三元低共熔溶劑高效預處理提高楊木酶水解效率

趙天暢，王杰，侯海旭，李海潮，游婷婷，許鳳

(北京林業(yè)大學材料科學與技術學院，北京 100083)

木質(zhì)纖維素是一種可再生、資源豐富且富有潛力的生物質(zhì)資源，以其為原料開發(fā)生物乙醇等生物質(zhì)能源，有利于實現(xiàn)“碳達峰，碳中和”[1]。有效的預處理可以打破木質(zhì)纖維素抗降解屏障，增加纖維素酶對纖維素的可及度，顯著提高生物乙醇的轉化效率[2]。近年來，科研人員開發(fā)了多種預處理方法，如蒸汽爆破法、酸法、堿法、有機溶劑法、離子液體法及低共熔溶劑法等。其中，低共熔溶劑(DES)法是一種綠色的預處理方法。DES是由一定比例的氫鍵供體(HBD)和氫鍵受體(HBA)通過氫鍵作用形成熔點低于各組分的共晶混合物[3]，具有低揮發(fā)、不易燃、生物相容性、可降解性、價格低廉且可回收利用等優(yōu)勢，受到廣泛關注。根據(jù)HBD的來源，DES可分為酸性、堿性和中性體系，其中以氯化膽堿和多元醇形成的中性體系具有流動性好、對設備腐蝕性小的優(yōu)勢，應用前景廣闊。氯化膽堿(ChCl)是目前使用最廣泛的生物基HBA，多元醇和羧酸是常用的HBD。Zhang等[4]采用以氯化膽堿和甘油(Gl)合成的中性DES-ChCl/Gl(物質(zhì)的量比為2∶1)在90 ℃下預處理玉米芯24 h，纖維素殘渣24 h酶解的葡萄糖得率達到96.4%。Chen等[5]采用氯化膽堿/乙二醇(EG)在130 ℃下處理柳枝稷30 min，酶解24 h葡萄糖得率僅為11%。針對上述中性DES預處理效率較低的問題，科研人員開發(fā)了部分可縮短預處理時間的多元醇基DES的復合體系。Wang等[6]向ChCl/Gl中加入氯化鐵等路易斯酸催化劑，在120 ℃下預處理雜交狼尾草6 h，纖維素殘渣24 h的酶水解效率增加至87%，酶水解時間延長至72 h，其效率可達99.5%。Guo等[7]研究結果顯示，在ChCl/Gl中分別引入3種雜多酸，120 ℃條件下預處理奇崗芒3 h，奇崗芒24 h的酶水解效率升高至72%～92%，72 h酶水解效率超過90%。Chen等[5]在ChCl/EG體系中加入1%H2SO4，130 ℃下處理柳枝稷30 min，纖維素殘渣24 h酶解葡萄糖得率超過90%。但DES與其他試劑的復合過程增加了操作步驟，使整個預處理過程更為煩瑣復雜，能耗增加。Chen等[8]合成了氯化膽堿/乙二醇/對甲基苯磺酸三元低共熔溶劑，并將其用于預處理柳枝稷，經(jīng)120 ℃條件下預處理6 min后，纖維素殘渣36 h的酶解效率超過90%。由此可見，酸催化多元醇DES或現(xiàn)有的三元多元醇DES預處理仍無法有效縮短高葡萄糖轉化率所需的酶解時間，進而降低轉化效率。

對羥基苯磺酸是一種來源于木質(zhì)素單體衍生物的雙官能團有機酸，具有可回收、廉價等優(yōu)點，已被用于生物質(zhì)組分分離[9]。本研究以楊木為原料、以當前最常用的氯化膽堿為HBA，選用對羥基苯磺酸及乙二醇(或1,4-丁二醇)為HBD，合成兩種新型三元低共熔溶劑，考察預處理時間和HBD種類對楊木的主要組分組成、結構特征，以及預處理殘渣酶水解效率的影響，以期實現(xiàn)溫和條件下的短時高效預處理和酶解。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

