疏肝健脾法對肝郁脾虛型功能性消化不良大鼠SP、GAS、MTL、VIP的影響

范明明，林 偉，韓海瑞，張嘉裕，王 順

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150000)

功能性消化不良(FD)是一種功能性的胃腸道疾病，以上腹部疼痛、燒灼感、餐后飽脹和早飽感中的1項(xiàng)或多項(xiàng)為主要臨床表現(xiàn)，可伴上腹部脹滿、食欲不振、惡心、嘔吐及噯氣，需排除因代謝性、系統(tǒng)性和器質(zhì)性疾病所導(dǎo)致的消化不良[1]。羅馬Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)將功能性消化不良分為餐后不適綜合征、上腹痛綜合征以及混合型[2]。中醫(yī)依據(jù)該病臨床特點(diǎn)，將其歸屬于“胃脘痛”“痞滿”等范疇，臨床以肝郁脾虛多見。筆者依據(jù)多年豐富臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，以自擬疏肝健脾方藥對肝郁脾虛證FD患者辨證施治，效果顯著，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究通過建立肝郁脾虛FD大鼠模型，探討了疏肝健脾法治療FD的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 雄性健康SPF級SD大鼠60只，體重(220±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(黑)2016004。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)期間充足清潔飲水，自由攝食，室溫控制在(22±2)℃，相對濕度維持在55%～60%。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 柴術(shù)理胃飲組方：柴胡15 g、黨參20 g、白術(shù)15 g、白芍15 g、枳實(shí)10 g、陳皮10 g、姜半夏10 g、丹參10 g、砂仁10 g、炙甘草10 g，黑龍江省中醫(yī)醫(yī)院藥房提供，常規(guī)水煎濃縮至10.8 g/mL后4 ℃冷藏備用。多潘立酮(西安楊森制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20033213，規(guī)格：10 mg/片)，蒸餾水配制成0.3 mg/mL的溶液備用。

1.3主要試劑 P物質(zhì)(SP)抗體(批號：BS-0065R)、胃泌素(GAS)抗體(批號：BS-1189R)、胃動素(MTL)抗體(批號：BS-1445R)、血管活性腸肽(VIP)抗體(批號：BS-0077R)均由北京博奧森提供；內(nèi)參抗體β-actin(wanleibio，WL01845)；TRNzol總RNA提取試劑[天根生化科技(北京)有限公司，DP405-02]。

1.4主要儀器 超速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀，H-2050R)；凝膠成像系統(tǒng)(北京六一，WD-9413型)；雙垂直蛋白電泳儀(DYCZ-24DN)；分光光度計(jì)(Therno Scientific，NANODROP 2000)；熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，ABI7500)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法 將曠場試驗(yàn)篩選符合標(biāo)準(zhǔn)的60只SPF級雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、柴術(shù)理胃飲低劑量組、柴術(shù)理胃飲中劑量組、柴術(shù)理胃飲高劑量組和多潘立酮組，每組10只。除正常組外，其余組大鼠均采用復(fù)合因素刺激(慢性疲勞+懸尾刺激+飲食失節(jié))方法[3]制備FD模型，造模周期為28 d。造模成功后，柴術(shù)理胃飲低、中、高劑量組分別給予13.5 g/kg、27 g/kg、54 g/kg柴術(shù)理胃飲灌胃，多潘立酮組給予制備的多潘立酮溶液3.125 mg/kg灌胃，正常組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)21 d。

1.6觀察指標(biāo)及方法

1.6.1大鼠一般狀態(tài) 記錄各組大鼠實(shí)驗(yàn)過程中的精神狀態(tài)、毛發(fā)情況、活動度、大便性狀等行為學(xué)改變。

1.6.2大鼠體重和進(jìn)食量 造模前和末次灌胃當(dāng)天用電子秤稱量各組大鼠空腹體重；記錄造模前7 d和灌胃最后7 d時(shí)進(jìn)食量,計(jì)算每日平均進(jìn)食量,分別作為造模前和末次灌胃當(dāng)天進(jìn)食量。

