不同產(chǎn)地大麥培曲微生物群落結(jié)構(gòu)演替研究

任婷月，李永強(qiáng)，王曉勇，韓 英，甄 攀

（山西杏花村汾酒廠股份有限公司技術(shù)中心，山西汾陽(yáng) 032205）

“曲為酒之骨”，大曲的質(zhì)量直接影響清香型白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量。大曲作為釀酒的糖化發(fā)酵劑，在釀酒過(guò)程中起著糖化、發(fā)酵、生香的作用，直接或間接影響酒體的品質(zhì)和風(fēng)格。清香型大曲是以大麥、豌豆為主要原料，采用自然接種，中溫發(fā)酵培養(yǎng)的一種粗酶復(fù)合制劑。大麥?zhǔn)乔逑阈桶拙拼笄闹饕?，不同產(chǎn)地來(lái)源的大麥由于淀粉含量、蛋白質(zhì)含量、千粒重、發(fā)芽率、內(nèi)生菌等指標(biāo)的不同，在一定程度上決定了它們制曲性能的不同，包括培曲過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的演替。目前，對(duì)于不同產(chǎn)地來(lái)源不同品種大麥理化特性及其制曲性能研究較少。

高通量測(cè)序技術(shù)可以對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全面的分析，可以快捷方便的讀取樣品中復(fù)雜的微生物結(jié)構(gòu)，具有明顯的先進(jìn)性和優(yōu)勢(shì)，是分析復(fù)雜多菌種樣品的首選方法。目前，高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用于各種分子生物學(xué)領(lǐng)域，包括人體微生物、水中微生物、土壤微生物群落研究等。相關(guān)大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的研究已有開(kāi)展，李曉然等運(yùn)用克隆文庫(kù)和焦磷酸測(cè)序?qū)Ψ诰拼笄魄蛢?chǔ)存階段的細(xì)菌和真菌多樣性進(jìn)行了研究；楊旭等采用高通量技術(shù)解析了白酒中高溫大曲細(xì)菌與真菌群落結(jié)構(gòu)；關(guān)凱樂(lè)采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)清香型白酒大曲和酒醅發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)演替進(jìn)行了研究。但是不同產(chǎn)地來(lái)源的原料對(duì)于大曲發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律影響的相關(guān)研究非常少。

本研究采用高通量測(cè)序方法跟蹤不同產(chǎn)地來(lái)源大麥培曲發(fā)酵過(guò)程，對(duì)比分析大曲發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律的變化，旨在為清香型白酒制曲原料大麥的選擇與豐富提供合理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

供試大麥：山西產(chǎn)地來(lái)源的冬性大麥品種，標(biāo)記為SY，對(duì)照品種為甘肅產(chǎn)地來(lái)源的清香型白酒制曲大麥品種，標(biāo)記為DZ。

山西冬性大麥與清香型白酒制曲大麥品種培曲發(fā)酵過(guò)程樣品：依據(jù)制曲工藝確定本研究取樣節(jié)點(diǎn)，選取大曲發(fā)酵天數(shù)0 d、2 d、4 d、9 d、13 d、18 d、24 d 作為取樣節(jié)點(diǎn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組分別標(biāo)記為：SY0、SY2、SY4、SY9、SY13、SY18、SY24 和DZ0、DZ2、DZ4、DZ9、DZ18、DZ24。隨機(jī)抽取3 塊具有節(jié)點(diǎn)代表性的大曲，無(wú)菌袋封裝，放入冰盒內(nèi)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品處理。

試劑及耗材：2×Taq Plus Master Mix，Vazyme；Agencourt? AMPure? XP(核 酸 純 化 試 劑 盒)：Beckman Coulter；KAPA Library Quantification Kit(文庫(kù)定量試劑盒)，KAPA；MiSeq? Reagent Kit v3(600 cycle)(PE300)，illumina。

儀器設(shè)備：Eppendorf 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，Eppendorf；電泳儀，Bio-Rad；ABI 9700 PCR 儀，ABI；凝膠電泳成像分析系統(tǒng)，UVP Bioimaging System；Agilent 2100 生物分析儀，Agilent；Labchip GX生物大分子分析儀，PerkinElmer；ABI Qpcr儀，美國(guó)ABI；高通量二代測(cè)序儀，illumina。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