原料楊木，取自北京林業(yè)大學實驗林場，楊木磨成0.25～0.38 mm的木粉后在60 ℃下烘干。用甲苯-無水乙醇(甲苯和無水乙醇體積比為2∶1)對楊木粉抽提6 h，而后在60 ℃下干燥至質(zhì)量恒定，密封保存?zhèn)溆?。纖維素酶CTec2，濾紙酶活為100 FPU/mL，購自丹麥Novozymes公司。氯化膽堿、乙二醇及1,4-丁二醇為分析純，對羥基苯磺酸一水合物純度為80%，所有藥品均購自上海麥克林生化有限公司。

1.2 三元低共熔溶劑預處理

1.2.1 三元DES的制備

分別將氯化膽堿、乙二醇(或1，4-丁二醇)和對羥基苯磺酸一水合物按物質(zhì)的量比1∶2∶0.1置于耐壓瓶中，80 ℃加熱直至形成澄清透明液體。然后將所得三元DES冷卻，密封保存待用。合成的三元DES氯化膽堿/乙二醇/對羥基苯磺酸和氯化膽堿/1,4-丁二醇/對羥基苯磺酸分別標記為ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA。

1.2.2 原料預處理

將20 mL DES加入100 mL圓底燒瓶中，攪拌轉速500 r/min，待升溫至120 ℃，再向燒瓶中加入2.00 g楊木木粉，分別反應0.5，1.0和1.5 h。反應結束后立即冷卻，并將60 mL 50%丙酮水溶液加入反應液中，常溫攪拌2 h。將所得固液混合物分離，用50%丙酮水溶液洗滌固體殘渣至洗脫液無色，繼續(xù)用去離子水洗至中性，冷凍干燥。預處理殘渣樣品編號為ChCl/EG/PSA-0.5、ChCl/EG/PSA-1.0、ChCl/EG/PSA-1.5、ChCl/BD/PSA-0.5、ChCl/BD/PSA-1.0和ChCl/BD/PSA-1.5。

1.3 纖維素酶水解

分別準確稱取0.200 0 g未處理和預處理的楊木樣品分散于10 mL的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH為4.8)，在50 ℃下水解24 h，纖維素酶用量為15 FPU/g[10-11]。為研究酶水解效率，定時(0.5，3，6，9，12及24 h)從水解液中取樣200 μL，隨后將樣品滅活5 min。冷卻后用0.22 μm針式過濾器過濾，所得濾液保存于超低溫冰箱。

1.4 分析方法

1.4.1 Kamlet-Taft溶劑致顯色化參數(shù)測試

將3種染料尼羅紅、對硝基苯胺和N,N-二乙基-對硝基苯胺分別溶于無水甲醇中，制備成濃度為0.001 mol/L的母液。取0.5 mL母液于10 mL離心管中，在40 ℃下真空干燥48 h以揮發(fā)甲醇，而后將低共熔溶劑加入并混合均勻。在室溫下采用UV-Vis分光光度計(UV-2600i，日本島津公司)對混合液的吸收光譜進行測試。Kamlet-Taft溶劑致顯色化參數(shù)的計算見公式(1)～(3)[12]。

π*=0.314×(27.52-νNEt2)

(1)

(2)

(3)

式中：α為氫鍵酸性；β為氫鍵堿性；π*為可極化性；λmax為所用染料的最大吸收波長；ν=1/(λmax×10-4)。

1.4.2 化學組成測定

采用美國可再生能源實驗室(NREL)標準方法，NREL/TP-510-42618“Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass”，測定預處理前后楊木中纖維素、木聚糖及木質(zhì)素的含量。

1.4.3 固體回收率

固體回收率計算見公式(4)：

(4)

式中：y為固體回收率，%；m1為回收物料質(zhì)量，g；m2為初始物料質(zhì)量，g。

1.4.4 單糖含量測定

葡萄糖及木糖含量均采用高效液相色譜儀(Agilent 1200)測定，Aminex HPX-87P分析柱(7.8 mm×300 mm，Bio-Rad)，進樣量5 μL，流動相為0.005 mol/L H2SO4溶液，流速0.6 mL/min，柱溫50 ℃。

1.4.5 紅外光譜檢測

預處理前后的楊木樣品紅外光譜用傅里葉紅外光譜儀(TensorⅡ，德國布魯克)進行采集，分析預處理前后楊木木粉的官能團信息。采用KBr壓片法制樣，稱取DES預處理前后樣品10 mg，按質(zhì)量比1∶100加入KBr，混合均勻后充分研磨，在10 MPa下壓片后進行紅外分析，測試過程中，光譜信號采集范圍為1 800～800 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.4.6 X-射線衍射檢測

