檳榔根腐病菌拮抗菌株的篩選與鑒定

劉雙龍，楊德潔，牛曉慶，楊福孫，覃偉權(quán)

（1.海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，海口 570228; 2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 椰子研究所/海南省院士創(chuàng)新平臺(tái)/海南省檳榔產(chǎn)業(yè)工程研究中心，海南文昌，571339）

檳榔(Areca catechuL.)屬于棕櫚科多年生常綠喬木，性喜高溫高濕[1]，是我國(guó)四大南藥之一，在我國(guó)海南、廣東、臺(tái)灣、云南均有種植[2]。隨著檳榔種植面積的逐年增加，病蟲(chóng)害頻發(fā)，檳榔根腐病為檳榔的典型根部病害，對(duì)檳榔的健康生長(zhǎng)具有較為嚴(yán)重的影響，李增平等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，海南省檳榔主產(chǎn)區(qū)萬(wàn)寧、陵水等地的部分黃化及枯死檳榔是由根腐病導(dǎo)致的。尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）是檳榔根腐病病原的1種病菌，常侵染檳榔根、莖基部，導(dǎo)致侵染部位壞死腐爛，從而導(dǎo)致檳榔的葉片變黃，整體長(zhǎng)勢(shì)變差；此侵染在高溫、高濕條件下極易發(fā)生[4]。有文獻(xiàn)表明，可可毛色二孢菌可感染桑樹(shù)根部引起桑樹(shù)根腐病[5]；奇異根串珠霉菌能侵染檳榔莖干，導(dǎo)致檳榔莖瀉血病[3]。目前對(duì)尖孢鐮刀菌、可可毛色二孢菌、奇異根串珠霉菌的防治多集中為化學(xué)藥劑的篩選。戴利銘等[6]通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了10種殺菌劑對(duì)病原菌的毒力，發(fā)現(xiàn)多菌靈對(duì)可可毛色二孢菌的防治效果最好。熊明國(guó)[7]采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定了6種藥劑對(duì)尖孢鐮刀菌的毒力，發(fā)現(xiàn)甲基硫菌靈對(duì)尖孢鐮刀菌的防治最好。余鳳玉等[8]采用生長(zhǎng)速率法和孢子萌發(fā)抑制法，測(cè)定了10種藥劑對(duì)奇異根串珠霉菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)對(duì)菌絲和分生孢子芽管生長(zhǎng)有較強(qiáng)抑制作用的是多菌靈、異菌脲和甲基硫菌靈。雖然化學(xué)防治具有見(jiàn)效快、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，但其也存在易使致病菌產(chǎn)生抗藥性，易使有益微生物數(shù)量驟減和減弱土壤自身的修復(fù)能力等問(wèn)題[9]，實(shí)施生物防治是解決這些問(wèn)題的首要選擇，對(duì)檳榔產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。關(guān)于尖孢鐮刀菌、可可毛色二孢菌、奇異根串珠霉菌等3種病原菌的生物防治，謝紅輝等[10]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）對(duì)可可毛色二孢菌的抑菌率達(dá)73.3%；牛曉慶等[11]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淺灰鏈霉菌（Streptomyces griseolus）對(duì)奇異根串珠霉菌有較強(qiáng)的抑制作用。王宇鵬等[12]篩選到1株貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis），并發(fā)現(xiàn)其對(duì)尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)的抑制作用。目前，關(guān)于尖孢鐮刀菌、可可毛色二孢菌、奇異根串珠霉菌等3種病原菌的拮抗菌株大多處于實(shí)驗(yàn)室階段，其中有效生防菌株匱乏。為了豐富檳榔根部尖孢鐮刀菌、可可毛色二孢菌、奇異根串珠霉菌等3種病原菌的生防菌資源，本研究通過(guò)對(duì)發(fā)病檳榔園的健康檳榔的根內(nèi)生細(xì)菌和根部土壤中的細(xì)菌（根部土細(xì)菌）進(jìn)行分離，采用平板對(duì)峙法進(jìn)行生防菌株的篩選，并測(cè)定生防菌液對(duì)尖孢鐮刀菌、可可毛色二孢菌、奇異根串珠霉菌等3種病原菌的抑制作用，同時(shí)驗(yàn)證其對(duì)發(fā)病植株的防治效果，最后對(duì)生防菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為檳榔根部病害生防菌劑的開(kāi)發(fā)提供菌種及防治方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料供試樣本采自海南發(fā)病檳榔園健康植株的根和根部土壤，每個(gè)樣品3次重復(fù)。并立即用聚乙烯無(wú)菌袋密封，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。供試檳榔根部病原菌Q-7-1可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）、F-2 尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）和TP-11奇異根串珠霉菌（Thielaviopsis paradoxa）由筆者所在的實(shí)驗(yàn)室分離保存。實(shí)驗(yàn)用檳榔苗“熱研1號(hào)”來(lái)自熱科院椰子研究所基地。

