理過程[3]。VEGF-b屬于血管內(nèi)皮生長因子家族成員，在病理組織中的蓄積會損害胰島素信號傳導，導致胰島素抵抗和代謝功能障礙，并導致2型糖尿病[4]。VEGF-b通過控制內(nèi)皮脂肪酸轉運蛋白的表達來調(diào)節(jié)脂質(zhì)通過血管內(nèi)皮運輸?shù)浇M織細胞的過程，即下調(diào)該途徑調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞長鏈脂肪酸的攝取，引起脈絡膜和視網(wǎng)膜新血管的形成，很多研究認為該作用可能與糖尿病性視網(wǎng)膜病變具有相關性[5-6]，但具體機制仍需要明確。長鏈非編碼 RNA(LncRNA)在基因轉錄和蛋白質(zhì)降解的直接調(diào)節(jié)以及細胞器生物發(fā)生和亞細胞運輸?shù)裙δ苤芯哂兄匾饔肹7]。研究表明，LncRNA與糖尿病等其他疾病的發(fā)生發(fā)展有關[8]，Thomas AA等研究表明LncRNA H19可通過Smad非依賴性機制涉及TGF-β調(diào)節(jié)糖尿病視網(wǎng)膜病變中的內(nèi)皮-間質(zhì)轉化[9]。本研究探究了LncRNA H19和VEGF-b在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體和血清中的表達水平，并分析了這兩個因子是否為糖尿病視網(wǎng)膜病變的危險因子，結果如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取于2017年5月-2019年6月期間就診于綿陽市中心醫(yī)院的2型糖尿病患者120例為研究對象，2型糖尿病診斷標準參考中國2型糖尿病防治指南(2010 版)[10]和2014年我國糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床診療指南[11]，根據(jù)眼底鏡和眼底熒光血管造影檢查結果將研究對象分為糖尿病無視網(wǎng)膜病變組(DM組，男19例，女21例)、非增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變組(NPDR組，男20例，女20例)和增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變組(PDR組，男20例，女20例)3組，每組各40例患者(40眼)。另選特發(fā)性黃斑裂孔且不伴糖尿病的患者40例(40眼)做對照組(NC組)，四組患者在年齡和性別方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，DM組、NPDR組和PDR組患者在糖尿病病程、空腹血糖水平及糖化血紅蛋白水平等方面差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。本次研究征得醫(yī)院醫(yī)學倫理學會同意，所有患者均簽署知情同意書。排除標準：有既往眼部手術患者(除NC組除外)；患有慢性疾病患者；患有腫瘤及免疫系統(tǒng)疾病者；近期患有眼部感染患者。

表1 4組患者基本信息比較

1.2 樣品采集與存儲

用臨床上常用的含抗凝劑的采血管空腹采集所有受試者血液樣本5 ml，將血液放置在室溫下凝結30 min后，3 000 rpm離心10 min取血清，立即將其冷凍在-80℃冰箱中備用；玻璃體樣品采集方法參考之前報道[12]，于玻璃體切除術時收集所有受試者玻璃體液和增生膜組織。于灌注前用玻璃體切割頭收集玻璃體液0.4 ml,于4-6℃保存?zhèn)溆?。術中收集 PDR患眼視網(wǎng)膜前增生膜和對照組內(nèi)界膜組織,于-80℃保存?zhèn)溆?。檢測LncRNA H19的玻璃體樣品盛放裝置需提前用RNA酶處理，以便保證RNA的提取質(zhì)量。

1.3 ELISA試劑盒檢測玻璃體和血清中VEGF-b、IL-6、TNF-α的檢測

利用ELISA試劑盒檢測玻璃體和血清中VEGF-b、IL-6、TNF-α水平(ELISA試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，檢測方法按產(chǎn)品說明書進行。

1.4 RT-qPCR檢測患者玻璃體和血清中LncRNA H19的表達水平

空腹采集所有受試者血液樣本10 ml，使血液在室溫下凝結30 min后，3 000 rpm離心10 min取血清，立即將其冷凍在80℃冰箱待檢。用總RNA提取試劑盒(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)提取血清中的總RNA，檢測吸光度值(OD)，若OD260/OD280在1.8-2.0之間則提取符合要求。將總RNA利用反轉錄試劑盒(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行擴增，用2-ΔΔCT表示受試者玻璃體和血清中LncRNA H19的相對表達水平。