預處理前后的楊木樣品結晶度及結晶結構采用X-射線衍射儀(D8 Advance，德國布魯克)測定，布拉格角測定范圍為5°～35°，步長0.03(°)/s。隨后的樣品相對結晶度(CrI)根據(jù)Segal提出的經(jīng)驗公式進行計算，見公式(5)。

(5)

式中：I002為002晶格的極大衍射強度；Iam為無定形區(qū)背景衍射的散射強度。

1.4.7 表面形貌觀察

采用場發(fā)射掃描電鏡(SU8010，日本日立公司)觀察預處理前后楊木木粉的表面形貌。觀察前先將樣品固定在金屬平臺上，并進行噴金處理。掃描電壓10 kV。

1.4.8 酶解效率測定

過濾后的酶解液采用高效液相色譜系統(tǒng)檢測水解液中葡萄糖質(zhì)量濃度。預處理物料酶解效率計算見公式(6)：

(6)

式中：yc為酶解效率，%；c1為酶水解所得的葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為酶解液的體積，mL；m0為酶解底物質(zhì)量，g；ω為酶解底物纖維素質(zhì)量分數(shù)，%。

2 結果與分析

2.1 三元DES氫鍵酸性、堿性及可極化性

采用溶劑化顯色參數(shù)評估了ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA的α、β和π*的結果見表1。較高的α值表明DES具有較強的氫鍵給予能力，有利于破壞木質(zhì)纖維原料中的醚鍵和酯鍵，增強預處理效果;較高的β值表明其具有更高的氫鍵接受能力，更有利于打破木質(zhì)纖維的氫鍵網(wǎng)絡結構，并可能脫除更多木質(zhì)素和半纖維素，進而提高預處理效果。由表1可知，ChCl/BD/PSA的α和π*值與ChCl/EG/PSA差異較小，但β值遠高于ChCl/EG/PSA。這表明ChCl/BD/PSA具有更強的氫鍵形成能力和脫除木質(zhì)素及半纖維素能力，有利于木質(zhì)纖維原料預處理。

表1 低共熔溶劑致顯色化參數(shù)Table 1 Solvatochromic parameters of deep eutectic solvents

2.2 三元DES預處理對楊木組成成分的影響

采用ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA體系在120 ℃分別處理楊木0.5，1.0和1.5 h，其固體回收率及成分分析結果見表2，其中原料為未處理的楊木，ChCl/EG/PSA-0.5/1.0/1.5為經(jīng)ChCl/EG/PSA處理0.5 h/1.0 h/1.5 h后的楊木，ChCl/EG/PSA-0.5/1.0/1.5為經(jīng)ChCl/BD/PSA處理0.5 h/1.0 h/1.5 h后的楊木。由表2可知，楊木經(jīng)三元DES預處理后，固體回收率降至42.07%～53.70%，低于氯化膽堿/乙二醇及氯化膽堿/丙三醇等中性體系，可能是對羥基苯磺酸促進了部分組分的脫除[4]。楊木中主要成分為纖維素、半纖維素及木質(zhì)素，三者間的緊密結合抑制了微生物及酶的降解作用，3組分的含量變化將影響原料的酶解效率及糖產(chǎn)量[11]。因此，對預處理前后的楊木進行了成分分析。預處理后，纖維素的相對含量由43.70%上升到71.39%～77.54%，顯著高于氯化膽堿/乳酸體系處理后桉木的纖維素含量[13]。而木聚糖含量則由15.87% 降至4.14%～7.51%，略高于氯化膽堿/乳酸體系，可能原因是較短的處理時間減少了木聚糖的降解[7]。木質(zhì)素含量則從29.81%降至10.47%～16.16%。這些結果表明在三元DES預處理過程中，大量的木聚糖和木質(zhì)素被脫除，同時大部分纖維素被保留。相比于耗時較長的二元DES體系，ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA兩種三元DES纖維素保留率較高，將有利于后續(xù)的預處理樣品酶水解[14-15]。在相同的預處理時間內(nèi)，ChCl/BD/PSA體系纖維素的含量高于ChCl/EG/PSA體系，木質(zhì)素和半纖維素的含量更低，更有利于后續(xù)的酶解。根據(jù)Kamlet-Taft溶劑致顯色化參數(shù)分析(表1)，ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA的α和π*值相近，而ChCl/BD/PSA體系的β值更高，更易與木質(zhì)素、半纖維素形成強氫鍵而提高木質(zhì)素和半纖維素的脫除率。