1.1.2 供試培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（LB）、牛肉膏酵母葡萄糖培養(yǎng)基（NYBD）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、豆芽汁培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基按常規(guī)方法配置[13?14]。

1.2 拮抗菌的分離、篩選及鑒定

1.2.1 樣品細(xì)菌的分離純化采用平板稀釋梯度培養(yǎng)法[15]和組織勻漿法[16]分別對(duì)根部土細(xì)菌及根內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離、純化。

1.2.2 拮抗細(xì)菌的篩選采用平板對(duì)峙法進(jìn)行拮抗細(xì)菌篩選。拮抗細(xì)菌使用NA培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)峙實(shí)驗(yàn)及病原菌培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基。以不放置細(xì)菌菌塊的 PDA 平板為對(duì)照，于 28 ℃ 培養(yǎng) 2 d后測(cè)量細(xì)菌及病原菌2個(gè)接種點(diǎn)連線上病原菌的菌落半徑（mm），計(jì)算抑菌率[17?18]。初篩以可可毛色二孢菌為靶標(biāo)，對(duì)初篩具有較好拮抗作用的菌株，以尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌為靶標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證，以期得到對(duì)尖孢鐮刀菌、可可毛色二孢菌、奇異根串珠霉菌等3種根腐病菌綜合拮抗作用最好的生防菌株。

1.2.3 拮抗菌種子液的制備及其對(duì)3種病原菌的抑制作用挑取拮抗菌株單菌落于裝有100 mL LB 液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床中，28 ℃、180 r·min?1振蕩培養(yǎng) 24 h 作為種子液備用，并測(cè)量菌液在波長(zhǎng)為 600 nm 時(shí)的OD值。采用濾紙片抑菌測(cè)定法進(jìn)行菌液抑菌作用測(cè)定。具體操作：在超凈工作臺(tái)中將無(wú)菌濾紙片在拮抗菌液中浸泡 30 s。用無(wú)菌鑷子夾取濾紙片，淋掉多余液體，使濾紙片與培養(yǎng)基密切接觸。每個(gè)培養(yǎng)基上均勻放置3張濾紙片，以只接LB的濾紙片培養(yǎng)基為對(duì)照，進(jìn)行對(duì)峙實(shí)驗(yàn)（方法同1.2.2）。

1.3 拮抗細(xì)菌的鑒定對(duì)檳榔根腐病具有拮抗作用的菌株，接種于NA平板培養(yǎng)基上，32 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落的形態(tài)、大小、邊緣、透明度等形態(tài)特征，并采用青島海博生物有限公司生產(chǎn)的生化試驗(yàn)配套試劑進(jìn)行菌株的生理生化特性檢測(cè)，檢測(cè)方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[19]從形態(tài)特征對(duì)菌株進(jìn)行生物學(xué)鑒定；再結(jié)合 16S rDNA基因進(jìn)行分子學(xué)鑒定，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌的DNA，以拮抗菌株的基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物27F： 5 ′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ′/1492R：5 ′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'進(jìn) 行 PCR 擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序；對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，并從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相關(guān)菌株的 16S rDNA 序列，在MEGA7.0 上用Neighbor?joining分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)[20]。

