2,4-表油菜素內(nèi)酯對干旱脅迫下垂絲海棠生理特性的影響

缐旭林，張 德，張仲興，王雙成，高彥龍，王延秀

(甘肅農(nóng)業(yè)大學園藝學院，甘肅 蘭州 730070)

土壤水分對植物生長發(fā)育至關(guān)重要。干旱脅迫會引起植物根系呼吸速率下降、呼吸代謝途徑改變、呼吸代謝相關(guān)酶活性及產(chǎn)物種類變化，造成根系吸收、運輸水分和養(yǎng)分等功能紊亂[1]。干旱脅迫下植物主要通過形態(tài)變化和滲透調(diào)節(jié)提高其抗旱性，其中形態(tài)變化主要表現(xiàn)為根系向土壤深處伸長、葉片表皮有發(fā)達角質(zhì)層和表皮毛、加快葉片生長速度使老葉脫落和關(guān)閉氣孔等；滲透調(diào)節(jié)主要表現(xiàn)為增加脫落酸含量、加快脯氨酸積累、提高與甜菜堿有關(guān)的酶類活性、水孔蛋白調(diào)控水分通透性、提高抗氧化酶活性清除活性氧等[2]。我國西北黃土高原屬于半干旱大陸性季風氣候區(qū)，干旱已成為限制該地區(qū)蘋果生產(chǎn)的主要非生物脅迫之一[3]。研究發(fā)現(xiàn)，逆境脅迫下在番茄[4]、茶樹[5]、黃瓜[6]中噴施外源物質(zhì)均取得較好的效果。因此，選用適宜的外源物質(zhì)對植株在逆境脅迫下生長具有重要的意義。

油菜素內(nèi)酯(BRs)是從油菜素花粉中分離出來的一種具有極強生理活性的物質(zhì)，已被公認為第六大植物激素，具有增強植物抗逆性的生理功能，廣泛應用于緩解植物逆境脅迫[7-8]。2，4-表油菜素內(nèi)酯(EBR)是目前在農(nóng)作物上引用較多的BR化合物，其可以維持植物較高的葉綠素含量，減緩膜脂過氧化作用，增強植物的抗逆性[9-10]。鹽脅迫下外源EBR能夠明顯緩解刺槐幼苗的氧化損傷，保護光合細胞器-葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定，提升抗氧化能力，維持刺槐葉片光合系統(tǒng)的運轉(zhuǎn)，提高其耐受性[11]。高溫脅迫下外源施用油菜素內(nèi)酯可明顯增大葉榕氣孔導度，降低蒸騰速率[12]。油菜素內(nèi)酯也可調(diào)節(jié)楊樹在鹽、銅脅迫下葉片PSII最大光化學速率，進而提高其抗逆性[13]。干旱脅迫下適宜濃度的EBR可增強葡萄抗氧化酶活性，減少丙二醛(MDA)的產(chǎn)生，保證其正常生長[14]；EBR處理后的羊草幼苗株高、葉面積和脯氨酸(Pro)含量均顯著增加，抗旱能力顯著提高[15]。外源EBR在不同逆境下均有相關(guān)的應用報道，且多見于葉榕、水稻[16]、辣椒[17]等植物，而在木本植物經(jīng)濟林果類中的應用及報道鮮見，亟需研究其在蘋果砧木中是否具有相同作用機理。

垂絲海棠(MalushallianaKoehne)原產(chǎn)于甘肅河西走廊地區(qū)，耐旱、耐鹽堿[18]。本試驗以7～8葉齡的垂絲海棠實生苗為試驗材料，探究外源噴施不同濃度的EBR對其生理特性的影響，并利用主成分綜合分析法篩選出最適濃度，以期為生產(chǎn)實踐提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

選擇長勢一致且生長健壯的7～8葉齡的垂絲海棠(MalushallianaKoehne)實生苗移載到大小相同、盛裝2 kg基質(zhì)(20%蛭石，20%珍珠巖，60%泥炭)的塑料花盆內(nèi)(內(nèi)徑11.2 cm，深16.8 cm)，每盆1株，并置于甘肅農(nóng)業(yè)大學避雨棚進行統(tǒng)一管理。移栽14 d后，采用稱重法來控制土壤含水量進行干旱脅迫處理，始終保持盆中田間持水量在50%±2%，對照處理始終保持田間持水量的80%。試驗共設(shè)7個處理，每個處理6個重復，每個重復3株。分別以正常水分(CK)、干旱脅迫(T1)、干旱脅迫+0.20 mg·L-1油菜素內(nèi)酯(T2)、干旱脅迫+0.40 mg·L-1油菜素內(nèi)酯(T3)、干旱脅迫+0.60 mg·L-1油菜素內(nèi)酯(T4)、干旱脅迫+0.80 mg·L-1油菜素內(nèi)酯(T5)、干旱脅迫+1 mg·L-1油菜素內(nèi)酯(T6)代表各處理。其中，油菜素內(nèi)酯溶液以葉面噴施的方式于每日18∶00噴施，每盆均勻噴施50 mL，每隔2 d噴施1次，共噴施3次。干旱脅迫處理次日開始計算脅迫時間，分別于脅迫0、3、6、9 d進行各項指標的測定和分析。