1.5 免疫組化檢測LncRNA H19和VEGF-b陽性表達

將PDR組和NC組患者膜組織標本進行常規(guī)脫蠟及水化，把組織浸入二甲苯溶液中處理三次，完成后，再分別浸入不同濃度的酒精中。在由100 ml 0.01 mol枸櫞酸緩沖液+3 ml H2O+10 μl曲拉通X-100沖洗、浸泡，PBS沖洗3次，每次3 min；完成后，放入95°水浴加熱修復15 min，冷卻至室溫。沖洗，室溫封閉，滴加一抗，37℃ 30-40 min，沖洗，滴加二抗，37℃ 40 min，沖洗，DAB顯色，水洗終止反應，蘇木素復染，分化，梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封固，陽性染色為棕黃色，采用Motic高清晰彩色圖像測量系統(tǒng)分析。

1.6 Western blotting檢測VEGF-b、IL-6、TNF-α蛋白表達

用蛋白提取試劑盒提取視網(wǎng)膜組織全蛋白后，經(jīng)電泳和轉膜后，用5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃孵育過夜后PBS緩沖液15 min/3次洗膜后再用二抗室溫下孵育2 h，加入顯色劑曝光后，通過Image-Pro Plus系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值，β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 LncRNA H19和VEGF-b陽性表達

NC組患者視網(wǎng)膜組織中LncRNA H19陽性表達數(shù)高于PDR組(P<0.05)，VEGF-b陽性表達數(shù)低于PDR組(P<0.05)，見圖1。

圖1 NC組和PDR組患者LncRNA H19陽性表達結果比較

2.2 4組受試者玻璃體和血清中VEGF-b、IL-6、TNF-α表達水平比較

采用ELISA方法檢測4組受試者玻璃體和血清中VEGF-b、IL-6、TNF-α表達水平，結果表明與NC組相比，DM組、NPDR組和PDR組三組受試者中隨著視網(wǎng)膜病變的發(fā)生以及病程的延長，玻璃體和血清中VEGF-b和IL-6水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，VEGF-b在玻璃體和血清中的表達具有一致性。此外，VEGF-b檢測結果與免疫組化結果也具有一致性；TNF-α在四組受試者玻璃體和血清中水平相似，差異無統(tǒng)計學意義，如表2所示。

表2 各組受試者血清中VEGF-b、IL-6、TNF-α水平比較

2.3 4組受試者玻璃體和血清中LncRNA H19相對表達水平比較

4組受試者玻璃體和血清中LncRNA H19相對表達水平如圖2所示，結果表明NC組受試者LncRNA H19相對表達水平最高，DM組水平次之，PDR組LncRNA H19表達水平最低，玻璃體和血清中LncRNA H19相對表達水平趨勢相同，結果具有一致性，由此可知隨著視網(wǎng)膜的病變LncRNA H19表達水平也會降低。

圖2 4組受試者玻璃體和血清中LncRNA H19相對表達水平比較

2.4 Western blotting檢測PDR組和NC組患者膜組織中VEGF-b、IL-6、TNF-α蛋白表達

PDR組患者膜組織中VEGF-b、IL-6蛋白表達水平顯著高于NC組(P<0.05)，2組TNF-α無顯著差異，這與免疫組化和ELISA檢測結果一致，如圖3所示。

圖3 PDR組和NC組患者膜組織中VEGF-b、IL-6、TNF-α蛋白表達水平

2.5 PDR組患者血清中VEGF-b、LncRNA H19與IL-6、TNF-α相關性分析

Pearson 相關性分析結果提示血清中VEGF-b濃度與血清中IL-6水平呈線性正相關(r=0.899，P<0.01)，見圖(4A)；而血清中LncRNA H19相對表達水平與血清中IL-6濃度呈線性負相關(r=-0.858,P<0.01)，見圖(4B)。而血清中VEGF-b和LncRNA H19水平與血清中TNF-α濃度無明顯相關關系，相關性結果分別為(r=0.316,P=0.417)(r=-0.146，P=0.649)。

2.6 采用Logistic多元回歸分析VEGF-b和LncRNA H19是否為糖尿病視網(wǎng)膜病變的危險因素

已有無糖尿病視網(wǎng)膜病變?yōu)橐蜃兞?，以VEGF-b、LncRNA H19、病程、家族史、肥胖(IBM≥25 kg/m2)、高齡(≥60歲)、高血脂、飲酒、吸煙為自變量，行Logistic多元回歸分析，結果表明VEGF-b、LncRNA H19、病程為糖尿病視網(wǎng)膜病變的危險因素，見表3。