1.4 拮抗菌最佳培養(yǎng)基組分的配比對(duì)碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽的篩選參照何明川[13]楊亞男[14]的方法以豆芽汁為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入 2%的麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉進(jìn)行最佳碳源的篩選；分別加入1%的氯化銨、酵母浸粉、牛肉膏、甘氨酸和蛋白胨進(jìn)行最佳氮源的篩選；分別加入0.3%的七水合硫酸鎂（MgSO4· 7H2O）、碳酸鈣（CaCO3）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）和磷酸氫二鉀（K2HPO4）進(jìn)行最佳無(wú)機(jī)鹽的篩選。每組 3次重復(fù)，測(cè)量菌液在波長(zhǎng)為 600 nm 時(shí)的OD值。根據(jù)上述碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽的單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置3因素3水平正交試驗(yàn)，對(duì)其最佳用量進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳培養(yǎng)基組分配方。

1.5 室內(nèi)防效測(cè)定

1.5.1 拮抗菌株懸浮液的制備挑取拮抗菌株單菌落于裝有 100 mL NYBD 液體培養(yǎng)基的 250 mL錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床中，28 ℃、180 r·min?1振蕩培養(yǎng) 24 h后得到拮抗菌菌懸液，調(diào)節(jié)濃度至約為 109CFU·mL?1。

1.5.2 盆栽實(shí)驗(yàn)選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的“熱研1號(hào)”檳榔苗，移栽至裝有1∶1的滅菌土和蛭石的花盆中，緩苗15 d左右，采用傷根灌注法[21]，向?qū)嶒?yàn)組和對(duì)照組每盆分別接種孢子濃度為107CFU·mL?1的可可毛色二孢菌孢子液200 mL，接種病原菌10 d后，選擇對(duì)峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果中拮抗效果最好的菌株進(jìn)行灌根處理，每株苗接種拮抗菌液200 mL，菌液濃度為 109CFU·mL?1，同時(shí)對(duì)照組每株淋入無(wú)菌NYBD培養(yǎng)基200 mL。每組5個(gè)重復(fù)。定期觀察檳榔幼苗感病與生長(zhǎng)情況，計(jì)算幼苗發(fā)病率[22]。

1.6 數(shù)據(jù)分析采用 IBM SPSS Statistics Version 22.0進(jìn)行單因素方差分析，并且使用Duncan法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05），使用 GraphPad prim 完成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 樣本拮抗菌的分離、篩選結(jié)果從各樣本中共分離到 247 株細(xì)菌。通過(guò)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)篩選到6株細(xì)菌對(duì)可可毛色二孢菌具有拮抗作用，且 6株拮抗菌的抑菌率均達(dá)到 60%以上（表1）。從中選取3株拮抗效果好的菌株brj-21、qrj-2-6和wrb-2-4。從這3株拮抗菌中篩選出對(duì)檳榔其他2種根腐病原菌也具有較強(qiáng)抑制作用的菌株，得到菌株brj-21對(duì)可可毛色二孢菌、尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌拮抗效果均較好，抑菌率分別為73.66%、68.00%和74.33%，抑菌帶寬分別為6.50 、4.83 、5.83 mm；并發(fā)現(xiàn) brj-21 菌液（OD600值為2.84）也對(duì)檳榔3種病原均有較強(qiáng)的抑菌能力。這表明brj-21菌株對(duì)3種檳榔根部病原菌的防治有較好的生防潛力（表2、3，圖1）。

