3D 打印多孔鉭的生物安全性評價

張璞，蔣波，張玲，王旖，曾榮榮，楊柳，王富友，范能全（通信作者）

1 重慶市食品藥品檢驗檢測研究院 （重慶 401121）；2 陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院關(guān)節(jié)外科 （重慶 400038）

鉭是一種“親生物”的過渡金屬，作為醫(yī)學(xué)植入材料已被廣泛用于臨床近80年[1-2]。近年來，隨著材料科學(xué)的迅速發(fā)展，醫(yī)用多孔材料逐漸替代固體金屬被應(yīng)用于多種外科植入手術(shù)中，且應(yīng)用越來越廣泛、用量越來越大。多孔鉭憑借其自身的優(yōu)異特性，如良好的骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)與成骨作用，在眾多醫(yī)用材料中脫穎而出，成為最理想的植入材料之一[3-5]。3D 打印是一種快速成型技術(shù)，具有個性化、高精度等優(yōu)點，在生物醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其中，3D 打印個性化植入體是目前臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的新趨勢[6-7]?；诖?，本研究按照GB/T 16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評價》標(biāo)準(zhǔn)對3D 打印多孔鉭進(jìn)行了全面的生物安全性評價，旨在為該材料在外科植入領(lǐng)域的安全應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、儀器和動物

1.1.1 實驗材料

3D 打印多孔鉭、鉭圓片（直徑10 mm，厚1 mm）、鈦圓片（直徑10 mm，厚1 mm）均系陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院關(guān)節(jié)外科贈送；小鼠成纖維細(xì)胞（L929）、中國倉鼠肺細(xì)胞（CHL 細(xì)胞）均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海）；TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535菌株和大鼠肝臟微粒體酶S9均購自CHI SCIENTIFIC，絲裂霉素C 購自MYM BIOLOGICH TECHNOLOGY， 環(huán) 磷 酰 胺 購自SIGMA-ALDRICH，秋水仙素購自重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；高密度聚乙烯膜（Lot. No.C-161）及二乙基二硫代氨基甲酸鋅的聚氨酯膜（Lot. No. A-182K）均購自Hatano Research Institute，F(xiàn)DSC（日本東京）；大豆油（供注射用）購自廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司；0.9%氯化鈉注射液購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司。

1.1.2 實驗儀器

HVA-85高壓滅菌鍋（日本Hirayama 公司），Synergy HTX 酶標(biāo)儀（美國Biotek 公司），CB150二氧化碳培養(yǎng)箱（德國BINDER 公司），Sorvall ST 8R高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher 公司），MJ-250F-Ⅲ微生物培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司），IX71倒置生物顯微鏡（日本Olympus 公司），TBA-40FR 全自動生化分析儀（日本Toshiba 公司），BC-5300Vet 血液分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），UV2600分光光度計（日本Shimadzu 公 司），UX620H 電 子 天 平（日 本Shimadzu 公司），ACS-6Kg 電子計價秤（永康市永州衡器有限公司）。

1.1.3 實驗動物

普通級新西蘭兔，由濟(jì)南金豐實驗動物有限公司提供；SPF 級KM 小鼠，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供；Hartley 豚鼠，由重慶壁山區(qū)騰鑫養(yǎng)殖場提供。動物均在重慶市食品藥品檢驗檢測研究院動物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，相對濕度40%～70%，12/12 h 明暗交替照明。

1.2 方法

1.2.1 3D 打印多孔鉭試樣浸提液制備

采用超純水超聲清洗3D 打印多孔鉭試樣15 min，自然晾干，再置高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃滅菌30 min，備用。根據(jù)GB/T 16886.12-2017《醫(yī)療器械生物學(xué)評價第12部分：樣品制備與參照材料》的規(guī)定，細(xì)胞試驗采用RPMI.完全1640培養(yǎng)液作為浸提介質(zhì)，按照0.2 g/ml 的比例在37 ℃浸提24 h；其他試驗項目均選用0.9%氯化鈉注射液和大豆油（供注射用）分別作為極性溶劑和非極性溶劑，按照0.2 g/ml 的比例加入后于37 ℃條件下浸提72 h。

1.2.2 遺傳毒性試驗[8]

根據(jù)GB/T 16886.3-2019《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第3部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗》推薦，采用細(xì)菌回復(fù)突變試驗、哺乳動物細(xì)胞微核試驗和體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗組合進(jìn)行遺傳毒性試驗。

