根癌農(nóng)桿菌介導火龍果潰瘍病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子篩選

王偉偉，安馨媛，陳俊菁

（海南大學 林學院/海南省熱帶特色花木資源生物學重點實驗室，海口 570228）

火龍果又名紅龍果，屬仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus），是極具發(fā)展前景的熱帶和亞熱帶水果[1]。火龍果因具有較高的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值，集蔬菜、水果、花卉和保健于一體，被譽為“21世紀保健食品和果品珍品”， 受到人們的青睞，具有廣闊的國際、國內(nèi)市場[2]。火龍果20世紀80年代才引入我國臺灣，雖然在我國栽培歷史較短，但發(fā)展迅速，目前主要在臺灣、海南、廣西、廣東、福建、貴州等省區(qū)種植。潰瘍病是近年來火龍果種植園發(fā)生的嚴重真菌病害之一，發(fā)病率高達 60%[3?7]。潰瘍病造成火龍果枝條腐爛，果實變黑，失去食用價值，有些果園甚至顆粒無收。該病害在夏秋季高溫高濕的氣候條件下發(fā)病尤為嚴重，尤其臺風過后更容易大面積暴發(fā)，這也是該病在海南地區(qū)盛行的主要原因之一。該病害由新暗色柱節(jié)孢（Neoscytalidium dimidiatum(Penz.) Crous &Slippers）侵染引起的[4?11]，開展病原菌的致病機理研究可以為病害防治所需新藥以及抗性種苗的研發(fā)提供相關(guān)的理論依據(jù)，從而達到對病害長期、有效的防控。病原菌基因功能缺失突變體的構(gòu)建是研究病原菌致病機理的有效手段，這一方法的關(guān)鍵技術(shù)是建立遺傳轉(zhuǎn)化體系。農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化（Agrobaeterium tumefaciens-Meidated Transformation）可快速構(gòu)建真菌 T-DNA（transfer DNA）隨機插入突變體，因其操作簡單，可轉(zhuǎn)化完整的細胞，比如分生孢子、菌絲、子實體等，免去了制備原生質(zhì)體的繁瑣，廣泛應(yīng)用于多種真菌[12]。目前已有100多種真菌使用該方法進行成功轉(zhuǎn)化[13]，比如玉米大斑病菌[14]、稻瘟病菌[15]、尖鐮孢菌[16]、玉米灰斑病菌[17]等。本研究擬建立根癌農(nóng)桿菌介導的火龍果潰瘍病菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為火龍果潰瘍病菌致病機理的研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料火龍果潰瘍病菌野生型菌株由本實驗室分離、鑒定和保存。農(nóng)桿菌菌株EHA105由海南大學熱帶農(nóng)林學院陳銀華教授饋贈。載體pXEH8279 (KanaR, HygBR)由吉林大學植物科學學院潘洪玉教授饋贈。實驗用培養(yǎng)基IM、IAM[12]。

1.2 火龍果潰瘍病菌對潮霉素（HygB）最低耐受濃度的確定將火龍果潰瘍病菌野生型菌株接種在PDA培養(yǎng)基上活化，待長至菌落直徑約5 cm時，用5 mm打孔器在菌落邊緣打孔取菌餅，并將菌餅轉(zhuǎn)接在加有不同濃度 HygB（0、25、50、100、150 μg·mL?1）的 PDA 培養(yǎng)基上，置于 25 ℃ 培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。每處理3重復，培養(yǎng)7 d后，觀察菌落生長情況，確定最佳的HygB篩選濃度。

1.3 遺傳轉(zhuǎn)化

1.3.1 農(nóng)桿菌的準備將攜帶有質(zhì)粒 pXEH8279的農(nóng)桿菌菌株EHA105在盧里亞?貝爾塔尼平板培養(yǎng)基 (LB)[ 利福平 (rif) 10 μg·mL?1,卡那霉素(Kana) 50 μg·mL?1]上劃線，置于 28 ℃ 培養(yǎng)至長出單菌落。挑取單菌落轉(zhuǎn)移至新的LB平板培養(yǎng)基（rif 10 μg·mL?1, Kana 50 μg·mL?1）上劃線，28 ℃培養(yǎng)48 h后，用滅菌的藥匙刮取農(nóng)桿菌，使其分散在 IM 培養(yǎng)基內(nèi)，28 ℃，200 r·min?1，培養(yǎng) 4～6 h，使其OD600達到0.5，置于50 mL無菌管中備用。

1.3.2 火龍果潰瘍病菌分生孢子的準備將活化的火龍果潰瘍病菌野生型菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d后，吸取0.01%吐溫20于培養(yǎng)基上，用無菌棉棒將分生孢子輕輕洗下，然后用4層滅菌紗布過濾，制成分生孢子懸浮液。取適量分生孢子懸浮液于PD培養(yǎng)基中，調(diào)整分生孢子濃度至 5×105個·mL?1，避光放置在搖床上，轉(zhuǎn)速為150 r·min?1，室溫下萌發(fā) 24 h。

