釕紅染色和單克隆抗體免疫標(biāo)記植物葉片中的果膠

李曉寶，孫振炳，姚曜，湯正捷，李曉平

(西南林業(yè)大學(xué)云南省膠黏劑與膠合制品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224)

果膠是自然界最復(fù)雜的化學(xué)物質(zhì)之一，常存在于植物的根、莖、葉和果實(shí)等組織中[1]，早在1825年就從胡蘿卜(Daucuscarotavar.sativa)中被分離出來(lái)。果膠質(zhì)是黏結(jié)不同細(xì)胞的物質(zhì)，主要存在于細(xì)胞壁的初生壁和胞間層[2-3]，但對(duì)于存在多層細(xì)胞壁的細(xì)胞(如初生壁、次生壁和胞內(nèi)層的木質(zhì)細(xì)胞)，果膠在各個(gè)細(xì)胞壁層之間的功能尚不明確。果膠分為直鏈區(qū)和毛發(fā)區(qū)，D-半乳糖醛酸通過(guò)α-1,4-糖苷鍵連接成主鏈，毛發(fā)區(qū)支鏈上的糖基種類(lèi)則高達(dá)16種，且會(huì)隨著植物種類(lèi)、果膠儲(chǔ)存時(shí)間的變化而變化[4-5]。

果膠應(yīng)用廣泛，可被應(yīng)用于制備飲料、化妝品、保健品、藥品、血漿替代品、重金屬吸附劑等[6-8]。目前主要利用水果或果皮來(lái)生產(chǎn)果膠，除此以外，果膠還普遍存在于植物的根莖葉中。因此，植物葉片也可以用來(lái)提取果膠，但迄今為止對(duì)葉片中果膠含量和分布的研究報(bào)道甚少，尤其是利用單克隆抗體標(biāo)記法對(duì)葉片中果膠進(jìn)行研究的報(bào)道較少[9-11]。為了更好地開(kāi)發(fā)利用葉片中的果膠成分，對(duì)一些藥用葉片提取剩余物進(jìn)行進(jìn)一步價(jià)值的提升有著非常積極的意義。例如，將工業(yè)大麻葉提取大麻二酚(CBD)后再進(jìn)一步進(jìn)行果膠提取，將桉樹(shù)葉提取桉樹(shù)精油后再進(jìn)一步提取果膠等，不僅可以拓寬果膠的原料來(lái)源，還可以提高植物葉片的利用價(jià)值和利用率。

筆者根據(jù)GB/T 10742—2008《造紙?jiān)瞎z含量的測(cè)定》對(duì)葉片的果膠含量進(jìn)行測(cè)定，并利用釕紅染色和單克隆抗體免疫標(biāo)記法對(duì)葉片中的果膠進(jìn)行標(biāo)定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大麻(CannabissativaL.)葉，采自云南農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)作物研究所；云南松(Pinusyunnanensis)松針和慈竹(Neosinocalamusaffinis)葉，采自云南省昆明市；楊樹(shù)(PopulusL.)葉、刺槐(RobiniapseudoacaciaL.)葉和榆樹(shù)(UlmuspumilaL.)葉，采自山東省臨沂市。6種葉片均為春季4—5月采集。

甲醛、冰醋酸和無(wú)水乙醇，均為分析純；倫敦白膠(LR White)樹(shù)脂、釕紅染色劑、TBS緩沖液(pH 7.4～7.6，0.05 mol/L三乙醇胺緩沖鹽水溶液)、TBST緩沖液(pH 7.4～7.6，0.05 mol/L三乙醇胺緩沖鹽水溶液+質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% Tween-20)、山羊原血清、甘油PBS封片劑。上述試劑均購(gòu)自昆明碩陽(yáng)生物有限責(zé)任公司。

