常規(guī)抗結(jié)核化療對(duì)腸道菌群的影響

張晨晨 余美玲 譚衛(wèi)國(guó) 巫株華 魏文靜

1廣東省結(jié)核病控制中心（廣州 510630）；2深圳市慢性病防治中心（廣東 深圳 518020）

結(jié)核病不僅威脅人類健康還給全球經(jīng)濟(jì)造成巨大負(fù)擔(dān)，2020年全球新發(fā)結(jié)核病患者987 萬，發(fā)病率127/10 萬，病死率15%［1］。針對(duì)藥物敏感型結(jié)核病患者，世界衛(wèi)生組織（WHO）推廣使用標(biāo)準(zhǔn)短程化療方案：利福平（RIF，R）、異煙肼（INH，H）、乙胺丁醇（EMB，E）和吡嗪酰胺（PZA，Z）聯(lián)合使用2 個(gè)月，然后繼續(xù)服用RIF 和INH 至少4 個(gè)月［2］。腸道菌群參與機(jī)體物質(zhì)代謝和免疫應(yīng)答反應(yīng)，成為目前研究的熱點(diǎn)之一［3-6］，且對(duì)維持呼吸系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，尤其是肺部的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用［7-8］，多種抗生素長(zhǎng)期聯(lián)合使用，可能會(huì)改變結(jié)核患者腸道菌群的多樣性和結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響治療結(jié)果。

與16s rDNA 高通量測(cè)序相比，宏基因組測(cè)序技術(shù)不僅檢測(cè)速度快、靈敏度高，還可對(duì)樣本中菌群多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性以及相互關(guān)系等進(jìn)行綜合全面分析［9］，本研究比較了健康人群、潛伏性結(jié)核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）者、HRZE 四聯(lián)抗生素抗結(jié)核化療期間不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)核患者腸道微生物群的變化，初步探索了結(jié)核分枝桿菌（Mtb）感染以及抗結(jié)核藥物強(qiáng)化治療對(duì)腸道菌群的影響，為抗結(jié)核藥物合理使用及改善腸道菌群提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象該研究為病例對(duì)照研究，依據(jù)《潛伏性結(jié)核感染管理指南》和《WS288-2017 肺結(jié)核診斷》，經(jīng)臨床、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢查方法篩選LTBI和結(jié)核病患者。選取2016年11月至2017年12月在深圳市慢性病防治中心進(jìn)行體檢的15 名健康者為Un組，其中女7例（46.67%），平均（34.80±10.35）歲。另選同一研究周期該中心確診的γ 干擾素釋放試驗(yàn)為陽(yáng)性的16 例LTBI 者為L(zhǎng)T 組，其中女5 例（31.25%），平均（38.00 ± 10.64）歲。17 例初診肺結(jié)核且未進(jìn)行治療的患者為T0 組，其中女4 例（23.53%），平均（35.76±12.61）歲。T0 組經(jīng)一線抗結(jié)核藥物聯(lián)合治療2 個(gè)月后記為T2 組（17 例）；T0 組經(jīng)6 個(gè)月治療且治愈后記為T6 組（17 例）；T0組經(jīng)6 個(gè)月治愈并完成2 個(gè)月隨訪者記為T8 組（7 例），其中因人口流動(dòng)等原因有10 例未完成隨訪。各研究隊(duì)列的性別和年齡比例差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：常住深圳人口，生活作息正常；不抽煙酗酒；無其他如心、肝、肺、腎功能障礙等重大疾病；無HIV 感染、急性惡性腫瘤和糖尿病史等；納入研究隊(duì)列前至少2 個(gè)月禁用微生態(tài)制劑和抗生素［10］。深圳市慢性病防治中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)已審核通過本研究方案，且所有研究對(duì)象均已簽署知情同意書。

1.2 糞便樣品采集及微生物DNA 提取用無菌采集管留取各研究對(duì)象的新鮮糞便樣本（樣本量＞1 g），低溫條件下迅速轉(zhuǎn)至實(shí)驗(yàn)室的-80 ℃超低溫冰箱，可長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?。樣品DNA 提取可采用糞便DNA 微型試劑盒（MP Biomedicals）。

