米櫧雄花發(fā)育相關的轉錄組和MADS-box家族基因表達特性分析

連 輝， 江淑珍，b， 熊遠芳，b， 沈 軍， 陳世品，①

(福建農林大學： a. 林學院， b. 園林學院 蘭科植物保護與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室， 福建 福州 350002)

在被子植物中，花是重要的生殖器官，也是進化過程中最具多樣性的結構[1]。同一個體(雌雄同株)或不同個體(雌雄異株)的單性雄花和雌花可促進異花授粉和基因交流，從而減少近親繁殖[2]。殼斗科(Fagaceae)含900多種，是重要的經濟資源，對森林生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)平衡有重要作用[3]。單性花是殼斗科植物的主要繁殖策略[4]。在殼斗科植物中，不同屬植物有著不同類型花序，如栗屬(CastaneaMill.)和錐屬(CastanopsisSpach)植物，前者具有雄性和兩性的柔荑花序，后者具有雄性和雌性的花序[4]。在栗屬植物中，板栗(CastaneamollissimaBlume)雌花中有12枚發(fā)育不完全的退化雄蕊，具有短的花絲和可見的花藥[5]。在錐栗〔Castaneahenryi(Skan) Rehd. et Wils.〕雌花中也存在退化雄蕊，在雌蕊原基的發(fā)育過程中雄蕊原基也發(fā)育，隨著雌蕊原基的分化完成雄蕊停止發(fā)育[6]。而在其他殼斗科種類的研究中，單性花由花分生組織產生，不能同時形成雌性和雄性的性器官原基[4]。因此，在殼斗科植物中，栗屬植物由于雄蕊停止生長而形成單性花，而同科其他屬種類的單性花不存在雌蕊或雄蕊敗育的現(xiàn)象，花發(fā)育起始階段就是單性的。在這些花中，性別決定基因通過控制花分生組織的發(fā)生和花器官的形成來調控性別分化[7]。目前，雌雄同株植物的花器官發(fā)育已被廣泛研究，在大多數(shù)情況下，花器官分化主要由MADS-box轉錄因子控制[8]。

米櫧〔Castanopsiscarlesii(Hemsl.) Hayata〕為殼斗科錐屬植物，廣泛分布于中亞熱帶海拔1 300 m以下的山地丘陵，為亞熱帶常綠闊葉林頂級群落之一[9]。米櫧具有2種類型花序：雄性柔荑花序在當年生的葉軸上發(fā)育，雌花序在枝稍附近發(fā)育。目前，在米櫧的雄花中尚未發(fā)現(xiàn)雌蕊敗育的跡象，表明米櫧雄花在花發(fā)育的起始階段就是單性的。在殼斗科植物中，花發(fā)育起始階段就是單性的現(xiàn)象較為普遍，如歐洲栓皮櫟(QuercussuberLinn.)[10]。然而，關于殼斗科植物從起始階段就是單性的雌、雄花發(fā)育機制的研究還不夠深入。本文基于轉錄組測序技術，對米櫧雄花的花芽期、半開期和盛花期3個時期進行轉錄組分析，對差異表達unigenes進行功能注釋。通過系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定出米櫧MADS-box家族基因，并對其在不同發(fā)育階段雄花的表達量進行分析。以期進一步認識MADS-box家族基因在米櫧雄花發(fā)育中的作用，為深入探究殼斗科植物單性花發(fā)育的分子機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試米櫧雄花來自于福建省福州市鼓山風景區(qū)(東經119°23′04″、北緯26°03′13″，海拔402 m)米櫧野生群落。樹種鑒定參照《中國植物志》[11]和《福建植物志》[12]。于2019年3月至5月，持續(xù)觀察米櫧雄花發(fā)育時期，分別在米櫧雄花的花芽期(花被片和雄蕊均未分化，F(xiàn)1期)、半開期(花被片和雄蕊分化完成，花被片微微張開，F(xiàn)2期)及盛花期(花被片張開并開始散粉，F(xiàn)3期)采集雄花花序，每個時期分別從3株植株上采集，即為3個生物學重復，共采集9個樣品。取樣后立即用液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)轉錄組測序分析。