在ChCl/EG/PSA三元DES體系處理過程中，隨預處理時間從0.5 h延長至1.0 h，固體回收率明顯下降，木聚糖及木質(zhì)素的脫除率分別增至77.88% 和73.85%，但纖維素保留率略有降低；當處理時間進一步延長至1.5 h時，固體回收率僅略有上升，木聚糖及木質(zhì)素的脫除率及纖維素保留率變化較小。這說明在ChCl/EG/PSA三元DES預處理過程中，隨著時間的延長，組分脫除率上升，纖維素降解加劇但過度延長處理時間對進一步脫除非纖維素組分作用不明顯，這與Tan等[13]采用氯化膽堿/乳酸體系處理后的桉木組分含量變化趨勢一致。

表2 DES預處理對楊木組成成分的影響Table 2 Effects of pretreatment with deep eutectic solvent on chemical composition of poplar 單位:%

2.3 紅外光譜分析

預處理前后樣品的紅外光譜(FT-IR)譜圖見圖1，對應官能團歸屬參考文獻[4,16]。1 736 cm-1處的吸收峰為羰基伸縮振動，可能來源于半纖維素和木質(zhì)素中的乙酰基或酯基中的羰基。ChCl/EG/PSA預處理后，1 736 cm-1峰強度減弱，說明預處理脫除了部分半纖維素，而ChCl/BD/PSA預處理后，1 736 cm-1峰強度降低更為明顯，這表明ChCl/BD/PSA體系脫半纖維素效果更好，與成分分析木聚糖結果一致(表2)。1 592，1 504，1 460和1 420 cm-1處的紅外吸收峰為木質(zhì)素芳環(huán)的特征峰，ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA預處理后的楊木樣品譜圖中木質(zhì)素特征峰強度明顯減弱，這表明兩種三元DES均具有優(yōu)異的木質(zhì)素脫除能力。1 364，1 322，1 238，1 162，1 104，1 040，和898 cm-1處的吸收峰為纖維素特征峰，其中1 364，1 322和898 cm-1為Ⅰ型纖維素的紅外特征吸收峰，表明ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA預處理體系對纖維素晶型均無明顯影響。1 040和898 cm-1為纖維素糖苷鍵的特征吸收峰。延長預處理時間后，其強度未見明顯減弱，說明纖維素糖苷鍵在三元DES預處理過程中具有較高的穩(wěn)定性，故大部分纖維素以固體的形式被保留，這與Ling等[15]采用甜菜堿/乳酸體系預處理毛竹后纖維素的分析結果一致。

圖1 DES預處理后楊木的紅外光譜圖Fig. 1 FT-IR spectra of pretreated poplar by deep eutectic solvents

2.4 X-射線衍射分析

預處理前后的楊木樣品X-射線衍射(XRD)圖譜見圖2。由圖2可知，主要衍射峰15.5°，16°，22.5° 及34.6°，分別來自Ⅰβ型纖維素的(1-10)，(110)，(200)和(004)晶面，未見其他纖維素晶型的明顯衍射峰，表明預處理后楊木的纖維素晶型未改變，均為Ⅰβ型，這與FT-IR分析結果一致[16]。預處理殘渣結晶度(46.6%～52.3%)均高于未處理楊木(36.2%)，這是半纖維素和木質(zhì)素等非纖維素組分被大量脫除，纖維素占比增加所致，與前文成分分析結果相一致。

圖2 DES預處理后楊木的XRD圖Fig. 2 XRD pattern of pretreated poplar by deep eutectic solvents

ChCl/EG/PSA體系預處理殘渣結晶度隨處理時間增加先升高后降低，這可能由于隨著預處理時間增加，木聚糖及木質(zhì)素被大量脫除；但預處理時間進一步增至1.5 h后，纖維素部分晶體結構被破壞，導致結晶度降低，與FT-IR和成分分析數(shù)據(jù)相一致。ChCl/BD/PSA體系回收固體結晶度先隨處理時間增加而降低，反應時間進一步延長又導致纖維素結晶度升高，可能是隨預處理時間增加，木質(zhì)素及木聚糖等非纖維素組分進一步被脫除，纖維素結晶區(qū)占比重新升高，從而結晶度再次上升。