單克隆第一抗體材料共有4種，分別是：JIM5抗同型半乳糖醛酸聚糖(單克隆抗體抗同型半乳糖醛酸聚糖)、JIM7抗同型半乳糖醛酸聚糖(單克隆抗體抗同型半乳糖醛酸聚糖)、LM5抗-(1-4)-β-D-半乳聚糖[單克隆抗體(1-4)-β-D-半乳聚糖] 和LM6抗-(1-5)-α-L-阿拉伯聚糖[單克隆抗體(1-5)-α-L-阿拉伯聚糖]。單克隆第二抗體為山羊抗大鼠(IgG)，是與第一抗體結(jié)合的抗體，可改善應(yīng)用結(jié)果并減少假陽(yáng)性或陰性結(jié)果。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 果膠含量的測(cè)定

根據(jù)GB/T 2677.2—2011《造紙?jiān)纤值臏y(cè)定》測(cè)定水分。

果膠的含量以測(cè)定的果膠酸鈣的含量表示：

(1)

式中：X為果膠的含量(以果膠酸鈣計(jì))，%；m為濾紙的絕干質(zhì)量，g；m1為烘干至質(zhì)量恒定后沉淀連同濾紙的質(zhì)量，g；m0為試樣質(zhì)量，g；w為試樣含水率，%。

1.2.2 葉片切片制備

葉片切片的制備主要包括樣品采集固定、脫水、釕紅染色、包埋和切片5個(gè)步驟。

1)樣品采集固定：分別采集新鮮楊樹(shù)葉、云南松松針、槐樹(shù)葉、榆樹(shù)葉、慈竹葉和大麻葉；切成5 mm×5 mm×5 mm(長(zhǎng)×寬×厚)的小塊，浸泡于由體積分?jǐn)?shù)50%甲醛-乙酸-乙醇(FAA)固定液(90 mL 體積分?jǐn)?shù)50%乙醇+體積分?jǐn)?shù)38%甲醛和冰醋酸各5 mL)中固定24 h。

2)脫水：將樣品從FAA固定液中取出，用瓊脂固定，將瓊脂固定的葉片切成寬3 mm的細(xì)條狀，然后用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇浸泡脫水，接著分別用70%，80%，90%和100%乙醇梯度浸泡，每個(gè)梯度脫水4 h以上，100%乙醇需進(jìn)行2次脫水(60 min以上)。

3)釕紅染色：釕紅可以通過(guò)靜電與羧基(酸性基團(tuán))結(jié)合，在電子顯微鏡下出現(xiàn)電子密度高度著色，在光學(xué)顯微鏡下則呈現(xiàn)出本色。葉片浸沒(méi)于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%釕紅染色劑中，對(duì)葉片進(jìn)行染色[14]。

隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，房地產(chǎn)行業(yè)發(fā)展迅猛，成為我國(guó)重要支柱產(chǎn)業(yè)之一。在其快速發(fā)展的同時(shí)，伴隨出現(xiàn)了一系列的行業(yè)風(fēng)險(xiǎn)，其中房地產(chǎn)金融風(fēng)險(xiǎn)成為當(dāng)前亟待解決的重要問(wèn)題。近年來(lái)，房地產(chǎn)行業(yè)熱度一直居高不下，其融資渠道單一，國(guó)家宏觀調(diào)控不到位等問(wèn)題逐漸暴露并加深，導(dǎo)致房地產(chǎn)金融風(fēng)險(xiǎn)劇增，加大了房地產(chǎn)行業(yè)危機(jī)，及時(shí)解決這些問(wèn)題，制定行之有效的應(yīng)對(duì)策略，是當(dāng)前房地產(chǎn)行業(yè)工作的重點(diǎn)。因此，房地產(chǎn)行業(yè)融資渠道多元化，加強(qiáng)國(guó)家宏觀調(diào)控等手段的實(shí)施對(duì)降低房地產(chǎn)金融風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