1.2 方法

1.2.1 轉錄組測序與組裝 使用PureLinkTMPlant RNA試劑盒(美國Invitrogen公司)分別提取米櫧3個時期9個樣品的總RNA，再使用RNase-FreeDNase (美國Promega公司)去除DNA污染。采用質量體積分數(shù)1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，使用NanoDrop 1000超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)測定總RNA的濃度和純度。使用寡聚體(dT)貼附磁珠對總RNA進行純化，將純化后的總RNA用片段緩沖液破碎成小塊，利用隨機的六聚體引物反轉錄產生第1鏈cDNA，接著合成第2鏈cDNA。雙鏈DNA末端補平，5′端磷酸化，3′端進行接頭。使用PCR擴增雙鏈cDNA片段，用AMPure XP磁珠(美國Thermo Fisher Scientific公司)純化擴增產物，純化后的雙鏈PCR產物經熱變性，溶解于EB溶液中，經安捷倫2100生物分析儀(美國Agilent公司)質量控制驗證后，溶解于EB溶液中的雙鏈PCR產物經95 ℃熱變性成單鏈，經寡核苷酸序列循環(huán)，最終得到單鏈環(huán)狀DNA作為文庫。采用第二代測序技術，并基于Illumina HiSeq測序平臺，對這些文庫進行雙末端測序。使用Trinity軟件[13]進行轉錄組從頭組裝，為確保RNA測序數(shù)據的準確性和可靠性，從raw reads中剔除低質量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的reads，僅對剩下的高質量測序數(shù)據(clean reads)進行統(tǒng)計分析。

1.2.2 轉錄組差異表達unigenes注釋 采用FPKM值表示轉錄組差異表達unigenes的表達豐度。采用Benjamini-Hochberg校正法對原有假設檢驗得到的P值進行校正，最終采用FDR(錯誤發(fā)現(xiàn)率)作為差異表達unigenes篩選的關鍵指標。利用DESeq軟件，以FDR<0.05、FC(差異倍數(shù))≥2作為差異表達unigenes的篩選標準，差異表達unigenes的功能注釋信息通過KEGG數(shù)據庫(http：∥www.genome.jp/kegg/)和GO數(shù)據庫(http：∥www. geneontology.org/)獲得。使用BLAST軟件將差異表達unigenes序列與GO數(shù)據庫比對，進行注釋，在獲得每個差異表達unigene的GO注釋后，使用WEGO軟件(http：∥wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl)對所有差異表達unigenes進行GO功能分類統(tǒng)計，通過KEGG數(shù)據庫的注釋信息得到基因的path-way注釋。

1.2.3 MADS-box家族基因鑒定與表達量分析 在TAIR在線數(shù)據庫(https：∥www.arabidopsis.org/index.jsp)下載擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕MADS-box家族蛋白序列。以擬南芥MADS-box家庭蛋白序列作為索引在米櫧基因組中進行本地BLASTp檢索。將獲得的候選序列提交到NCBI-CDD網站(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)和HMMER網站(https：∥www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmsearch)，根據Pfam(PF00319)在米櫧基因組數(shù)據庫中篩選出具有完整保守結構域的成員作為米櫧MADS-box家族基因。由于米櫧type-Ⅰ型MADS-box家族基因在花發(fā)育過程中幾乎不表達，且該家族基因在花發(fā)育過程中調控作用的研究較少，因此，未開展該家族基因的系統(tǒng)進化樹及表達量分析。采用MEGA 7.0軟件對米櫧和擬南芥的type-Ⅱ型MADS-box家族基因的蛋白序列進行多序列比對后，采用鄰接法(neighbor-joining method)構建系統(tǒng)進化樹，對建成的系統(tǒng)進化樹進行自展法系數(shù)(bootstrap)校正，設置1 000次重復檢驗，最后優(yōu)化進化樹。從轉錄組數(shù)據中獲取米櫧雄花3個時期MADS-box家族基因的表達豐度值(FPKM)，通過log2(FPKM+1)計算表達量，并使用TBtools軟件中的HeatMap程序繪制基因表達量熱圖。

2 結果和分析

2.1 測序質量分析和差異表達unigenes篩選

2.1.1 測序質量分析 測序結果(表1)顯示：米櫧雄花3個時期樣品的clean reads為628 800 000～643 700 000，高質量總堿基量為6.29～6.44 Gb，Q30堿基百分比均不小于90.67%，GC含量為45.09%～45.39%。