1.2 生理指標的測定

1.2.1 光合及葉綠素含量的測定 光合參數(shù)測定：采用LI-6400便攜式光合儀(LI-COR，Linco ln，NE，USA)于脅迫0、3、6、9 d上午9∶00—11∶00，選取同一節(jié)位的功能葉進行凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)和氣孔導度(Gs)的測定，每個處理4次重復。

葉綠素含量測定：參照賈婷婷等[19]方法進行測定。

1.2.2 抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測定 于脅迫0、3、6、9 d后，取植株中上部成熟葉片，去除葉脈剪碎并洗凈磨碎，用于相關(guān)指標的測定。相對電導率(REC)測定采用電導法[20]，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定[21]。脯氨酸(Pro)含量采用酸性茚三酮法測定[22]。過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[23]，超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用氮藍四唑光化還原法[24]，過氧化氫酶(CAT)活性的測定采用紫外吸收法[25]。每處理4次重復。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2010和Origin 2018進行數(shù)據(jù)處理及作圖，用SPSS 22.0進行相關(guān)性和主成分分析。統(tǒng)計分析采用單因素ANOVA的LSD比較差異的顯著水平(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源EBR對干旱脅迫下垂絲海棠葉片光合色素含量的影響

由圖1A可知，隨干旱脅迫時間的延長，各處理葉綠素a含量均呈持續(xù)下降的趨勢，但降幅不同。脅迫至9 d時，各處理葉綠素a含量達到最低值，T2處理葉綠素a含量顯著低于CK。但顯著高于其它處理。與CK處理相比，T1、T2、T3、T4、T5和T6處理下葉綠素a含量降幅分別為40.20%、8.64%、24.10%、29.29%、34.15%和38.00%，說明0.20 mg·L-1EBR處理可降低干旱脅迫下垂絲海棠葉片葉綠素含量a生物合成的抑制作用。

由圖1B可知，隨干旱脅迫的持續(xù)，葉綠素b含量呈不斷下降的趨勢。脅迫至9 d時，各處理葉綠素b含量達到最低值。其中，葉綠素b含量在T1處理下顯著低于其它處理，在T2處理下顯著高于其它處理，低于CK。與CK處理相比，T1、T2、T3、T4、T5和T6處理下葉綠素b含量降幅分別為20.86%、2.33%、15.08%、16.72%、17.61%和20.28%，說明0.2 mg·L-1EBR處理可有效降低干旱脅迫下垂絲海棠葉片葉綠素b生物合成的抑制作用。

由圖1C可知，葉綠素a+b和葉綠素b含量變化趨勢相一致。脅迫至9 d時，葉綠素a+b在各處理下降至最低，均顯著低于CK，與CK處理相比，T1、T2、T3、T4、T5和T6處理下葉綠素a+b含量降幅分別為32.24%、6.01%、20.39%、24.12%、27.35%和30.71%。

由圖1D可知，各處理下的Chl a/b值呈逐漸下降的趨勢。脅迫至9d時，各處理下的Chl a/b值達到最低，其中T2處理顯著低于CK，但顯著高于其它處理。與CK處理相比，T1、T2、T3、T4、T5和T6處理下葉綠素a/b降幅分別為37.63%、9.68%、16.13%、22.58%、31.18%和35.48%。

圖1 外源油菜素內(nèi)酯對干旱脅迫下垂絲海棠葉片光合色素含量的影響

2.2 外源EBR對干旱脅迫下垂絲海棠葉片光合特性的影響

由圖2A可知，隨干旱脅迫時間的延長，垂絲海棠葉片的Pn呈逐漸下降的趨勢，但不同處理下Pn的降幅不同。脅迫至9 d時，各處理的Pn降至最低，均顯著低于CK；與CK相比，降幅分別為25.34%、13.08%、19.86%、21.91%、23.74%、22.87%，說明0.20 mg·L-1EBR處理可有效抑制干旱脅迫下垂絲海棠葉片Pn的下降。