1.2.2.1 細(xì)菌回復(fù)突變試驗

取鑒定合格的TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株的凍存液0.1 ml 接種至裝有25 ml 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，融化頂層瓊脂培養(yǎng)基分裝于無菌小試管中，2 ml/管，于45 ℃水浴中保溫待用。

在保溫的頂層瓊脂培養(yǎng)基中依次加入測試菌株新增菌液0.1 ml 和浸提液0.1 ml，溶劑對照組加入0.1 ml 菌液和0.1 ml 浸提介質(zhì)，需活化時另外加入0.5 ml 的S9，混勻后，迅速傾入底層培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動平皿使頂層瓊脂培養(yǎng)基均勻分布在底層上，平放固化，每個劑量做3個平皿；于37 ℃培養(yǎng)48 h 后，觀察并計數(shù)各組回變菌落數(shù)。

1.2.2.2 哺乳動物細(xì)胞微核試驗

健康成年SPF 級KM 小鼠50只，雌、雄各半，體質(zhì)量20～22 g。按體質(zhì)量隨機(jī)分為極性/非極性溶劑組、極性/非極性浸提液組、陽性對照組，每組10只，雌、雄各半。試驗采用30 h 兩次給藥法，各組按20 ml/kg.bw 腹腔注射，連續(xù)給予2次，間隔24 h，并于末次給藥后6 h 采集骨髓樣品，與新生牛血清混勻后制備骨髓涂片、固定、染色。在顯微鏡下觀察計數(shù)200個紅細(xì)胞中嗜多染紅細(xì)胞（polychromatic erythrocytes，PCE）、 正 染 紅 細(xì) 胞（normochromatic erythrocyte，NCE）的個數(shù)，計算PCE/（PCE+NCE）的比值；計數(shù)含微核的PCE 細(xì)胞數(shù)，微核率以千分率表示。

1.2.2.3 體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗

取處于指數(shù)分裂期貼壁生長良好的CHL 細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106個/ml，培養(yǎng)24 h。按照表1所示加樣方式加樣，每組設(shè)2個平行瓶。

表1 試驗加樣方式

各組在終止培養(yǎng)前4 h，加入50 μg/ml 秋水仙素0.1 ml 至5 ml 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)結(jié)束時，進(jìn)行細(xì)胞收集與計數(shù)。細(xì)胞懸浮液經(jīng)低滲處理后固定、滴片、染色，在顯微鏡下觀察并記錄染色體畸變情況。

1.2.3 溶血試驗[9]

普通級新西蘭兔，體質(zhì)量2.5 kg，采血制備成稀釋兔血；將供試品極性/非極性浸提液組、陰性對照組、陽性對照組的全部試管放入37 ℃水浴中保溫30 min 后，每支試管加入0.2 ml 稀釋兔血，輕輕混勻，置于37 ℃水浴中繼續(xù)保溫60 min；倒出各管內(nèi)液體以800×g 離心5 min ；吸取上清液在545 nm 波長處測量吸光度。

1.2.4 體外細(xì)胞毒性試驗[10]

取生長良好的L929細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105個/ml，將其接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h；吸出培養(yǎng)基，每孔加入100 μl 供試品100%浸提液（S-100%）、供試品75%浸提液（S-75%）、供試品50%浸提液（S-50%）、供試品25%浸提液（S-25%）、陰性對照液（高密度聚乙烯膜浸提液）、陽性對照液（二乙基二硫代氨基甲酸鋅聚氨酯膜浸提液）及空白培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h 觀察結(jié)果，并進(jìn)行MTT 檢查后計算細(xì)胞存活率。

1.2.5 植入后局部反應(yīng)[11]

普通級新西蘭兔48只，雌、雄各半，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，采用家兔脊柱旁肌植入方法分別將1片直徑10 mm、厚度1 mm 的鉭圓片及鈦圓片沿脊柱一側(cè)植入肌肉，與脊柱平行，離中線25～50 mm，作為實驗組及對照組；術(shù)后觀察動物一般情況，分別于第14、28、56、84天后無痛處死動物，進(jìn)行大體、組織學(xué)觀察并評價。

1.2.6 皮內(nèi)反應(yīng)試驗[12]

普通級新西蘭兔3只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，在每只家兔脊柱側(cè)去毛區(qū)按規(guī)定分別注射極性/非極性浸提液及相應(yīng)的陰性對照液，注射后即刻及24、48、72 h 觀察記錄各注射部位狀況并計分。

1.2.7 皮膚致敏試驗[12]