2.1.2 差異表達unigenes篩選 對花芽期、半開期和盛花期3個時期米櫧雄花的轉錄組結果進行比對分析，結果(表2)顯示：花芽期與半開期間有15 086個差異表達unigenes，其中，與花芽期相比，半開期表達量上調的unigenes有5 283個，表達量下調的unigenes有9 803個。半開期與盛花期間有6 770個差異表達unigenes，其中，與半開期相比，盛花期表達量上調的unigenes有3 536個，表達量下調的unigenes有3 234個?；ㄑ科谂c盛花期間有16 150個差異表達unigenes，其中，與花芽期相比，盛花期表達量上調的unigenes有6 588個，表達量下調的unigenes有9 562個。

表1 米櫧雄花轉錄組數(shù)據統(tǒng)計

表2 不同時期間米櫧雄花轉錄組差異表達unigenes數(shù)

2.2 功能注釋分析

2.2.1 GO功能注釋分析 在GO數(shù)據庫對米櫧雄花的花芽期與半開期、半開期與盛花期以及花芽期與盛花期3組的差異表達unigenes進行比對和功能注釋，結果見圖1。

由圖1可以看出：米櫧雄花的花芽期與半開期、半開期與盛花期以及花芽期與盛花期3組分別有31 888、13 228和35 203個差異表達unigenes注釋在分子功能、細胞組分和生物過程3大類47個亞類中。在分子功能的13個亞類中，3組差異表達unigenes主要注釋在催化活性和連接2個亞類中，其中，注釋在催化活性亞類的差異表達unigenes分別有4 411、2 001和4 876個；注釋在連接亞類的差異表達unigenes分別有4 437、1 911和4 896個。在細胞組分的14個亞類中，3組差異表達unigenes主要注釋在膜、膜要素、細胞和細胞器4個亞類中，其中，注釋在膜亞類的差異表達unigenes分別有3 215、1 493和3 464個；注釋在膜要素亞類的差異表達unigenes分別有2 997、1 399和3 206個；注釋在細胞亞類的差異表達unigenes分別有2 594、997和2 915個；注釋在細胞器亞類的差異表達unigenes分別有1 862、674和2 111個。在生物過程的20個亞類中，3組的差異表達unigenes主要注釋在細胞過程、代謝過程、生物調節(jié)和應激反應4個亞類中，其中，注釋在細胞過程亞類的差異表達unigenes分別有2 738、983和3 071個；注釋在代謝過程亞類的差異表達unigenes分別有2 347、690和2 403個；注釋在生物調節(jié)亞類的差異表達unigenes分別有1 033、398和1 121個；注釋在應激反應亞類的差異表達unigenes分別有981、393和1 037個。

2.2.2 KEGG代謝通路分析 在KEGG數(shù)據庫中對米櫧雄花的花芽期與半開期、半開期與盛花期以及花芽期與盛花期3組的差異表達unigenes進行比對和功能注釋，結果見圖2。

由圖2可以看出：花芽期與半開期、半開期與盛花期以及花芽期與盛花期3組分別有10 826、5 241和11 896個差異表達unigenes注釋在KEGG代謝通路，共6大類21亞類，且主要注釋在代謝和遺傳信息處理2大類中。3組注釋在代謝相關通路的差異表達unigenes最多，分別有6 580、3 414和7 130個，包括全局及概要圖、碳水化合物代謝、其他次生代謝產物的生物合成、氨基酸代謝和脂質代謝等11個亞類，其中，注釋在全局及概要圖亞類的差異表達unigenes最多，分別有2 473、1 266和2 673個。3組注釋在遺傳信息處理相關通路的差異表達unigenes分別有2 060、843和2 379個，包括翻譯、轉錄、復制和修復以及折疊、分類和降解4個亞類。3組注釋在環(huán)境信息處理相關通路的差異表達unigenes分別有846、384和943個，包括信號轉錄和膜運輸2個亞類。在生物系統(tǒng)相關通路中，3組分別有846、384和943個差異表達unigenes注釋在環(huán)境適應性亞類中。在細胞過程相關通路中，3組分別有372、171和443個差異表達unigenes注釋在運輸和分解代謝亞類中。在人類疾病相關通路中，3組共有32、8和40個差異表達unigenes注釋在內分泌和代謝性疾病以及耐藥性：抗菌2個亞類中。