1.6.3大鼠胃腸動力 末次灌胃后，大鼠禁食12 h，給予1 mL/100 g碳素墨水灌胃，30 min 后用10%水合氯醛腹腔麻醉。剖腹取胃稱重為全重，然后沿胃小彎側(cè)剪開胃壁并沖洗，濾紙吸干后稱重為凈重，計(jì)算胃排空率[胃排空率=(全重-凈重)/全重×100%]。截取小腸全段，測量小腸全長和幽門至炭墨上緣距離，計(jì)算小腸推進(jìn)率[小腸推進(jìn)率=碳墨推進(jìn)距離/小腸全長×100%]。

1.6.4大鼠胃竇組織病理形態(tài)學(xué)觀察 檢測胃腸動力后，取大鼠胃竇組織,放入4%多聚甲醛中固定，然后常規(guī)脫水、浸蠟和包埋，制備4 μm厚切片，HE染色觀察病理學(xué)表現(xiàn)。

1.6.5胃竇組織中SP、GAS、MTL、VIP蛋白表達(dá)量采用免疫印跡法檢測：采用BCA方法提取胃竇組織中SP、GAS、MTL、VIP蛋白并測定含量，常規(guī)電泳。電泳結(jié)束后，將“海綿-濾紙-膜-膠-濾紙-海綿”在80 V電壓下轉(zhuǎn)印1.5 h。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將PVDF膜浸入脫脂奶粉溶液中，搖床緩慢搖動1 h結(jié)束封閉。1∶500的抗體稀釋液(TBST，5%脫脂奶粉)稀釋一抗，4 ℃條件下孵育過夜；1∶5 000的抗體稀釋液稀釋二抗，37 ℃下孵育45 min。將孵育二抗后的PVDF膜均勻地灑上ECL發(fā)光液，靜置5 min并在暗室進(jìn)行曝光。將曝光后的PVDF膜浸入蒸餾水中，搖床搖動5 min，重復(fù)2次，再加入剝脫液并搖床搖動15 min；將洗滌后的PVDF膜放入蒸餾水中，搖床搖動10 min，重復(fù)2次。將抗體剝脫后的PVDF膜浸入TBST中，搖床搖動5 min，緊接著浸入脫脂奶粉溶液中，搖床緩慢搖動1 h進(jìn)行封閉。按照以上相同步驟孵育內(nèi)參抗體，然后將ECL發(fā)光液均勻地灑在PVDF膜上，靜置5 min并在暗室進(jìn)行曝光。最后掃描膠片，用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.6.6胃竇組織中SPmRNA表達(dá)量 采用Real Time PCR法檢測：充分研磨胃竇組織，加入TRIzol，室溫保存5 min后加入0.2 mL氯仿并充分混合，室溫放置5 min；12 000 r/min離心15 min后吸取上層水相預(yù)冷異丙醇靜置10 min，再次離心15 min后棄掉上清液，加入75% DEPC乙醇離心后靜置并加入DEPC水溶解沉淀完成總RNA提取,紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度；電泳后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，將cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。Real Time PCR反應(yīng)體系：2 × Master Mix共10 μL、SP上游引物0.5 μL、SP下游引物0.5 μL、cDNA 2 μL、水7 μL。引物序列：SP上游引物為5’-ATGAAA ATCCTCGTGGCGGT-3’，下游引物為5’-AATGGGCAAACGGGATGCTG-3’，產(chǎn)物大小210 bp；ACTIN上游引物為5’-CATCTCTTGGAAGT CA-3’，下游引物為5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3’，產(chǎn)物大小280 bp。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。再95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃的條件下獲得熔解曲線。β-actin在相同條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)并獲取溶解曲線。每個(gè)樣本檢測3個(gè)復(fù)孔，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般狀態(tài) 造模初期，各組大鼠的飲水進(jìn)食、體重、糞便性狀及皮毛色澤等均正常。造模結(jié)束，造模各組大鼠的飲水量和進(jìn)食量均減少，精神差，皮毛少光澤，體重下降，自主活動顯著減少，稀便，反應(yīng)力較差。灌胃結(jié)束，柴術(shù)理胃飲各組和多潘立酮組大鼠飲水量、進(jìn)食量基本恢復(fù)，皮毛光澤，體重緩慢增長，自主活動增多，糞便性狀均正常。

2.2各組大鼠體重及進(jìn)食量比較 末次灌胃當(dāng)天，模型組大鼠體重及進(jìn)食量均明顯低于模型組(P均<0.05)；柴術(shù)理胃飲各組和多潘立酮組大鼠體重及進(jìn)食量均明顯高于模型組(P均<0.05)；各藥物組間進(jìn)食量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),柴術(shù)理胃飲高劑量組大鼠體重明顯高于柴術(shù)理胃飲低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 正常組和功能性消化不良各組大鼠體重及進(jìn)食量比較