2.5 表面形貌分析

三元DES預處理前后楊木的掃描電鏡(SEM)圖見圖3(A～G為×500；a～g為×2 000)。由圖3可知，未處理楊木表面較為光滑，纖維規(guī)整，整體排列緊密，這阻礙了纖維素酶與纖維素的接觸，不利于其酶水解。采用ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA兩種三元DES分別預處理后，楊木纖維破碎化程度增加，規(guī)整結構被破壞成碎片(圖3A-G)；進一步觀察發(fā)現(xiàn)，纖維表面變得更加粗糙，出現(xiàn)縫隙和孔洞(圖3a～g)。隨著處理時間的延長，楊木纖維破碎化程度逐漸增加，說明延長預處理時間可促進DES對纖維表面的破壞。ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA三元DES預處理可以有效降低對纖維素酶的屏障作用，從而有利于纖維素酶與纖維素接觸，進而提高酶水解效率。

A,a)為原料；B～D,b～d)為ChCl/EG/PSA-0.5/1.0/1.5 h處理樣品；E～G,e～g)為ChCl/BD/PSA-0.5/1.0/1.5 h處理樣品。圖3 DES預處理后楊木的掃描電鏡圖Fig. 3 SEM images of pretreated poplar by deep eutectic solvents

圖4 DES預處理后楊木的酶解效率Fig. 4 Enzymatic hydrolysis efficiency of pretreated poplar by deep eutectic solvents

2.6 酶水解結果分析

對未經(jīng)處理和三元DES預處理樣品進行酶水解，以分析預處理時間及體系對酶水解的影響，結果見圖4。由圖4可知，未經(jīng)DES預處理的楊木原料酶解效率僅為11.74%，且隨著酶解時間的延長變化不大。ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA預處理樣品僅酶解24 h，纖維素轉化率即分別提升至83.90%和95.08%，高于氯化膽堿/乳酸，氯化膽堿/1,4-丁二醇及氯化膽堿/甲酸體系預處理木質(zhì)纖維素的酶解效率[13, 17]。相比于未處理樣品，預處理樣品酶水解24 h的纖維素轉化率分別提高至6.04和6.84倍。與ChCl/EG/PSA體系相比，ChCl/BD/PSA脫除的木聚糖和木質(zhì)素增多，預處理楊木中木聚糖和木質(zhì)素含量進一步降低，纖維素暴露程度增大，導致對酶解的抑制作用更弱，使ChCl/BD/PSA預處理樣品的酶解效率更高。

對于ChCl/EG/PSA及ChCl/BD/PSA體系，預處理1.5 h的原料酶解效率明顯優(yōu)于0.5和1.0 h，這歸因于預處理后木質(zhì)素及木聚糖等阻礙酶解的組分被大量脫除，減弱了物理屏障作用；同時降低了木質(zhì)素及木聚糖對纖維素酶的無效吸附；而纖維表面暴露，增加了纖維素酶對纖維素的可及度，進而提高預處理楊木的酶解效率[13]。

3 結 論

以楊木作為研究對象，使用新型三元低共熔溶劑ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA對其進行預處理，對預處理前后楊木化學組分、結構變化及酶解效率進行分析表征，結論如下：

1)三元DES預處理提高楊木酶解效果明顯，在較短的預處理時間內(nèi)(0.5～1.5 h)，ChCl/EG/PSA及ChCl/BD/PSA三元DES體系具有優(yōu)異的木質(zhì)素(>70%)和木聚糖(>74%)脫除效果，同時保留大部分纖維素(>74%)。

2)ChCl/BD/PSA氫鍵堿性更強(β=0.63)，預處理效果優(yōu)于ChCl/EG/PSA；預處理后纖維素的晶型未改變，固體殘渣結晶度由36.2%上升至46.6%～52.3%。

3)預處理后的楊木ChCl/BD/PSA-1.5的24 h酶水解效率超過95%。氯化膽堿/多元醇/對羥基苯磺酸三元DES體系是一類短時、高效的預處理體系，有望用于開發(fā)低能耗的木質(zhì)纖維素綠色加工工藝。