Hartley 豚鼠50只，體質(zhì)量300～500 g，按體質(zhì)量隨機(jī)分為供試品極性/非極性浸提液組、極性/非極性溶劑組和陽性對照組，每組10只；通過動物肩胛骨的內(nèi)側(cè)皮內(nèi)注射0.1 ml 進(jìn)行誘導(dǎo)，皮內(nèi)注射后7 d，采用敷貼片局部貼敷覆蓋誘導(dǎo)注射點，局部誘導(dǎo)階段后14 d，使用供試品進(jìn)行激發(fā)，并于試驗結(jié)束后24、48 h 觀察動物激發(fā)部位情況并計分。

1.2.8 急性全身毒性試驗[13]

SPF 級KM 小鼠20只，體質(zhì)量18～22 g，按體質(zhì)量隨機(jī)分為供試品極性/非極性浸提液組、極性/非極性溶劑組，每組5只；按50 ml/kg.bw 進(jìn)行腹腔注射，給藥后觀察72 h。

1.2.9 亞慢毒性試驗[13]

普通級新西蘭兔24只，雌、雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組、供試品組，每組12只。本試驗的供試品為直徑10 mm、厚1 mm 的鉭圓片。于試驗第1天從家兔背部肌肉植入3片鉭圓片；第90天每組各解剖8只動物，雌、雄各半，采集標(biāo)本進(jìn)行血液學(xué)、血液生化學(xué)、病理等檢測；第91天取出供試品組剩下4只動物體內(nèi)植入的鉭圓片，恢復(fù)30 d，于第121天解剖所有動物并采集標(biāo)本做檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 遺傳毒性試驗

2.1.1 細(xì)菌回復(fù)突變試驗

如圖1所示，供試品極性/非極性浸提液組在加和不加代謝活化系統(tǒng)的條件下TA97、TA98、TA100、TA102菌株的回變菌落數(shù)均小于溶劑對照組計數(shù)的2倍，TA1535菌株的回變菌落數(shù)小于溶劑對照組計數(shù)的3倍，表明3D 打印多孔鉭細(xì)菌回復(fù)突變試驗為陰性。

2.1.2 哺乳動物細(xì)胞微核試驗

2.1.2.1 PCE/（PCE+NCE）比值

如圖2A 所示，供試品極性/非極性浸提液組小鼠的骨髓PCE/（PCE+NCE）比值與對應(yīng)的溶劑對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明3D 打印多孔鉭試樣無體內(nèi)骨髓細(xì)胞毒性。

2.1.2.2 微核試驗結(jié)果

如圖2B 所示，陽性對照組小鼠PCE 中微核明顯增多，與溶劑對照組及供試品極性/非極性浸提液組比較，微核率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明試驗成立；供試品極性/非極性浸提液組小鼠PCE 微核率與對應(yīng)溶劑對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明3D 打印多孔鉭無體內(nèi)遺傳毒性。

2.1.3 體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗

3D 打印多孔鉭浸提液對CHL 細(xì)胞的毒性：細(xì)胞毒性結(jié)果顯示，3D 打印多孔鉭浸提液在加和不加S9條件下接觸CHL 細(xì)胞4 h，在不加S9條件下接觸CHL細(xì)胞24 h，其相對細(xì)胞增長數(shù)分別為84.68%、85.07%、84.68%，均大于80%，無細(xì)胞毒性。

3D 打印多孔鉭浸提液對CHL 細(xì)胞染色體的影響：染色體畸變觀察結(jié)果表明，3D 打印多孔鉭浸提液在加和不加S9條件下接觸CHL 細(xì)胞4 h，在不加S9條件下接觸CHL 細(xì)胞24 h，均未發(fā)現(xiàn)畸變細(xì)胞，其染色體畸變率與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明3D 打印多孔鉭無致染色體畸變作用。

綜合細(xì)菌回復(fù)突變試驗、哺乳動物細(xì)胞微核試驗和體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗的結(jié)果，表

2.2 溶血試驗

2.3 細(xì)胞毒性試驗

從細(xì)胞形態(tài)方面看，3D 打印多孔鉭浸提液組的細(xì)胞生長良好，與空白對照組中的細(xì)胞形態(tài)無差異；MTT 試驗中，以空白對照組作為存活率100%計算，3D 打印多孔鉭浸提原液（S-100%）及3個濃度稀釋液（S-75%、S-50%、S-25%）接觸L929細(xì)胞24 h 后，其細(xì)胞存活率均大于80%，大于空白對照組的70%，S-50%組存活率大于S-100%組的存活率，具體結(jié)果見圖3，表明3D 打印多孔鉭無潛在細(xì)胞毒性。