2.3各組大鼠胃排空率與小腸推進(jìn)率比較 模型組大鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率均明顯低于正常組(P均<0.05)，柴術(shù)理胃飲各組和多潘立酮組大鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率均明顯高于模型組(P均<0.05)；柴術(shù)理胃飲高劑量組大鼠胃排空率明顯高于柴術(shù)理胃飲低劑量組(P<0.05)，各藥物組間小腸推進(jìn)率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 正常組和功能性消化不良各組大鼠胃排空率與小腸推進(jìn)率比較

2.4各組大鼠胃竇組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 正常組大鼠胃竇組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞排列均正常，未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠胃竇黏膜層可見淋巴細(xì)胞浸潤；柴術(shù)理胃飲各組和多潘立酮組大鼠胃竇黏膜層可見少量淋巴細(xì)胞浸潤，浸潤程度輕于模型組。見圖1。

圖1 正常組和功能性消化不良各組大鼠胃竇組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(HE，×100)

2.5各組大鼠胃竇組織中SP、GAS、MTL、VIP蛋白表達(dá)情況 與正常組比較，模型組大鼠胃竇組織中SP、GAS、MTL蛋白表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)，VIP蛋白表達(dá)量明顯增高(P<0.05)。柴術(shù)理胃飲中、高劑量組大鼠胃竇組織中SP、GAS、MTL蛋白表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，柴術(shù)理胃飲低劑量組和多潘立酮組SP、GAS、MTL蛋白表達(dá)量與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；柴術(shù)理胃飲各組和多潘立酮組大鼠胃竇組織中VIP蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)；柴術(shù)理胃飲高劑量組SP、GAS、MTL蛋白表達(dá)量均明顯高于柴術(shù)理胃飲低劑量組(P均<0.05)，VIP蛋白表達(dá)量明顯高于柴術(shù)理胃飲低劑量組(P<0.05)。見圖2～5。

圖2 正常組和功能性消化不良各組大鼠胃竇組織中SP蛋白表達(dá)情況

圖3 正常組和功能性消化不良各組大鼠胃竇組織中GAS蛋白表達(dá)情況

圖4 正常組和功能性消化不良各組大鼠胃竇組織中MTL蛋白表達(dá)情況

2.6各組大鼠胃竇組織中SP mRNA表達(dá)情況 模型組大鼠胃竇組織中SP mRNA表達(dá)量明顯低于正常組(P<0.05)；柴術(shù)理胃飲各組和多潘立酮組大鼠胃竇組織中SP mRNA表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，且柴術(shù)理胃飲高劑量組明顯高于柴術(shù)理胃飲低劑量組(P<0.05)。見圖6。

圖5 正常組和功能性消化不良各組大鼠胃竇組織中VIP蛋白表達(dá)情況

圖6 正常組和功能性消化不良各組大鼠胃竇組織中SP mRNA表達(dá)情況

3 討 論

目前FD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為與胃腸道運(yùn)動功能障礙、胃的高敏感性、胃十二指腸低級別炎癥、幽門螺桿菌感染、精神心理因素、腦-腸軸功能紊亂、遺傳易感性等諸多因素密切相關(guān)[4-6]。其中腦-腸軸功能紊亂被視為FD發(fā)病的重要核心機(jī)制，腦-腸軸是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)連接而成的一種雙向神經(jīng)調(diào)節(jié)回路，主要由分布于其間的腦腸肽(由胃腸激素、胃腸神經(jīng)肽、神經(jīng)肽組成)將整合后的各種信息通過神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)傳遞到胃腸內(nèi)分泌細(xì)胞而起到調(diào)節(jié)作用，其中胃腸激素SP、GAS、MTL、VIP分泌紊亂與FD的發(fā)生密切相關(guān)[7-9]。