1.3 宏基因組測(cè)序及信息分析流程將合格的DNA 樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行宏基因組測(cè)序，信息分析流程如下：（1）測(cè)序結(jié)果預(yù)處理：使用Readfq（V8）對(duì)Illumina HiSeq 測(cè)序平臺(tái)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，獲得后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)，如果樣品存在宿主污染，則采用Bowite2 軟件（version2.2.4）過濾掉可能來源于宿主的reads。（2）Metagenome 組裝：使用SOAP denovo軟件（V2.04）對(duì)有效數(shù)據(jù)組裝分析。（3）基因預(yù)測(cè)及豐度分析：采用MetaGeneMark 軟件進(jìn)行ORF（Open Reading Frame）預(yù)測(cè)及過濾，并用CD-HIT（V4.5.8）軟件去冗余，再用Bowite2 軟件獲得后續(xù)分析的gene catalogue（Unigenes）。（4）物種注釋：使用DIAMOND 軟件（v0.9.9.110）將Unigenes 從NCBI 的NR 數(shù)據(jù)庫(kù)（Version：2018-01-02）中抽提出的細(xì)菌、真菌、古生菌和病毒序列進(jìn)行比對(duì)，運(yùn)用LCA 算法進(jìn)行物種注釋。（5）常用功能數(shù)據(jù)庫(kù)注釋：將Unigenes 與功能數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)（Version 2018-01-01）、egg-NOG 數(shù)據(jù)庫(kù)（Version 4.5）、CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)（Version 201801）比對(duì)，選取豐度排名前34 的功能及它們?cè)诿總€(gè)樣品中的豐度信息繪制熱圖，并從功能差異層面進(jìn)行聚類。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用GraphPad Prism 7 軟件繪圖，SPSS 17.0 軟件分析數(shù)據(jù)，Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)用于比較分析各研究隊(duì)列非冗余基因數(shù)（number of non-redundant genes）和多樣性差異，當(dāng)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果概述本研究所得原始數(shù)據(jù)共計(jì)741 864.38 Mbp，平均數(shù)據(jù)量8 335.55 Mbp，質(zhì)控所得有效數(shù)據(jù)736 782.68 Mbp（有效率99.32%），平均數(shù)據(jù)量8 278.46 Mbp。樣品經(jīng)單獨(dú)及混合組裝，所得Scaftigs 共計(jì)10 561 556 134 bp，平均長(zhǎng)度2 218 bp。進(jìn)一步的，基因預(yù)測(cè)由MetaGeneMark 軟件完成，共得到12 877 969 個(gè)ORFs，平均每個(gè)樣品143 089 個(gè)ORFs；經(jīng)去冗余后，共獲得2 629 714個(gè)ORFs，總長(zhǎng)1 937.35 Mbp，平均長(zhǎng)度736.72 bp，GC含量47.04%，其中完整基因個(gè)數(shù)為421 096，占所有非冗余基因總數(shù)的16.01%。使用blastp 將非冗余基因集比對(duì)到MicroNR 庫(kù)，注釋到屬和門的比例分別為63.83%，87.22%。非冗余基因集的常用功能數(shù)據(jù)庫(kù)注釋可由DIAMOND 軟件分析完成（e-value 不大于10-5），比對(duì)到KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)、eggNOG 數(shù)據(jù)庫(kù)和CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)的ORFs 分別為1 752 149（66.63%）、1 714 019（65.18%）和84 677（3.22%）。

2.2 Mtb 感染對(duì)腸道菌群的影響

2.2.1 Mtb 感染后腸道菌群菌群多樣性變化從基因在各樣品中的豐度表出發(fā)，隨機(jī)從Un、LT 和T0 各研究隊(duì)列中分別抽取不同數(shù)目的樣品，將得到的不同樣品組合間的基因數(shù)目用于繪制Pan 基因稀釋曲線，見圖1A。與Un 組和LT 組相比，T0組腸道菌群中的非冗余基因數(shù)未發(fā)生顯著變化（均P＞0.05，圖1B）。利用Alpha 多樣性分析法對(duì)不同組別間菌群豐富度進(jìn)行分析，計(jì)算Shannon 指數(shù)，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)Un、LT 和T0 三組研究對(duì)象腸道菌群豐富度指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，圖1C），說明Mtb 感染未引起人腸道菌群豐富度的改變。Beta 多樣性反應(yīng)了各樣本間菌群的整體差異程度，兩樣本之間的距離越大表示兩者間的群落構(gòu)成差異程度越大，基于Bray-Curtis 距離指標(biāo)，本研究使用主坐標(biāo)分析法（principal co-ordinates analysis，PCoA）進(jìn)一步分析了Mtb 感染對(duì)各組腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性的影響，T0 組與Un 組在PC2 上存在顯著的菌群結(jié)構(gòu)差異（P=0.013 4，圖1D）。