2.4 植入后局部反應(yīng)

試驗期間，所有實驗動物術(shù)后一般情況良好，進(jìn)食及活動正常，傷口無腫脹、分泌物，均無感染發(fā)生，也未見材料排出，傷口均2周愈合。

解剖時肉眼觀察，鉭圓片和鈦圓片植入位置基本正常，纖維囊形成良好，鉭、鈦圓片與周圍肌肉結(jié)合緊密，無移位、無脫出，取出順利，囊壁纖維組織與鉭、鈦圓片未見明顯粘連；取材時測量植入材料大小，與術(shù)前相比，外觀尺寸保持不變。

家兔肌肉局部植入試驗的肌肉刺激反應(yīng)結(jié)果見表2，病理半定量評價結(jié)果見圖4。試驗結(jié)果表明，供試品組術(shù)后各觀察時間點的肌肉刺激反應(yīng)等級、植入后局部組織病理改變評分與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 家兔肌肉刺激反應(yīng)等級

2.5 皮內(nèi)反應(yīng)試驗

供試品極性/非極性浸提液組以及陰性對照組在注射后24、48、72 h 的評分均為0，未見刺激反應(yīng)。試驗結(jié)果表明，3D 打印多孔鉭無皮內(nèi)刺激作用。

2.6 皮膚致敏試驗

供試品極性/非極性浸提液組以及極性/非極性溶劑組在激發(fā)后24、48 h 的評分均為0，未見皮膚致敏反應(yīng)；陽性對照組在去除敷貼片后24 h 有1只動物評分為2分，2只動物評分為1分；48 h 有2只動物評分為1分，出現(xiàn)皮膚致敏。試驗結(jié)果表明，重復(fù)接觸3D 打印多孔鉭對Hartley 豚鼠不引起致敏反應(yīng)。

2.7 急性全身毒性試驗

對小鼠腹腔注射3D 打印多孔鉭的極性/非極性浸提液，在72 h 觀察期內(nèi)小鼠未見中毒癥狀或不良反應(yīng)，且小鼠體質(zhì)量正常增長。試驗結(jié)果表明，3D 打印多孔鉭不會引起急性全身毒性反應(yīng)。

2.8 亞慢毒性試驗

試驗期間，所有實驗動物術(shù)后一般情況良好，進(jìn)食及活動正常。供試品組動物在植入期和恢復(fù)期的體質(zhì)量增長率、攝食量、主要臟器體質(zhì)量比以及尿常規(guī)與假手術(shù)組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

血液學(xué)的15個指標(biāo)以及血液生化的18個指標(biāo)中，供試品組和假手術(shù)組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具體結(jié)果見表3～4。

表3 血液學(xué)檢測統(tǒng)計結(jié)果（±s）

表3 血液學(xué)檢測統(tǒng)計結(jié)果（±s）

檢測項目 植入期（n=8） 恢復(fù)期（n=4）假手術(shù)組 供試品組 假手術(shù)組 供試品組凝血酶原時間（s） 8.50±0.25 9.18±0.73 9.52±0.46 9.62±0.29活化部分凝血活酶時間（s） 46.20±9.17 50.5±12.8 61.80±6.38 61.00±4.57白細(xì)胞計數(shù)(G/L) 9.05±3.53 6.84±2.29 7.33±2.93 6.66±2.22紅細(xì)胞計數(shù)（T/L） 5.87±0.44 5.57±1.02 5.99±0.54 6.07±0.64血紅蛋白（g/L） 129.86±7.86 125.17±22.80 135.00±8.41 134.80±5.26紅細(xì)胞容積（L/L） 40.04±4.65 36.48±6.35 39.13±2.55 38.50±1.50平均紅細(xì)胞容積（fl） 68.07±3.21 65.65±5.14 65.55±2.95 63.86±4.67平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（pg） 22.16±1.08 22.48±1.48 22.63±1.08 22.34±1.72平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（g/L） 326.43±23.24 342.67±7.84 345.17±5.19 350.00±3.74紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)（%） 12.49±1.00 12.48±0.66 12.45±0.46 12.58±0.41紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差（%） 37.16±3.74 35.58±3.05 35.67±2.18 35.08±1.83血小板計數(shù)(G/L) 418.86±172.73 331.83±162.29 302.50±39.02 326.80±115.35平均血小板體積（fl） 5.94±0.49 6.33±0.41 6.25±0.59 6.02±0.51血小板分布寬度（fl） 15.19±0.29 15.22±0.42 15.07±0.31 15.02±0.26血小板壓積 0.25±0.11 0.21±0.10 0.19±0.02 0.19±0.06