表3 Logistic多元回歸分析糖尿病視網(wǎng)膜病變危險因素

3 討論

糖尿病性視網(wǎng)膜病變是最常見且最嚴重的眼部并發(fā)癥[12]。在2.46億的糖尿病患者中，約有1/3患有糖尿病性視網(wǎng)膜病的跡象，其中1/3可能患有視力威脅性視網(wǎng)膜病，即嚴重的視網(wǎng)膜病或黃斑水腫。另外糖尿病視網(wǎng)膜病變的存在還意味著增加患者全身性血管并發(fā)癥的風險[13]。因此早期預防和治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變意義重大。本研究發(fā)現(xiàn)NC組患者視網(wǎng)膜組織中LncRNA H19陽性表達數(shù)高于PDR組，而VEGF-b陽性表達數(shù)低于PDR組，LncRNA H19或VEGF-b在玻璃體和血清中的表達結果也具有一致性，提示LncRNA H19和VEGF-b可能在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中發(fā)揮了重要作用，但仍需要進一步明確。

圖4 PDR組患者血清中VEGF-b與IL-6相關性分析結果(A),PDR組患者血清中LncRNA H19相對表達量與IL-6水平相關性分析結果(B)

IL-6是一種細胞炎性因子，在整個炎癥過程中均起作用，并可能導致血管通透性增加,在胰島素抵抗過程中也發(fā)揮著重要作用[14]，很多研究證實其在視網(wǎng)膜病變患者體內(nèi)水平的增加可能參與了病變的發(fā)生發(fā)展[15]。本研究結果表明，在DM組、NPDR組和PDR組患者玻璃體和血清中中IL-6水平升高，結果具有一致性，且在PDR患者視網(wǎng)膜組織中IL-6蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義，證實IL-6可能參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展。

本研究通過相關性分析表明PDR患者血清中VEGF-b表達水平與血清中IL-6水平具有正相關關系，而糖尿病無視網(wǎng)膜病變患者玻璃體和血清中VEGF-b表達水平比對照組表達水平升高，且單純型糖尿病視網(wǎng)膜病變組和增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變組患者玻璃體和血清中VEGF-b表達水平更高，提示VEGF-b可能與IL-6一樣參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變過程。VEGF-b是VEGF同源物，其在體內(nèi)可以靶向抑制脈絡膜和視網(wǎng)膜新血管形成。從機理上講，VEGF-b的血管存活作用是通過調(diào)節(jié)許多經(jīng)由NP-1和VEGFR-1的血管存活基因的表達來實現(xiàn)的[16]。有研究表明，VEGF-b在血管系統(tǒng)中的功能起著“生存”的作用，而不是“血管生成”因子，因此VEGF-b的抑制作用可能為治療新血管疾病提供新的治療機會[17]。另外本研究檢測膜組織中VEGF-b蛋白表達發(fā)現(xiàn)，PDR組患者膜組織中VEGF-b蛋白表達水平顯著高于NC組，這與免疫組化和ELISA檢測結果一致，本研究還發(fā)現(xiàn),VEGF-b是糖尿病視網(wǎng)膜病變的危險因素，推測 VEGF-b可能參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展，通過抑制視網(wǎng)膜病變患者血清中的VEGF-b水平可能會降低患者病變程度。

在糖尿病中，高糖水平的暴露會降低新生心肌細胞以及鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠心肌中LncRNA H19的表達，該模型被用作糖尿病模型，研究結果表明LncRNA H19在糖尿病大鼠心肌中表達水平顯著下調(diào)，這可能與心肌細胞自噬增加和心臟功能受損有關[18]。本研究結果表明NC組LncRNA H19相對表達水平最高，糖尿病無視網(wǎng)膜病變組水平次之，增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變組LncRNA H19表達水平最低，由此可知隨著視網(wǎng)膜病變的發(fā)展LncRNA H19表達水平也會降低，說明LncRNA H19可能與糖尿病視網(wǎng)膜病變有關。此外，相關性分析表明，PDR患者血清中LncRNA H19相對表達水平與IL-6濃度具有負相關關系，Logistic多元回歸分析顯示LncRNA H19是糖尿病視網(wǎng)膜病變的危險因素，因此其水平的降低可能參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體和血清中VEGF-b水平升高、LncRNA H19水平降低，兩者均為糖尿病視網(wǎng)膜病變的危險因素，可能與病變的發(fā)生發(fā)展相關，有望為糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制提供新方向。