1.3.3 共培養(yǎng)誘導培養(yǎng)的農(nóng)桿菌與萌發(fā)的分生孢子懸浮液等體積混合后，于 25 ℃，80 r·min?1，搖培 20～30 min。吸取 100 μL 混合液，涂布在共培養(yǎng)培養(yǎng)基（IAM, Induced Agar Medium）上，置于 25 ℃黑暗培養(yǎng)。共培養(yǎng) 48 h后，在IAM上倒篩選培養(yǎng)基，置于25 ℃培養(yǎng)。篩選培養(yǎng)基即加有潮霉素（HygB，50 μg·mL?1）、頭孢霉素（Cef, 200 μg·mL?1）、氨芐青霉素（Amp, 200 μg·mL?1）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。培養(yǎng)5～6 d后即可見有單菌落長出。

1.4 不同因素對轉(zhuǎn)化效率的影響根據(jù)以上遺傳轉(zhuǎn)化方法，依次驗證以下因子對火龍果潰瘍病菌遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，包括農(nóng)桿菌濃度OD600（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8）、分生孢子萌發(fā)時間（0、6、12、24、36、48 h）以及共培養(yǎng)溫度（20、25、28、30、35 ℃），采用單因素試驗，每個處理設(shè)置3個重復。

1.5 轉(zhuǎn)化子的聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）鑒定隨機挑選8株轉(zhuǎn)化子以及野生型菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 d后，用無菌槍頭分別刮取培養(yǎng)基中的菌絲，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。分別向裝有菌絲的離心管加入液氮，并用無菌塑料研磨棒迅速將菌絲研磨成粉狀，利用 CTAB（Hexadecyl trimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨）法提取轉(zhuǎn)化子及野生型菌株基因組DNA。以HygB抗性基因片段為模板設(shè)計引物 hygF (5′-gaagaatctcgtgctttcag-3′)和 hygR(5′-gtacttctacacagccatcg-3′)，通過 PCR 方法驗證 TDNA片段是否插入，目標片段長度880 bp。PCR擴增程序：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 40 s，56 ℃退火 40 s，72 ℃ 延伸 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 延伸7 min。

1.6 轉(zhuǎn)化子篩選

1.6.1 轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)觀察及產(chǎn)孢能力比較將隨機選取的200株轉(zhuǎn)化子以及野生型菌株接種在PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃ 培養(yǎng) 4 d 后，用 5 mm 打孔器分別在菌落邊緣取菌餅，并將菌餅轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 7 d，觀察菌落形態(tài)特征并拍照后，收集分生孢子，計算每皿產(chǎn)生的分生孢子數(shù)量。每個處理設(shè)置3個重復。

1.6.2 轉(zhuǎn)化子致病力采用田間接種方法，篩選致病力降低的轉(zhuǎn)化子。具體操作如下：將轉(zhuǎn)化子及野生型菌株分別接種在PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 d 后，用 5 mm 打孔器分別取菌落邊緣菌餅；在海南大學儋州校區(qū)農(nóng)科基地火龍果種植園選取健康的火龍果植株，用無菌刀片在莖上劃出5 mm左右傷口，將菌餅轉(zhuǎn)移至傷口處，并用保鮮膜包裹以保持濕度[（28±2)℃，RH80%]。3 d后觀察發(fā)病情況并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 火龍果潰瘍病菌對HygB的最低耐受濃度當 HygB 濃度為 50 μg·mL?1時該菌完全不能生長（圖1），故選取該濃度為火龍果潰瘍病菌對HygB的最低耐受濃度，用于后續(xù)實驗中轉(zhuǎn)化子的篩選。

2.2 火龍果潰瘍病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立當農(nóng)桿菌濃度OD600為0.5時遺傳轉(zhuǎn)化效率最高，與其他處理差異顯著（圖2-A）；當分生孢子萌發(fā)時間為24 h時遺傳轉(zhuǎn)化效率最高，與萌發(fā)時間為36 h時差異不顯著，而與其他處理差異顯著（圖2-B），但分生孢子萌發(fā)36 h實驗周期較長，且菌絲萌發(fā)造成實驗操作難度加大，故選取分生孢子萌發(fā)24 h作為最優(yōu)；當共培養(yǎng)溫度為25 ℃時遺傳轉(zhuǎn)化效率最高，且與其他處理差異顯著（圖2-C）。通過以上研究，農(nóng)桿菌濃度OD600=0.5、分生孢子萌發(fā)時間24 h、共培養(yǎng)溫度25℃時遺傳轉(zhuǎn)化效率最高，達到833個轉(zhuǎn)化子/106個分生孢子。

2.3 轉(zhuǎn)化子的 PCR鑒定提取轉(zhuǎn)化子基因組 DNA，通過PCR的方法擴增T-DNA片段上HygB抗性基因，結(jié)果顯示，8株轉(zhuǎn)化子均能擴增出HygB抗性基因片段（880 bp），初步可以確定T-DNA成功插入以上轉(zhuǎn)化子基因組中（圖3）。