對供試品組和假手術(shù)組動物的肝、心、脾、肺、腎、腦等組織、器官以及試驗部位肌肉進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)檢查，各組織、器官和試驗部位肌肉均未見明顯毒性作用。

3 討論

多孔鉭是新一代理想的植入材料，伴隨個性化醫(yī)療的發(fā)展，3D 打印多孔鉭已成為研究熱點。目前，關(guān)于3D 打印多孔鉭制備工藝和臨床治療有效性的研究較多[14]，安全性方面的研究多為體外細(xì)胞試驗，在體安全性方面的研究甚少，因此，3D 打印多孔鉭的生物安全性需要更全面、系統(tǒng)的試驗數(shù)據(jù)來證實。本研究根據(jù)GB/T 16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評價》標(biāo)準(zhǔn)中對植入材料的要求，對外科植入物用3D 打印多孔鉭材料進(jìn)行了全面的生物安全性評價。試驗結(jié)果表明，3D 打印多孔鉭無遺傳毒性，不引起溶血反應(yīng)，無潛在細(xì)胞毒性，不引起皮內(nèi)刺激，無皮膚致敏性，不引起急性全身毒性反應(yīng)，無亞慢性全身毒性，符合國家醫(yī)用材料臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)。

長期植入用產(chǎn)品植入后的局部反應(yīng)、亞慢性毒性試驗應(yīng)是安全性評價重點關(guān)注的內(nèi)容。較采用大鼠尾靜脈注射等方式進(jìn)行亞慢性全身毒性的考察方式，本研究采用新西蘭兔肌肉植入的方式進(jìn)行試驗，能重現(xiàn)該材料的臨床使用方式，更直接、真實地反映植入材料產(chǎn)品的安全性；同時，采用臨床上應(yīng)用廣泛且生物相容性研究也相對成熟的材料鈦[15]作為植入后局部反應(yīng)試驗的參照樣品，試驗結(jié)果顯示，供試品與參照樣品比較，各項指標(biāo)均無明顯差異。

表4 血液生化檢測統(tǒng)計結(jié)果（±s）

表4 血液生化檢測統(tǒng)計結(jié)果（±s）

檢測項目 植入期（n=8） 恢復(fù)期（n=4）假手術(shù)組 供試品組 假手術(shù)組 供試品組肌酐（μmol/L） 248.57±147.43 268.33±37.76 220.50±39.62 205.40±44.55谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（IU/L） 10.14±4.18 9.50±3.27 10.00±4.05 11.60±6.50尿素（mmol/L） 6.67±1.59 5.27±0.80 6.02±1.95 6.15±1.59丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（U/L） 63.29±27.71 45.50±17.91 66.33±32.41 75.80±43.43門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（U/L） 47.29±30.14 37.50±8.04 57.17±26.77 68.40±39.62堿性磷酸酶（U/L） 52.29±13.59 59.33±10.37 48.17±13.91 65.80±39.20總蛋白（g/L） 73.63±11.21 72.87±6.48 68.80±5.54 67.52±7.05白蛋白（g/L） 44.19±2.68 43.77±3.03 43.07±2.33 42.22±1.51球蛋白（g/L） 29.44±9.65 29.10±4.73 25.73±5.14 25.30±5.89總膽紅素（μmol/L） 41.79±35.80 53.45±11.11 36.68±10.53 32.40±12.03葡萄糖（mmol/L） 11.49±7.48 12.43±9.89 7.33±2.05 7.72±0.65膽固醇（mmol/L） 1.33±0.71 1.49±0.55 0.93±0.45 1.23±0.66三酰甘油（mmol/L） 0.99±0.15 1.03±0.30 0.83±0.18 1.07±0.31 K（mmol/L） 6.31±1.92 5.73±0.83 6.50±1.09 4.66±1.29 Na（mmol/L） 126.29±1.50 126.83±1.33 125.17±1.17 125.80±1.79 Cl（mmol/L） 137.57±37.87 145.17±38.05 151.33±40.14 138.00±50.08 Ca（mmol/L） 3.16±0.21 3.17±0.20 3.25±0.24 3.01±0.27 P（mmol/L） 2.29±0.72 2.15±0.26 2.24±0.34 2.20±0.47

總之，3D 打印多孔鉭是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有前景的材料，具有良好的生物相容性，本研究為3D 打印多孔鉭在外科植入領(lǐng)域的安全應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。