圖1 Mtb 感染后腸道菌群多樣性變化Fig.1 Changes of gut microbiota diversity after Mtb infection

2.2.2 Mtb 感染后腸道菌群結(jié)構(gòu)組成本研究統(tǒng)計(jì)了Un、LT 和T0 組在屬水平上各微生物的相對(duì)豐度（圖1E），結(jié)果顯示，三組中物種豐度較高的屬有10 種，T0 組中梭菌屬（g__Clostridium）的相對(duì)豐度為4.28%，較Un組（8.09%）和LT組（6.80%）減少；LT 組和T0 組中巨單胞菌屬（g__Megamonas）的相對(duì)豐度分別為0.26%和0.16%，比Un 組（2.58%）明顯減少；LT 組中優(yōu)桿菌屬（g__Eubacterium）、普雷沃菌屬（g__Prevotella）和小類桿菌屬（g__Dialister）的相對(duì)豐度分別為6.27%、3.01%和2.60%，比Un組（3.98%、0.57%和0.09%）和T0 組（2.74%、0.39%和0.07%）增加；T0 組中韋永氏球菌屬（g__Veillonella）和擬桿菌屬（g__Bacteroides）的相對(duì)豐度分別為1.54%和8.28%，較Un 組（0.32%、3.32%）和LT 組（0.21%、3.07%）明顯增加。

2.3 常規(guī)抗結(jié)核化療對(duì)結(jié)核病患者腸道菌群影響

2.3.1 常規(guī)抗結(jié)核化療對(duì)結(jié)核病患者腸道菌群多樣性影響隨機(jī)從T0、T2、T6 和T8 各研究隊(duì)列中分別抽取不同數(shù)目的樣品，將得到不同樣品組合間的基因數(shù)目用于繪制Pan 基因稀釋曲線，如圖2A 所示。分別與T2 組、T6 組和T8 組進(jìn)行比較，T0 組患者腸道菌群中的非冗余基因數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，圖2B）。Alpha 多樣性分析發(fā)現(xiàn)，T0 組、T2 組和T6 組間的Shannon 指數(shù)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008 8，圖2C），說明結(jié)核病患者經(jīng)常規(guī)抗結(jié)核化療后，腸道內(nèi)微生物的豐富度明顯降低?；贐ray-Curtis 距離指標(biāo)，使用主坐標(biāo)分析法（PCoA）分析常規(guī)抗結(jié)核化療對(duì)結(jié)核病患者腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性的影響，見圖2D，T0 組與T6 組在PC1 上存在顯著的菌群結(jié)構(gòu)差異（P=0.002 1）。

2.3.2 常規(guī)抗結(jié)核化療對(duì)結(jié)核病患者腸道菌群結(jié)構(gòu)組成影響統(tǒng)計(jì)T0、T2、T6 和T8 組在屬水平上各微生物的相對(duì)豐度（圖2E），結(jié)果顯示，三組中物種豐度較高的屬有10 種，相對(duì)豐度最高的為擬桿菌屬（g__Bacteroides）；隨著常規(guī)抗結(jié)核化療時(shí)間延長(zhǎng)，韋永氏球菌屬（g__Veillonella）、小類桿菌屬（g__Dialister）和普雷沃菌屬（g__Prevotella）在T0組（1.54%，0.07%，0.39%）、T2 組（3.88%，2.46%，1.37%）、T6（6.89%，2.91%，1.72%）組和T8組（7.79%，3.24%，2.65%）中的相對(duì)豐度逐漸增加；梭菌屬（g__Clostridium）和糞桿菌屬（g__Faecalibacterium）在T0 組（4.28%，6.10%）、T2 組（3.07%，8.47%）、T6組（3.00%，4.25%）和T8 組（2.21%，1.41%）中的相對(duì)豐度逐漸減少。