2.4 轉(zhuǎn)化子篩選結(jié)果野生型菌株氣生菌絲旺盛，直立，后期顏色為灰黑色；通過與野生型菌落形態(tài)比較，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子0-3-1和3-3-1菌落形態(tài)差異較大，氣生菌絲濃密，呈白色，且轉(zhuǎn)化子3-3-1不產(chǎn)生分生孢子；轉(zhuǎn)化子24-3-2氣生菌絲稀疏，顏色變淡（圖4-A）。轉(zhuǎn)化子與野生型菌株產(chǎn)孢能力比較，發(fā)現(xiàn)4株產(chǎn)孢量減少的菌株分別為3-1-2、3-1-3、3-2-3和 3-7-1，其中，3-1-3、3-2-3與野生型差異顯著（P＜0.05）， 3-1-2、3-7-1 與野生型差異極顯著（P＜0.01）；發(fā)現(xiàn)5株產(chǎn)孢量增加的菌株分別為3-6-2、3-4-1、3-4-2、3-3-1和 0-3-1，其中，0-3-1與野生型差異顯著（P＜0.05），其余4株與野生型差異極顯著（P＜0.01）（圖4-B）。通過接種實驗，發(fā)現(xiàn) 6 株致病力下降的菌株分別為0-3、3-3-1、3-6-1、3-7-1、24-2-1、24-3-2（圖4-C）。以上轉(zhuǎn)化子可用于后續(xù)實驗。

3 討 論

據(jù)文獻報道，影響根癌農(nóng)桿菌介導絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素有很多，比如根癌農(nóng)桿菌菌株的選擇、農(nóng)桿菌濃度、真菌分生孢子濃度、共培養(yǎng)時間及共培養(yǎng)溫度等[12]。有研究表明，不同根癌農(nóng)桿菌菌株對遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響很大，已報道的用于絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株有AGL-1、EHA105、LBA1100、LBA4404 等，本研究選用EHA105菌株，實驗證實可以成功轉(zhuǎn)化。乙酰丁香酮（As）是該體系能否轉(zhuǎn)化成功的決定性因素，根據(jù)文獻報道，多數(shù)絲狀真菌在As濃度為200 μmol·L?1時遺傳轉(zhuǎn)化效率最高[18]，本研究中 As選用該濃度。轉(zhuǎn)化受體的細胞濃度對遺傳轉(zhuǎn)化效率亦有影響，受體孢子濃度較高，轉(zhuǎn)化效率也較高，本研究中發(fā)現(xiàn)分生孢子濃度過高會導致真菌過量生長而無法挑出轉(zhuǎn)化子，設(shè)置分生孢子濃度為5×105可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。據(jù)文獻報道，共培養(yǎng)時間以48 h轉(zhuǎn)化效率最高[19]，共培養(yǎng)時間過長反而會導致遺傳轉(zhuǎn)化效率降低，本研究選取共培養(yǎng)48 h。

本實驗主要研究了農(nóng)桿菌濃度、分生孢子萌發(fā)時間及共培養(yǎng)溫度對遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。理論上，農(nóng)桿菌濃度越高，受體細胞被成功轉(zhuǎn)化的概率越高，遺傳轉(zhuǎn)化效率越高，然而事實上，當農(nóng)桿菌濃度過高時遺傳轉(zhuǎn)化效率反而降低，本研究中，當農(nóng)桿菌OD600為0.5時火龍果潰瘍病菌的遺傳轉(zhuǎn)化效率最高，高于0.5則遺傳轉(zhuǎn)化效率降低。有研究表明，未萌發(fā)的分生孢子作為受體不能夠成功轉(zhuǎn)化[14,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，當分生孢子萌發(fā) 24 h時遺傳轉(zhuǎn)化效率最高，證實分生孢子受體的形態(tài)對火龍果潰瘍病菌的遺傳轉(zhuǎn)化效率影響很大。研究者對20 ~37 ℃內(nèi)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率進行研究，發(fā)現(xiàn)22～25 ℃是最適的共培養(yǎng)溫度[21]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，25 ℃是火龍果潰瘍病菌遺傳轉(zhuǎn)化的最適共培養(yǎng)溫度。

通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化構(gòu)建病原真菌的T-DNA 隨機插入突變體庫，從中篩選致病力降低的突變體，并獲得T-DNA側(cè)翼序列，從而獲得致病相關(guān)基因，這是目前研究病原真菌致病機制的主要方法之一。本研究通過建立的根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得T-DNA插入轉(zhuǎn)化子，并從中篩選致病力降低的轉(zhuǎn)化子，這些轉(zhuǎn)化子可用于后續(xù)研究中，以獲得致病相關(guān)的基因，通過致病相關(guān)基因功能研究，以闡明火龍果潰瘍病菌的致病機理。