4)包埋：采用倫敦白膠(LR White)包埋[15-16]。將釕紅染色和未染色的樣品移至新的離心管中，用移液槍移取體積比為1∶1的無(wú)水乙醇和純的倫敦白膠樹(shù)脂混合溶液(由 50 g樹(shù)脂+0.99 g催化劑配制而成)直到樹(shù)脂完全沒(méi)過(guò)樣品，在室溫下浸泡滲入4 h以上；接著用干凈的鑷子將材料放入新的離心管中，然后用移液槍移取純度為100%的倫敦白膠樹(shù)脂加入離心管中直到樹(shù)脂完全沒(méi)過(guò)樣品，靜置2 h以上，重復(fù)數(shù)次；之后取出樣品放入包埋用膠囊中，注入純的倫敦白膠樹(shù)脂，充滿(mǎn)膠囊，將膠囊在不接觸水的情況下用超聲清洗機(jī)處理60 min；接著用循環(huán)水真空泵抽真空3次(3～5 h/次)，最后將膠囊放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中65 ℃聚合24 h(60 ℃時(shí)聚合16 h以上)。

5)切片：在37 ℃水中將膠囊溶解，對(duì)聚合好的材料塊進(jìn)行修整，用切片機(jī)進(jìn)行切片，厚度為5～10 μm，將切好的切片置于滴有水滴的干凈載玻片上；接著將放有切片的載玻片放在70 ℃的烘干臺(tái)上，烘烤至少5 min，直到水滴蒸干，切片完全干燥平鋪于載玻片；切片完全干燥后，為保證葉片中果膠成分能夠被充分染上顏色，釕紅染色的樣品可再一次進(jìn)行染色，烘干待用[17-19]。

1.2.3 免疫標(biāo)記

將切好的未被染色的切片連同載玻片置于TBS和TBST 的混合緩沖溶液中浸潤(rùn)10 min；取出玻片，將山羊原血清和TBST緩沖液混合配出1/30的山羊原血清溶液滴加在玻片上，將半薄切片封閉1 h；然后，分別在4個(gè)載玻片上滴加經(jīng)TBST 緩沖溶液稀釋為1/4的單克隆第一抗體 (JIM5、JIM7、LM5和LM6)，并在4 ℃的冰箱中與半薄切片反應(yīng)12 h以上；接著用TBS洗滌3次(5 min/次)，洗滌后風(fēng)干玻片；再用經(jīng)TBST 緩沖溶液稀釋為1/100的單克隆第二抗體[山羊抗大鼠(IgG)]對(duì)半薄切片進(jìn)行封閉，在37 ℃烘箱中烘干1 h；用TBS緩沖溶液清洗樣品，清洗5次(5 min/次)，之后用蒸餾水清洗2次(5 min/次)；置于干燥通風(fēng)處晾干，用甘油PBS封片劑封片，用熒光顯微鏡進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葉片中的果膠含量

經(jīng)測(cè)定6種葉片在樣品尺寸不同時(shí)的果膠含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))不同，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。工業(yè)大麻葉片的果膠含量為12%～17%、楊樹(shù)葉片為10%～15%、榆樹(shù)葉片為10%～17%、刺槐葉片為5%～8%、松針為1.5%～2.5%、慈竹葉在1%以下，其中工業(yè)大麻葉片、楊樹(shù)葉、榆樹(shù)葉的果膠含量在6種葉片中相對(duì)較多，刺槐葉片次之，慈竹葉的果膠含量在6種葉片中最少。對(duì)于同一種葉片，當(dāng)顆粒尺寸由20～40目減小到80目時(shí)，葉片的果膠含量都在逐漸地增加，而當(dāng)顆粒尺寸小于80目時(shí)葉片的果膠含量開(kāi)始逐漸地降低。這可能是由于果膠主要存在于胞間層和初生壁中，在植物細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中起著調(diào)控作用，有一定的韌性，不易被粉碎，所有在80目以下顆粒中主要是生物質(zhì)材料的其他化學(xué)成分，有待進(jìn)一步研究。