表1 對(duì)可可毛色二孢菌具有抑菌作用的菌株

表2 3株生防菌對(duì)尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌的抑菌作用

表3 brj-21 菌液對(duì)病原真菌的抑菌作用

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1 生物學(xué)鑒定將菌株 brj-21 接種至 NA 培養(yǎng)基上，32 ℃ 培養(yǎng) 24 h 后生長(zhǎng)良好，菌落初期成乳白色，邊緣較為規(guī)則，表面平滑、干燥，菌株為革蘭氏陰性菌（圖2）。不能水解明膠、淀粉，不能利用甘露醇、硫化氫，硝酸鹽還原反應(yīng)為陽(yáng)性等，對(duì)照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，初步將此菌株歸為產(chǎn)堿菌屬Alcaligenes sp.（表4）。

表4 生防菌株 brj-21 的生理生化特性

2.2.2 分子學(xué)鑒定由 16S rDNA 測(cè)序表明，擴(kuò)增后的菌株brj-21序列長(zhǎng)度為1 440 bp，經(jīng)過(guò)與NCBI的 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis，登錄號(hào)是 MH 106702.1）的相似度達(dá)到 99%，此外下載8個(gè)產(chǎn)堿屬不同種的菌株序列，并選擇腸桿菌（Escherichia coli，登錄號(hào)是NZ FAVL01000094）作為外群菌株，通過(guò) MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。發(fā)現(xiàn)菌株brj-21與糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis，登錄號(hào)是MH 106702.1）處于同一分支上，并綜合菌株形態(tài)和生理生化特征，鑒定 brj-21 菌株為Alcaligenes faecalis（圖3、4）。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 不同碳源對(duì)菌株brj-21生長(zhǎng)的影響菌株brj-21在5種碳源中皆可以生長(zhǎng)，但當(dāng)以葡萄糖為菌株brj-21碳源時(shí)，拮抗菌生長(zhǎng)最佳，菌液OD值高達(dá)2.95。故菌株brj-21的最佳碳源是葡萄糖（圖5）。

2.3.2 不同氮源對(duì)菌株brj-21生長(zhǎng)的影響菌株brj-21在5種氮源中皆可以生長(zhǎng)，當(dāng)以酵母浸粉為菌株brj-21氮源時(shí)，拮抗菌的生長(zhǎng)最佳，菌液OD值高達(dá)2.79。故選擇酵母浸粉為菌株最佳氮源（圖6）。

2.3.3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株brj-21生長(zhǎng)的影響菌株brj-21在4種無(wú)機(jī)鹽中均可以生長(zhǎng)，當(dāng)以七水合硫酸鎂為菌株brj-21無(wú)機(jī)鹽時(shí)，拮抗菌的生長(zhǎng)最佳，菌液OD值高達(dá)2.92。故選擇七水合硫酸鎂作為菌株最佳無(wú)機(jī)鹽（圖7）。

2.3.4 菌株brj-21培養(yǎng)基組分正交試驗(yàn)結(jié)果以葡萄糖、酵母浸粉和七水合硫酸鎂為因素的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5中R的大小排列得出，影響菌株brj-21生長(zhǎng)的最主要因素是葡萄糖，其次是酵母浸粉，影響最小的是七水合硫酸鎂。根據(jù)表5中K值的大小，得出最佳培養(yǎng)基水平組合為2.5%的葡萄糖、1%的酵母浸粉、0.4%的七水合硫酸鎂，即優(yōu)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖2.5 g、酵母浸粉 1 g、七水合硫酸鎂 0.4 g，水 100 mL。