2.3 type-Ⅱ型MADS-box家族基因鑒定及表達量分析

利用MEGA 7.0對米櫧和擬南芥type-Ⅱ型MADS-box蛋白構建系統(tǒng)進化樹(圖3)。結果顯示：米櫧type-Ⅱ型MADS-box家族基因有53個成員，可分為13類：C/D類(6個成員)、ANR1類(4個成員)、AGL15類(4個成員)、AP3/PI類(1個成員)、Bs類(1個成員)、MIKC*類(7個成員)、SVP類(14個成員)、FLC類(2個成員)、SOC1類(3個成員)、AP1/FUL類(3個成員)、AGL12類(2個成員)、AGL6類(2個成員)和SEP類(4個成員)。

： 花芽期與半開期的差異表達unigenes的代謝通路Metabolic pathway of differentially expressed unigenes between flower bud stage and half flowering stage； ： 半開期與盛花期的差異表達unigenes的代謝通路Metabolic pathway of differentially expressed unigenes between half flowering stage and flowering stage； ： 花芽期與盛花期的差異表達unigenes的代謝通路Metabolic pathway of differentially expressed unigenes between flower bud stage and flowering stage.

基于花芽期、半開期和盛花期3個時期米櫧雄花的轉錄組數(shù)據對米櫧type-Ⅱ型MADS-box家族基因進行表達分析，發(fā)現(xiàn)其在雄花不同發(fā)育階段的表達具有差異性。3個時期米櫧雄花type-Ⅱ型MADS-box家族基因的表達量熱圖(圖4)顯示：在C/D類同源基因中，SHP基因(Maker00006492)和AG基因(Maker00069044)表達趨勢類似，在花芽期表達量較低，半開期和盛花期表達量升高；其余4個C/D類同源基因在雄花發(fā)育過程中幾乎不表達。在AP3/PI類同源基因中，AP3基因(Maker00011188)隨雄花發(fā)育表達量逐漸升高。在MIKC*類同源基因中， Maker00016147和Maker00054870在雄花發(fā)育過程中表達量較高，其余基因表達量較低或不表達；其中，Maker00016147在花芽期的表達量較低，在半開期的表達量升至最高，在盛花期的表達量降至半開期的一半；Maker00054870的表達趨勢類似，在半開期的表達量最高，在盛花期的表達量略下降。在AP1/FUL類同源基因中，Maker00031743和Maker00060929為AP1基因，Maker00031743在花芽期的表達量最高，在半開期的表達量降至最低，在盛花期的表達量較半開期升高；Maker00060929在花芽期、半開期和盛開期的表達量均較高，且?guī)缀鯖]有變化；FUL基因(Maker00039576)在花芽期和盛花期的表達量較高，但在半開期的表達量卻較低。在AGL6類同源基因中，AG6基因(Maker00067599)在雄花發(fā)育3個時期的表達量均較高。在SEP類同源基因中， Maker00050389、Maker00039517、Maker00060937和Maker00031685均在雄花發(fā)育過程中高表達；其中，SEP3基因(Maker00050389)的表達量最高，且在雄花發(fā)育3個時期的波動不大；Maker00039517和Maker00031685的表達趨勢相似，在花芽期的表達量較高，在半開期和盛花期的表達量逐漸升高；Maker00060937在花芽期的表達量較低，在半開期和盛花期的表達量逐漸升高。其余6類同源基因在米櫧雄花發(fā)育過程中幾乎不表達。

： 米櫧Castanopsis carlesii (Hemsl.) Hayata； ： 擬南芥Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.

F1： 花芽期Flower bud stage； F2： 半開期Half flowering stage； F3： 盛花期Flowering stage.

3 討 論

功能注釋結果表明：通過與GO數(shù)據庫比對，花芽期與半開期、半開期與盛花期以及花芽期與盛花期3組差異表達unigenes注釋在分子功能、細胞組分和生物過程的47個亞類中。在分子功能中，注釋在催化活性和連接亞類的差異表達unigenes最多，可見催化酶在米櫧雄花發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用；在細胞組分中，差異表達unigenes主要注釋在膜、膜要素、細胞和細胞器4個亞類中，在雄花發(fā)育過程中，花粉粒的成熟伴隨著新的細胞膜、細胞壁以及細胞器的生成，推測差異表達unigenes與花粉粒的成熟相關。通過KEGG數(shù)據庫比對，3組差異表達unigenes主要注釋在代謝和遺傳信息處理2大類中。注釋在代謝相關通路的差異表達unigenes最多，主要注釋在全局及概要圖、碳水化合物代謝和其他次生代謝產物的生物合成3個亞類中。相關研究表明：植物成花過程中需要消耗大量的碳水化合物和蛋白質等[14]，因此，注釋在代謝相關通路的差異表達unigenes對米櫧雄花成花有重要作用。此外，KEGG代謝通路注釋結果還顯示：注釋在遺傳信息處理相關通路的轉錄亞類和環(huán)境信息處理相關通路的信號轉錄亞類的差異表達unigenes較多，表明轉錄因子對米櫧雄花的基因表達有重要作用。