表1 不同植物葉片中的果膠含量Table 1 Pectin contents in different plant leaves

2.2 不同葉片中的釕紅染色圖像

6種植物葉片經(jīng)釕紅染色后的果膠分布見(jiàn)圖1。植物葉片中的果膠成分能夠被釕紅染色劑染上紅色，顏色深淺與果膠含量的多少成正比，對(duì)比6種葉片的著色情況，大麻葉、刺槐葉、楊樹(shù)葉、榆樹(shù)葉的果膠含量比其他兩種多，松針次之，慈竹葉在6種葉片中最少。比較各組織的釕紅著色深度，大麻葉、刺槐葉、榆樹(shù)葉和楊樹(shù)葉葉肉細(xì)胞的果膠含量比表皮細(xì)胞多；松針表皮細(xì)胞和靜脈組織的果膠含量比葉肉細(xì)胞少，果膠多分布于葉肉細(xì)胞中；慈竹葉表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞的果膠含量較少，靜脈組織的果膠含量多一些。

1. 表皮細(xì)胞; 2. 葉肉細(xì)胞; 3. 靜脈組織。a1～a2)不同放大倍數(shù)下的大麻葉; b1～b2)不同放大倍數(shù)下的松針; c1～c2)不同放大倍數(shù)下的刺槐葉; d1～d2)不同放大倍數(shù)下的楊樹(shù)葉; e1～e2)不同放大倍數(shù)下的榆樹(shù)葉; f1～f2)不同放大倍數(shù)下的慈竹葉。圖1 釕紅染色的6種葉片F(xiàn)ig. 1 Six kinds of leaves stained with ruthenium red

2.3 不同葉片中果膠的熒光圖像

2.3.1 不同波長(zhǎng)熒光照射下的木質(zhì)素粉與果膠粉

免疫標(biāo)記是以抗原和抗體的特異性結(jié)合產(chǎn)生抗原-抗體免疫復(fù)合物，通常是指使用熒光素、放射性同位素、酶、膠體和化學(xué)(或生物)發(fā)光劑作為標(biāo)記，并且使用標(biāo)記的抗體或抗原以及相應(yīng)的抗原或抗體用于特異性抗原-抗體反應(yīng)[20]。

L1～L3 和P1～P3分別為木質(zhì)素粉和經(jīng)過(guò)JIM5標(biāo)記后的果膠粉在3種不同波長(zhǎng)熒光[紫外(UV)熒光波長(zhǎng)為372～456 nm，綠色熒光波長(zhǎng)490～520 nm，黃色熒光波長(zhǎng)530～615 nm]照射下的情況，如圖2所示。由圖2可知，3種波長(zhǎng)下均有亮光，即木質(zhì)素粉和經(jīng)過(guò)JIM5標(biāo)記后的果膠粉在熒光照射下都有自發(fā)熒光；但比較L1和P1可以看到在UV熒光照射下，木質(zhì)素粉的亮光暗淡且不明顯，經(jīng)過(guò)JIM5標(biāo)記后的果膠粉明顯比木質(zhì)素粉發(fā)出的熒光要亮且均勻，因此選擇UV熒光作為光源照射，分析果膠在葉片中的分布狀態(tài)。

圖2 不同波長(zhǎng)熒光照射下的木質(zhì)素粉與果膠粉Fig. 2 Lignin powder and pectin powder under different wavelength fluorescence irradiations

2.3.2 單克隆抗體標(biāo)記葉片中的果膠成分

在UV熒光照射下經(jīng)LM5、LM6、JIM5、JIM7這4種單克隆抗體標(biāo)記的6種植物葉片果膠成分均發(fā)出亮光，發(fā)出亮光的強(qiáng)弱和果膠含量的多少成正相關(guān)的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖3～8。對(duì)比6種葉片發(fā)出亮光的強(qiáng)弱可以知道大麻葉、楊樹(shù)葉、榆樹(shù)葉、刺槐葉的果膠含量比其他2種葉片多，云南松松針次之，慈竹葉在6種葉片中果膠含量最少。這與前面果膠含量測(cè)定及釕紅染色的結(jié)果是一致的。