由圖2B可知，隨干旱脅迫時間的延長，垂絲海棠葉片的Gs與Pn變化趨勢相同，但不同處理下Gs的降幅不同。脅迫6 d后，Gs呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，脅迫至9 d時，各EBR處理下的Gs降至最低，顯著低于CK，與CK相比，T1、T2、T3、T4、T5和T6處理下Pn降幅分別為67.53%、33.77%、38.96%、45.45%、62.34%和64.94%，說明0.20 mg·L-1EBR處理可有效抑制干旱脅迫下垂絲海棠葉片Gs的下降。

由圖2C可知，隨干旱脅迫時間的延長，垂絲海棠葉片的Ci呈逐漸上升的趨勢，但不同處理下Ci的升幅不同。脅迫至9 d時，不同EBR處理下垂絲海棠葉片的Ci達到峰值，分別為CK的2.53倍、1.27倍、1.79倍、2.03倍、2.24倍和2.35倍。由此可見，適宜濃度EBR能顯著抑制干旱脅迫下Ci的升高。

由圖2D可知，隨著干旱脅迫時間的延長，垂絲海棠葉片的Tr與Gs變化趨勢相同，呈逐漸下降的趨勢。但不同處理對Tr的降幅不同。脅迫至9 d時，垂絲海棠葉片的Tr出現(xiàn)明顯的下降，且各處理下垂絲海棠葉片的Tr達到最低，均顯著低于CK，與CK相比，T1、T2、T3、T4、T5和T6處理下Tr降幅分別為45.82%、14.24%、18.58%、26.93%、31.588%和38.70%，說明0.20 mg·L-1EBR處理可有效抑制干旱脅迫下垂絲海棠葉片Tr的下降。

圖2 外源油菜素內(nèi)酯處理對干旱脅迫下垂絲海棠葉片Pn, Gs, Ci, Tr含量的影響

2.3 外源EBR對干旱脅迫下垂絲海棠葉片REC和Pro含量的影響

由圖3A可知，隨干旱脅迫時間的延長，垂絲海棠葉片REC呈先升后降的趨勢。脅迫至3 d時，各EBR處理下垂絲海棠葉片REC出現(xiàn)顯著升高，脅迫至6 d時，REC達到峰值，與CK相比， T1、T2、T3、T4、T5和T6處理下REC升幅分別為52.73%、16.98%、27.05%、25.41%、31.22%和38.49%，說明外源EBR對干旱脅迫引起的細胞膜透性變化有緩解作用，從而降低垂絲海棠葉片REC含量。

由圖3B可知，隨干旱脅迫時間的延長，垂絲海棠葉片Pro含量變化趨勢與REC相同。脅迫至3 d時，各處理的Pro含量出現(xiàn)明顯的增加，且隨著EBR濃度的增加，Pro含量呈逐漸下降的趨勢；脅迫至6 d時，各處理下的Pro含量達到峰值，在T1處理積累量最小，為27.33 mg·g-1；T2處理積累量最大，為40.52 mg·g-1。與CK相比，T1、T2、T3、T4、T5和T6處理下Pro升幅為35.13%、95.99%、67.54%、63.62%、44.21%和42.19%，說明外源EBR能進一步促進干旱脅迫下垂絲海棠葉片Pro的積累，且存在明顯的濃度效應。

圖3 外源油菜素內(nèi)酯處理對干旱脅迫下垂絲海棠葉片REC和Pro含量的影響

2.4 外源EBR對干旱脅迫下垂絲海棠葉片MDA含量的影響

由圖4可知，隨脅迫時間的增加，垂絲海棠幼苗葉片的MDA含量呈上升的趨勢，且不同處理下MDA含量的升幅不同。脅迫至9d時，各處理下的MDA含量達到峰值，其中T1處理下MDA含量最高，為8.25 μmol·g-1；T2處理下含量最低，為6.52 μmol·g-1，且顯著高于CK(5.92 μmol·g-1)，與CK相比，T1、T2、T3、T4、T5和T6處理下MDA升幅為39.36%、10.14%、14.36%、15.88%、23.99%和26.01%，說明0.2 mg·L-1EBR處理可有效降低干旱脅迫下垂絲海棠葉片MDA含量，緩解了干旱脅迫對垂絲海棠的傷害。