圖2 常規(guī)抗結(jié)核化療對(duì)結(jié)核病患者腸道菌群多樣性影響Fig.2 Effects of conventional anti-tuberculosis chemotherapy on gut microbiota diversity of tuberculosis patients

2.4 差異菌群分析在屬水平上，選取Un、LT、T0、T2、T6 和T8 組樣本中相對(duì)豐度排名前35 位的物種進(jìn)行分析，用熱圖進(jìn)行可視化展示尋找變化差異較大的菌種，并從物種層面進(jìn)行聚類，從而找出各組中聚類較多的物種（圖3）。T0 組中的Erysipelatoclostridium和解黃酮菌屬（Flavonifractor）與Un 組相比，顯著增加；而梭菌屬（Clostridium）和嗜血桿菌屬（Haemophilus）較Un 組則顯著減少。T8組中支原體屬（Mycoplasma）、優(yōu)桿菌屬（Eubacterium）、Dorea、扣林氏菌屬（Collinsella）、顫桿菌屬（Oscillibacter）、芽殖菌屬（Gemmiger）和糞桿菌屬（Faecalibacterium）較T0 組中顯著減少。為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)高維度生物標(biāo)識(shí)，通過線性判別分析效應(yīng)量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）展示了各組在不同分類水平上有顯著性差異的物種（圖4），柱狀圖的長(zhǎng)度（即LDA SCORE，默認(rèn)設(shè)置為4.0）代表了差異物種的影響大小。

圖3 屬水平上差異物種的熱圖Fig.3 Heat map of different species at the genus level

圖4 LDA 值分布柱狀圖Fig.4 Bar chart of LDA score distribution

2.5 基于物種豐度的降維分析用無度量多維標(biāo)定法（NMDS，Non-Metric Multi-Dimensional Scaling）分析Un、LT、T0、T2、T6 和T8 組樣本的組內(nèi)或組間差異，圖中各點(diǎn)之間的相互距離表示不同樣本間的差異大小。見圖5，Stress=0.132，表明NMDS 分析是可信的，在MDS1 上，各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明各組樣本的物種組成無明顯變化；而MDS2 上，T6 組與Un、LT、T0 和T2 組相比，菌落組成差異較大（均P＜0.05）。

圖5 屬水平上的NMDS 圖Fig.5 NMDS diagram at the genus level

2.6 基因功能注釋分析見圖6，與T0 組相比，結(jié)核病患者經(jīng)常規(guī)抗結(jié)核化療后，腸道內(nèi)微生物群中部分功能途徑發(fā)生變化，其中最顯著的變化是抗結(jié)核治療過程中輔助因子和維生素代謝（Cofactor and vitamin metabolism）、脂多糖代謝（Lipopolysaccharide metabolism）、乙醛酸和二羧酸代謝（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、原核生物的碳固定途徑（Carbon fixation pathways in prokaryotes）和檸檬酸循環(huán)（citrate cycle）功能顯著升高。

圖6 功能豐度聚類熱圖Fig.6 Clustering heat map of functional abundance

3 討論

腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，通過腸-肺軸降低肺部對(duì)外來病原體的清除能力，所以腸道菌群的穩(wěn)態(tài)對(duì)肺部健康起著重要作用［11］。為有效預(yù)防和治療結(jié)核病提供理論基礎(chǔ)，本研究選取了結(jié)核分枝桿菌感染及抗結(jié)核化療不同階段的患者樣本，通過宏基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病患者與健康人群、LTBI 者相比，腸道菌群中非冗余基因數(shù)和Alpha 多樣性均無明顯變化，而菌群結(jié)構(gòu)組成則存在較大差異。結(jié)核病患者腸道中梭菌屬的相對(duì)豐度降低，而韋永氏球菌屬和擬桿菌屬的相對(duì)豐度則明顯增加。近年來，有大量研究［12-14］結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌侵入機(jī)體后導(dǎo)致其腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。OSEI 等［15］的研究顯示，結(jié)核分枝桿菌侵染小鼠導(dǎo)致其腸道內(nèi)厚壁菌門和梭菌目的數(shù)量明顯減低；相類似的，結(jié)核分枝桿菌侵入人類和恒河猴后，未明顯改變其腸道中微生物數(shù)量、豐富度和多樣性，但卻導(dǎo)致其腸道中脆弱類桿菌（Bacteroides frafilis）等類桿菌的數(shù)量明顯增加，而厚壁菌門和梭菌目的數(shù)量明顯降低［16］，這與本文的研究結(jié)果相一致。