相關研究表明：轉錄因子家族在植物的生殖過程中發(fā)揮著重要作用，其中MADS-box家族是控制花器官形成的重要轉錄因子家族[15]。相關研究根據系統(tǒng)發(fā)育學和基因結構的特點，將MADS-box家族分為type-Ⅰ型和type-Ⅱ型[16，17]。通過對米櫧雄花的花芽期、半開期和盛花期的基因表達量分析，發(fā)現(xiàn)type-Ⅰ型MADS-box家族基因在米櫧成花過程中幾乎不表達，印證了大多數(shù)植物中以type-Ⅱ型MADS-box家族基因為主的推斷[18]。通過對米櫧type-Ⅱ型MADS-box家族基因進行鑒定及表達量分析，發(fā)現(xiàn)其在米櫧雄花不同發(fā)育階段的表達具有差異性，其中，鑒定到AP1/FUL類同源基因3個，AP1基因2個，其中1個在花芽期和盛花期表達量較高，另外1個在3個時期的表達量均較高；FUL基因1個，在花芽期和盛花期表達量較高。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UL基因在花序分生組織中表達，對花分生組織的起始分化有重要作用，可能參與調控開花時間，而AP1基因在花分生組織和萼片的形成中有重要作用[19]。因此，米櫧FUL基因在花芽期和盛花期表達量較高，推測對米櫧雄花花序分化和開花起重要作用，AP1基因在半開期和盛花期高表達，調控花被片的形成。鑒定到AP3/PI類同源基因1個，為AP3基因，表達量隨著雄花的發(fā)育逐漸升高。AP3/PI類基因通常在花瓣和雄蕊中表達，對控制花瓣和雄蕊的形成有重要作用[19]。因此，在米櫧雄花發(fā)育過程中，AP3/PI類同源基因對雄蕊和花被片的發(fā)育有重要作用。鑒定到C/D類同源基因6個，其中米櫧AG基因表達量隨著雄花的發(fā)育逐漸升高，主要在雄花發(fā)育后期表達。在歐洲栗(CastaneasativaMill.)和歐洲栓皮櫟的研究中，AG基因主要在雄花發(fā)育后期表達，與花粉發(fā)育密切相關[4，10]。在米櫧雄花發(fā)育過程中，AG基因的表達趨勢與歐洲栗和歐洲栓皮櫟相似，因此，AG類同源基因可能參與調控米櫧的花粉發(fā)育。米櫧SHP基因在時間上的表達模式與AG基因相似，主要在雄花發(fā)育后期表達。在歐洲栗和歐洲栓皮櫟的研究中，SHP基因在雄花發(fā)育后期高表達，同時還在雌花中表達，表明殼斗科的SHP類同源基因可能是功能性的C類基因[4，10]。而STK基因主要參與調控胚珠的發(fā)育[20]，在米櫧雄花發(fā)育的3個時期均未表達，印證了米櫧雄花中不存在雌蕊的結構。鑒定到SEP類同源基因4個，在米櫧雄花發(fā)育的3個時期有較高表達，表明SEP類同源基因在米櫧雄花發(fā)育過程中起協(xié)同作用。

綜上所述，在米櫧雄花發(fā)育過程中，AP1/FUL類、AP3/PI類、C/D類和SEP類同源基因有較高的表達，且在不同時期的表達具有差異性，而這些基因在其他物種中已被證實參與調控各個花器官的發(fā)育。米櫧是雌雄同株的單性花植物，AP3/PI類和C/D類同源基因對雄蕊和雌蕊的形成有著重要的作用。因此，下一步可重點分析MADS-box家族基因分別在米櫧雄花和雌花不同花器官中的表達情況，以期闡明這些基因在米櫧性別分化和花器官發(fā)育中的功能和作用機制。