圖4 外源油菜素內(nèi)酯處理對干旱脅迫下垂絲海棠葉片MDA含量的影響

2.5 外源EBR對垂絲海棠葉片抗氧化酶活性的影響

由圖5A可知，隨干旱脅迫時間的延長，各處理的CAT活性呈先升后降的趨勢。脅迫至3 d時，T3的CAT活性達到峰值，為130.41 U·g-1，脅迫至6 d時，T1、T2、T4、T5、T6的CAT活性達到峰值，分別為139.76、145.64、131.71、129.55、127.82 U·g-1，且隨EBR濃度的增加，CAT活性呈降-升-降趨勢。脅迫至9 d時各處理CAT活性下降，相比CK(125.83 U·g-1)，T2(135.17 U·g-1)降幅最大，為7.42%，說明外源EBR增強了植物抗氧化系統(tǒng)的防御能力，維持了細胞內(nèi)ROS系統(tǒng)的代謝平衡，從而在一定程度上緩解了干旱脅迫引起的氧化損傷。

由圖5B可得，隨脅迫時間的延長，垂絲海棠幼苗葉片POD活性呈先升后降的趨勢。脅迫至6 d時T2的POD活性達到峰值，為198.38 U·g-1，顯著高于CK，較CK提高46.73%。脅迫9 d時各處理下的POD活性下降，但各處理的POD活性均顯著高于CK，說明外源EBR處理使干旱脅迫下垂絲海棠葉片POD活性升高，有效增強了植株抗氧化能力，從而提高了垂絲海棠抗旱性，其中T2處理效果最佳。

由圖5C可知，隨著脅迫時間的延長，垂絲海棠葉片的SOD與POD活性的變化趨勢相同。各處理分別在脅迫3 d(T1、T6)、6d(T2、T3、T4、T5)達到峰值后不斷降低，但不同處理對SOD活性的降幅不同。脅迫至9 d時，SOD活性下降，其中T2處理SOD活性最高(126.76 U·g-1)，顯著高于CK(88.23 U·g-1)，是CK的1.44倍，說明外源EBR能緩解干旱脅迫對垂絲海棠葉片抗氧化酶活性的抑制作用，但濃度過高或過低時，緩解效果都會大大減弱。

2.6 干旱脅迫下不同濃度EBR對垂絲海棠生理效應的綜合評價

2.6.1 相關(guān)性分析 將處理后垂絲海棠葉片的14個生理指標進行相關(guān)性分析(表1)。結(jié)果表明，垂絲海棠葉片的Pn與Chl a、Chl b、Chl a+b、Chl a/b、Gs呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與Tr呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與REC、Ci呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)。

表1 不同處理下垂絲海棠葉片各項指標的相關(guān)性分析

2.6.2 主成分分析 為綜合評價干旱脅迫下不同濃度EBR對垂絲海棠的生理響應特性，將脅迫處理后的14個指標進行主成分分析，提取特征值大于1的2個主成分，其特征值分別為9.765、3.747(表2)。第一、二主成分方差貢獻率為69.747%、26.766%，累積方差貢獻率達到96.513%，符合分析要求。如表2所示，第一主成分(PC1)綜合了Pn、Chl a、Chl b、Chl a+b、Chl a/b、REC、MDA、Gs、Tr、Ci等指標，第二主成分(PC2)綜合了Pro、SOD、POD和CAT等指標。

表2 主成分分析及方差解釋

綜合得分(F)是每個主成分得分與相對應方差貢獻率的乘積之和，即：F=F1×69.747%+F2×26.766%。由表3可知，垂絲海棠在不同處理下的綜合得分分別為：-1.20624(T1)、0.880667(T2)、0.318411(T3)、0.068989(T4)、-0.276(T5)和-0.56878(T6)。因此，干旱脅迫下不同濃度EBR對垂絲海棠生理特性的影響排名依次為：T2>T3>T4>T5>T6>T1。