比較葉片中不同部位熒光的亮度，4種單克隆抗體標(biāo)記的大麻葉片、刺槐葉、榆樹(shù)葉和楊樹(shù)葉葉肉細(xì)胞的熒光亮度比表皮細(xì)胞部分亮，即葉肉細(xì)胞的果膠含量比表皮細(xì)胞多。以此類(lèi)推，松針的表皮細(xì)胞和靜脈組織的果膠含量比葉肉細(xì)胞少，主要集中在葉肉細(xì)胞中；慈竹葉表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞的果膠含量較少，靜脈組織較多。另外，經(jīng)過(guò)4種單克隆抗體標(biāo)記之后，6種葉片中的熒光分布沒(méi)有顯著區(qū)別，說(shuō)明在這6種葉片中4種單克隆抗體能夠標(biāo)記的特定糖分均有分布，即果膠中的糖分是呈混合分布的狀態(tài)沒(méi)有特定的富集區(qū)域。

1. 表皮細(xì)胞; 2. 葉肉細(xì)胞。圖3 4種單克隆抗體標(biāo)記的大麻葉中的果膠成分Fig. 3 Pectin components in Cannabis sativa L. leaves labeled with 4 monoclonal antibodies

1. 表皮細(xì)胞; 2. 葉肉細(xì)胞; 3. 靜脈組織。圖4 4種單克隆抗體標(biāo)記的云南松松針中的果膠成分Fig. 4 Pectin components in Pinus yunnanensis needles labeled with 4 monoclonal antibodies

1. 表皮細(xì)胞; 2. 葉肉細(xì)胞; 3. 靜脈組織。圖5 4種單克隆抗體標(biāo)記的刺槐葉中的果膠成分Fig. 5 Pectin components in Robinia pseudoacacia L. leaves labeled with 4 monoclonal antibodies

1. 表皮細(xì)胞; 2. 葉肉細(xì)胞。圖6 4種單克隆抗體標(biāo)記的楊樹(shù)葉中的果膠成分Fig. 6 Pectin components in Populus L. leaves labeled with 4 monoclonal antibodies

1. 表皮細(xì)胞; 2. 葉肉細(xì)胞。圖7 4種單克隆抗體標(biāo)記的榆樹(shù)葉中的果膠成分Fig. 7 Pectin components in Ulmus pumila L. leaves labeled with 4 monoclonal antibodies

1. 表皮細(xì)胞; 2. 葉肉細(xì)胞; 3. 靜脈組織。圖8 4種單克隆抗體標(biāo)記的慈竹葉中的果膠成分Fig. 8 Pectin components in Neosinocalamus affinis leaves labeled with 4 monoclonal antibodies

3 結(jié) 論

通過(guò)測(cè)定果膠含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、釕紅染色和單克隆抗體標(biāo)記技術(shù)來(lái)表征葉片中的果膠成分，確定了植物葉片中有大量果膠的存在，為發(fā)掘新的果膠提取來(lái)源提供了依據(jù)。具體結(jié)論如下：

1)大麻葉、楊樹(shù)葉和榆樹(shù)葉中的果膠含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別是12%～17%，10%～15%和10%～17%，含量均在10%以上，在6種葉片中較高，刺槐葉和松針次之，慈竹葉最少。

2)釕紅染色和單克隆抗體標(biāo)記技術(shù)均可有效表征果膠，果膠含量與葉片釕紅染色劑的著色深度、果膠單克隆抗體標(biāo)記的熒光亮度均呈正相關(guān)關(guān)系。在6種葉片中，大麻葉、楊樹(shù)葉和榆樹(shù)葉被釕紅著色的深度較深，免疫標(biāo)記熒光亮度較亮，尤其是葉片的葉肉細(xì)胞，因此這3種樹(shù)葉具有提取果膠質(zhì)的潛在價(jià)值。經(jīng)過(guò)4種單克隆抗體標(biāo)記之后，6種葉片中的熒光分布沒(méi)有顯著區(qū)別，即4種單克隆抗體能夠標(biāo)記的特定糖分在6種葉片中均有分布，果膠中的糖分呈混合分布狀態(tài)，沒(méi)有特定的富集區(qū)域。