與初診結(jié)核病且未進(jìn)行治療的肺結(jié)核患者相比，常規(guī)抗結(jié)核化療后結(jié)核病患者腸道菌群中的非冗余基因數(shù)、Alpha 多樣性和菌群結(jié)構(gòu)都出現(xiàn)顯著性差異。近年來，細(xì)菌16S rDNA 測(cè)序和宏基因組測(cè)序技術(shù)普遍應(yīng)用于人體腸道菌群結(jié)構(gòu)及功能改變的研究中，并獲得了大量的數(shù)據(jù)［17］。HU 等［16］發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌侵入機(jī)體會(huì)略微降低其腸道微生物多樣性，并未對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著變化，但經(jīng)常規(guī)抗結(jié)核化療后其菌群多樣性和結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，其中擬桿菌屬相對(duì)豐度升高，而糞桿菌屬和活潑瘤胃球菌的相對(duì)豐度則明顯降低，這與本文的研究結(jié)果相似。而WIPPERMAN 等［18］對(duì)正在進(jìn)行常規(guī)抗結(jié)核化療和已經(jīng)治愈的結(jié)核病患者進(jìn)行對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，兩組患者的腸道菌群多樣性改變并不明顯，但在隨訪的1～2年內(nèi)其菌群結(jié)構(gòu)則存在明顯改變。不同的研究設(shè)計(jì)，受到地域、生活習(xí)慣等復(fù)雜外源性因素和遺傳背景影響［19］，所得結(jié)論難以統(tǒng)一，但基本可以確定抗結(jié)核化療可導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，且可持續(xù)至停藥后較長(zhǎng)時(shí)間。

抗結(jié)核藥物雖對(duì)結(jié)核病治療有明顯療效，但對(duì)腸道的物質(zhì)代謝卻造成了嚴(yán)重影響。MAJI 等［20］的研究表明，肺結(jié)核患者進(jìn)行常規(guī)抗結(jié)核化療后，其腸道微生物中與代謝相關(guān)的功能基因出現(xiàn)改變，其中與氨基酸及輔酶合成和維生素代謝相關(guān)基因降低，丙酸鹽和丁酸鹽代謝通路基因升高，致病性相關(guān)基因升高。另有研究［18］表明，因腸道菌群結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致其物質(zhì)代謝也發(fā)生相應(yīng)改變，如膽汁酸合成量降低，而脂肪酸氧化及維生素合成升高等。不同的研究［21］中，腸道菌群功能變化有差異，這可能與樣本量的多少、腸道菌群的復(fù)雜程度、測(cè)序及分析方法等多種因素有關(guān)。本研究通過功能注釋，發(fā)現(xiàn)抗結(jié)核化療過程中輔助因子和維生素代謝及脂多糖代謝功能顯著升高。

綜上所述，與機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌相比，抗結(jié)核化療造成了腸道菌群多樣性、結(jié)構(gòu)組成和代謝功能等多方面的改變。了解肺結(jié)核患者腸道微生物改變對(duì)機(jī)體免疫調(diào)控和開發(fā)新的分子標(biāo)志物都具有推動(dòng)作用；另外，未來在抗結(jié)核化療過程中，重建患者的腸道微生物群有望提高結(jié)核病的治療效果。本研究對(duì)同一結(jié)核病患者的不同抗結(jié)核化療階段進(jìn)行了追蹤隨訪，研究結(jié)果有較強(qiáng)的參考價(jià)值，但每組納入的研究對(duì)象數(shù)量相對(duì)較少，后續(xù)還需擴(kuò)大各研究隊(duì)列的樣本量、優(yōu)化隨訪方法并延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，進(jìn)一步深入的探索結(jié)核分枝桿菌感染及抗結(jié)核化療對(duì)腸道菌群的影響。