表3 不同處理下垂絲海棠的綜合得分及排名

3 討 論

葉綠素能夠吸收和轉(zhuǎn)換光能，是植物進行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[26]。干旱脅迫會影響植物體內(nèi)葉綠素生成，甚至會促進原有的葉綠素分解[27]。馬野等[28]在玉米幼苗的研究中發(fā)現(xiàn)，噴施EBR可使葉綠素的含量顯著增加。本試驗中，隨脅迫時間的延長，垂絲海棠葉片的Chl a、Chl b、Chl a+b、Chl a/b含量均呈下降趨勢，通過不同濃度的外源EBR處理后， Chl a、Chl b、Chl a+b、Chl a/b含量相比T1均有不同程度的上升，這可能是外源EBR處理緩解了干旱脅迫對垂絲海棠葉綠體的損壞，從而保持其結(jié)構(gòu)的完整性，與吳曉麗等[29]在花椰菜中的研究結(jié)論相似，進一步證實外源EBR可以有效緩解這種傷害。本試驗相關(guān)性分析表明，Pn與Chl a、Chl b、Chl a+b、Chl a/b均呈極顯著正相關(guān)，說明葉綠素含量的降低可能是光合作用減弱的重要因素。有研究表明，氣孔限制和非氣孔限制均會引起Pn下降[30-31]。若Ci和Gs同時下降，說明氣孔因素是引起光合速率下降的主要原因，如果Gs下降，而Ci維持不變甚至上升，則表明葉肉細胞同化能力降低等非氣孔因素是引起光合速率下降的主要原因[32]。本試驗中，干旱脅迫下垂絲海棠葉片的Gs下降的同時Ci上升，說明在干旱脅迫下垂絲海棠Pn下降是由非氣孔限制因素造成，即由垂絲海棠葉肉細胞的光合活性降低引起，這可能是干旱脅迫下細胞過氧化使光合電子傳遞受阻，影響類囊體蛋白質(zhì)合成，導致葉片氣孔導度降低、CO2同化緩慢、葉片蒸騰速率和光合速率下降[33]。通過不同濃度外源施EBR處理，垂絲海棠Ci升幅顯著小于未施EBR處理，Pn、Gs顯著升高，說明EBR抑制葉肉細胞光合活性的過度降低，從而提高垂絲海棠的凈光合效率[32]。這與丁丹陽等[34]在煙草上的研究結(jié)果相一致。

細胞膜作為半透性膜，在細胞內(nèi)外之間的物質(zhì)交換和利用方面起著重要作用，相對電導率可評估植物受害程度[35]。干旱脅迫會破壞細胞膜的穩(wěn)定性，導致細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，相對電導率升高[36]。本試驗表明，隨脅迫時間的延長，REC呈升高趨勢，噴施外源EBR后，REC顯著下降，說明外源EBR對干旱脅迫引起的細胞膜透性變化有緩解作用，從而降低REC，這與安汶鎧等[37]在棉花抗旱上的研究結(jié)果相似。Pro含量通常被視作衡量植物抗逆性的指標[23]。本試驗研究表明，隨脅迫時間的延長，Pro含量急劇增加，可能是干旱脅迫引起蛋白質(zhì)分解，脯氨酸首先被游離出來[38]。通過不同濃度外源EBR處理，垂絲海棠葉片中Pro含量顯著高于對照，這可能是外源EBR直接參與植物生理生長過程而促進了Pro的合成。這與王雨婷等[14]在葡萄上的研究結(jié)論相同，說明外源EBR能進一步促進干旱脅迫下Pro的積累，且存在明顯的濃度效應。

逆境脅迫下會打破植物體內(nèi)ROS產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡，MDA含量受到影響，引發(fā)和加劇生物膜脂過氧化作用，從而對植物體造成傷害[39]。王麗君等[26]研究發(fā)現(xiàn)，噴施EBR可使干旱脅迫下烤煙葉片MDA含量下降52.55%。本研究表明，隨脅迫時間的延長，垂絲海棠葉片MDA含量呈上升趨勢，通過噴施外源EBR處理后，T2(8.2%)升幅顯著低于T1(22.9%)，表明通過外源EBR處理能有效緩解MDA含量升高，這與王雨婷等[14]在葡萄上的研究結(jié)果相同，可能是外源EBR作為抗氧化物質(zhì)清除植物體內(nèi)生成的ROS，抑制膜脂過氧化，減少MDA的大量積累，增強膜的穩(wěn)定性，從而緩解干旱脅迫對垂絲海棠幼苗的氧化傷害[26]。研究發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)三種抗氧化酶在預防ROS毒害方面具有重要作用[40-41]。本試驗研究表明，隨干旱脅迫時間的延長，SOD、POD、CAT活性呈先升后降的趨勢，可能是由于植物在初期自發(fā)調(diào)節(jié)生理活動來增強SOD、POD、CAT活性，及時清除活性氧，但若脅迫持續(xù)或加劇，植物不能進行自發(fā)調(diào)節(jié)，導致酶活性下降，植物氧化傷害加劇[14]。通過不同濃度外源EBR處理后，其葉片SOD、POD、CAT活性顯著高于未施EBR處理，且具有明顯的濃度效應，這可能是外源EBR增強了植物抗氧化系統(tǒng)的防御能力，維持了細胞內(nèi)ROS系統(tǒng)的代謝平衡，從而在一定程度上緩解了干旱脅迫引起的氧化損傷，這與李一萍等[42]在木薯中的研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

干旱脅迫下，外源2,4-表油菜素內(nèi)酯通過緩解葉綠素的降解，改善葉片的光合能力，通過穩(wěn)定抗氧化酶活性降低對膜透性損害、增加其穩(wěn)定性來緩解干旱脅迫，且具有濃度效應，0.2 mg·L-1處理效果最顯著。