SP是由11個(gè)氨基酸組成的神經(jīng)肽，作為主要的興奮性非膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)，能促進(jìn)乙酰膽堿釋放，從而誘導(dǎo)胃腸道平滑肌收縮。腸道低度炎性狀態(tài)下可刺激SP釋放，增加內(nèi)臟敏感性并加速胃腸蠕動，且可以下調(diào)炎癥因子來減輕腸損傷，維持腸黏膜屏障完整性[10-12]。GAS由存在于胃竇和十二指腸內(nèi)的G細(xì)胞分泌，也存在于垂體和大腦皮質(zhì)中，并受中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)調(diào)節(jié)。其主要生理功能是促進(jìn)胃酸分泌，刺激胃腸道黏膜增生并起營養(yǎng)保護(hù)作用，加強(qiáng)胃腸道運(yùn)動，此外還可以加速胃電節(jié)律，促進(jìn)胃竇和幽門括約肌收縮[13-15]。在緊張焦慮等環(huán)境下，血清GAS含量降低[16]。MTL主要是由M細(xì)胞合成分泌，能夠啟動胃腸移行性肌電復(fù)合波(MMC)Ⅲ相，提高胃腸道平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，促進(jìn)胃蛋白酶分泌，可加速腸胃蠕動及胃排空[17]，還可作為中樞神經(jīng)遞質(zhì)參與焦慮等行為及情緒的整合[18]。VIP分布于中樞神經(jīng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)中，其既是一種胃腸道激素，又是一種非腎上腺能非膽堿能神經(jīng)抑制系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，能夠松弛胃腸道平滑肌，延遲胃排空，抑制胃液分泌[19]；徐派的等[20]研究報(bào)道，肝郁脾虛型FD大鼠下丘腦、胃竇、空腸中VIP表達(dá)明顯增高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝郁脾虛型FD大鼠模型胃排空率和小腸推進(jìn)率降低，胃竇組織中SP、GAS、MTL蛋白表達(dá)均下降，VIP蛋白表達(dá)增加，與既往研究結(jié)論一致。

柴術(shù)理胃飲由柴胡疏肝散、小建中湯、香砂六君子湯加減而成，其中柴胡疏肝氣而調(diào)達(dá)肝木，白術(shù)補(bǔ)氣健脾，二者相合肝郁解而脾旺。黨參補(bǔ)中益氣、健脾益肺，與白術(shù)相伍補(bǔ)脾胃之虛；枳實(shí)、陳皮理氣健脾、行氣和胃，與白術(shù)、黨參相伍補(bǔ)而不滯；白芍養(yǎng)血柔肝，緩急止痛。姜半夏燥濕化痰，降逆消痞；砂仁芳香醒脾化濕，行氣和胃；丹參活血祛瘀止痛，甘草調(diào)和諸藥。全方具有疏肝解郁、益氣健脾之功。曹峰等[21]動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高劑量柴胡可明顯提高胃竇組織中MTL含量，增強(qiáng)胃腸動力。相關(guān)藥理研究發(fā)現(xiàn)，白芍可以降低胃腸VIP含量，促進(jìn)胃排空[22]；白術(shù)能修復(fù)胃腸黏膜損傷[23]；黨參具有抑制胃酸分泌、修復(fù)胃黏膜等作用[24]；陳皮可提高大鼠血清GAS水平，促進(jìn)胃平滑肌收縮和消化液分泌[25]；枳實(shí)提取物能增強(qiáng)胃動力和加速腸蠕動[26]；丹參水溶性成分能夠增加胃黏膜血流，保護(hù)黏膜屏障[27]；砂仁能抑制胃酸分泌，調(diào)節(jié)腸道菌群，加快胃腸蠕動[28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，柴術(shù)理胃飲各組大鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率均明顯高于模型組，柴術(shù)理胃飲中、高劑量組大鼠胃竇組織中SP、GAS、MTL蛋白表達(dá)量和柴術(shù)理胃飲各組SP mRNA表達(dá)量均明顯高于模型組，柴術(shù)理胃飲各組胃竇組織中VIP蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組，提示柴術(shù)理胃飲干預(yù)能增強(qiáng)肝郁脾虛型FD大鼠胃排空和小腸推進(jìn)功能，上調(diào)胃竇組織中SP、MTL、GAS表達(dá)，下調(diào)VIP表達(dá)。

綜上所述，疏肝健脾法可以促進(jìn)肝郁脾虛型FD大鼠胃腸蠕動，上調(diào)胃竇組織中SP、GAS、MTL表達(dá)和下調(diào)VIP表達(dá)可能是其改善胃腸動力障礙的重要機(jī)制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。