表5 brj-21 正交試驗(yàn)分析

2.4 盆栽實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)盆栽檳榔苗生長(zhǎng)發(fā)病的情況進(jìn)行觀察記錄，根據(jù)40 d后的發(fā)病情況發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組有3株植株葉片葉尖首先發(fā)黃隨后干枯，主根維管束發(fā)黑腐爛，長(zhǎng)勢(shì)普遍較弱，最后整株枯死，發(fā)病率為60%。實(shí)驗(yàn)組幼苗整體長(zhǎng)勢(shì)較好，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組植株差異較大。說(shuō)明菌株brj-21對(duì)可可毛色二孢菌引起的根腐病具有較好防病效果（圖8）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)篩選到的生防菌株brj-21為檳榔根內(nèi)生菌。內(nèi)生菌（Endophyte）是指其生活史的一定階段或全部階段定殖于植物器官、組織內(nèi)部以及細(xì)胞間隙的微生物[23]。內(nèi)生菌與植物的生長(zhǎng)息息相關(guān)，其作為潛在生防資源和外援基因載體在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用具有廣闊的前景，已成為農(nóng)業(yè)專家研究的焦點(diǎn)[24]。檳榔根腐病是檳榔極易發(fā)生的病害，主要以葉尖變黃、根莖腐爛變色為主，是由多種病原等引起的真菌性病害[3]。生物防治具有不污染環(huán)境，不易使病害產(chǎn)生抗藥性及對(duì)非靶標(biāo)生物安全等優(yōu)點(diǎn)，以被廣泛應(yīng)用[25]。常見(jiàn)的生防菌株有放線菌屬、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬等。關(guān)于糞產(chǎn)堿菌為生防菌株的報(bào)道較少，但已有報(bào)道糞產(chǎn)堿菌可產(chǎn)生羥胺類物質(zhì)而抑制成團(tuán)泛菌和多種植物病原真菌的生長(zhǎng)及降解多種有毒有害物質(zhì)如苯酚、氰化物、亞砷酸鹽、硫化氫等[26]。高之蕾等[27]的研究結(jié)果表明，糞產(chǎn)堿菌51-A和51-B對(duì)桃樹(shù)根癌病具有較強(qiáng)的抑制作用。Yuen等[28]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 該菌在與尖孢鐮刀菌 (F.oxysporum) 作用過(guò)程中可以產(chǎn)生一種鐵螯合劑，能夠抑制尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)。本研究從健康檳榔根中分離、篩選到的內(nèi)生糞產(chǎn)堿菌brj-21對(duì)可可毛色二孢菌、尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌均具有較強(qiáng)的抑菌作用，說(shuō)明brj-21可作為生防菌株。

在外界營(yíng)養(yǎng)和發(fā)酵均適宜的條件下，brj-21產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)一般更豐富。有研究[29]表明由糞產(chǎn)堿菌的毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果得出該菌株是安全的，可以作為微生物肥料生產(chǎn)用的菌種，那么，對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化顯得愈發(fā)重要。本實(shí)驗(yàn)采用單因素與正交實(shí)驗(yàn)得出菌株brj-21優(yōu)化培養(yǎng)基配方為酵母浸粉 2.5 g、葡萄糖 1 g、七水合硫酸鎂 0.4 g、水100 mL。蔣樟麗等[30]對(duì)糞產(chǎn)堿菌AF01的優(yōu)化中，菌株AF01生長(zhǎng)的最佳碳源是蔗糖。2株菌碳源的差異可能是由于菌株用途、來(lái)源、生境等不同造成的，后續(xù)應(yīng)再次驗(yàn)證。本研究只對(duì)拮抗菌株的室內(nèi)實(shí)驗(yàn)做了初步探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株brj-21對(duì)由可可毛色二孢菌導(dǎo)致的根腐病有較好的防病效果。驗(yàn)證菌株brj-21對(duì)尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌導(dǎo)致的檳榔根腐病的防病效果及大田實(shí)驗(yàn)有待后續(xù)重點(diǎn)研究。

本研究篩選到的菌株brj-21對(duì)檳榔根腐病的尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）和奇異根串珠霉菌（Thielaviopsis paradoxa）3種病原均具有較強(qiáng)的抑制作用。brj-21經(jīng)鑒定為糞產(chǎn)堿菌，并對(duì)其最適培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，以期為利用菌株brj-21對(duì)檳榔根部病害的生物防治提供菌種及理論指導(dǎo)。