稱取實(shí)時(shí)采集的大曲樣品50 g 溶于450 mL 無(wú)菌水中，振蕩混勻，吸取菌懸液50 mL 于離心管中，4 ℃下以13000 r/min 高速離心20 min，棄上清液，液氮速凍；準(zhǔn)備混合裂解液（800 μL 月桂酸鈉提取液+20 μL 溶菌酶+20 μL 溶壁酶）于2 mL 離心管，輕輕混勻，放置冰上；研缽以液氮預(yù)冷，將樣品置于研缽中，倒入液氮，迅速研磨至粉末級(jí)，期間定時(shí)加入液氮，防止研磨過(guò)程中樣品降解；將研磨好的粉末轉(zhuǎn)移到混合裂解液2 mL 離心管中，置于渦旋振蕩儀15～20 min；用移液槍向2 mL 離心管中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），緩慢搖勻；4 ℃下以12000 r/min 離心10 min 后取出，吸取上清液于新滅菌的2 mL 抽提試管中；向上述離心管中加入10 μL RNAase，37 ℃下放置30 min；加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），4 ℃、12000 r/min 離心10 min；吸取上清液于新滅菌的1.5 mL抽提試管中；向上述抽提管中加入0.7倍體積異丙醇，上下緩慢顛倒數(shù)次，置于-20 ℃下30 min；4 ℃、12000 r/min 離心20 min；倒掉上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次，真空干燥；加入20 μL的雙蒸水（ddHO）溶解30 min；-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肗ano-Drop 2000 型超微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

利用細(xì)菌核糖體16S rRNA基因的V3—V4高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，建立克隆文庫(kù)測(cè)序，相關(guān)引物對(duì)為338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。真核微生物擴(kuò)增的序列為非編碼rRNA 的ITS2 區(qū)域，相關(guān)引物對(duì)為:ITS3(5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。對(duì)不同節(jié)點(diǎn)樣品的通用引物進(jìn)行特異性設(shè)計(jì)，加入含有特異的8 個(gè)堿基的序列標(biāo)簽(barcode)進(jìn)行區(qū)分。PCR 反應(yīng)體系（總體系為25 μL）：12.5 μL 2xTaq Plus Master Mix、3 μL BSA（2 ng/μL）、1 μL Forward Primer(5 μM)、1 μL Reverse Primer(5 μM)、2 μL DNA（加入的DNA 總量為30 ng），最后加入5.5 μL dd HO 補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，28 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增目的條帶大小，并用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒純化。

1.2.3 MiSeq 測(cè)序

PCR 產(chǎn)物用于構(gòu)建微生物多樣性測(cè)序文庫(kù)，在北京奧維森基因科技有限公司使用Illumina Miseq PE300 高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行Paired-end 測(cè)序。測(cè)序原始序列上傳至NCBI 的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析處理

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)QIIME1（v1.8.0）軟件根據(jù)Barcode 序列拆分樣本，使用Pear（v0.9.6）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、拼接。去除打分值低于20，含有模糊堿基，引物錯(cuò)配序列。拼接后使用Vsearch（v2.7.1）軟件去除長(zhǎng)度小于230 bp 的序列，并根據(jù)Gold Database 數(shù)據(jù)庫(kù)用uchime 方法比對(duì)去除嵌合體序列。使用Vsearch（v2.7.1）軟件uparse 算法對(duì)優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行OTU 聚類（Operational Taxonomic Units），序列相似性閾值為97 %。每個(gè)OUT 都有一個(gè)代表序列，將代表性序列與物種的使用RDP 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，設(shè)置70%的置信度閾值，對(duì)每個(gè)代表性序列進(jìn)行物種注釋。利用QIIME1（v1.8.0）軟件進(jìn)行α多樣指數(shù)分析（包括Shannon、Simpson 和Chao1 等指數(shù)）?；谖锓N注釋及相對(duì)豐度結(jié)果，使用R（v3.6.0）軟件進(jìn)行物種組成柱狀圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋性曲線

稀釋性曲線可直接反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣本物種豐富度。采用對(duì)序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU 的數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線，當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。因此，通過(guò)作稀釋性曲線，可得出樣品的測(cè)序深度情況。試驗(yàn)組與對(duì)照組大曲發(fā)酵樣品的稀釋性曲線見(jiàn)圖1 和圖2。由圖1 和圖2 可知，曲線最終趨勢(shì)都趨于平坦，說(shuō)明此次測(cè)序深度能反映樣品中的物種信息。

圖1 細(xì)菌稀釋性曲線

圖2 真菌稀釋性曲線

2.2 Alpha多樣性分析

通過(guò)Alpha 多樣性分析可以知道微生物群落的豐富度和多樣性。Chao1 指菌種豐富度指數(shù)，用以估計(jì)群落中的OTU 數(shù)目，通常Chao1 指數(shù)越高，樣品中物種豐富度越大。Shannon（香農(nóng)指數(shù)）是用來(lái)估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，通常Shannon 指數(shù)值越大，表示樣本中物種多樣性越高，反之，樣品中的物種多樣性越低。由圖3可知，隨著大曲發(fā)酵的進(jìn)行，試驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)菌多樣性均表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)，且在晾霉階段與養(yǎng)曲階段多樣性變化幅度較大，出房曲的Chao1 指數(shù)與Shannon 指數(shù)均最高，說(shuō)明出房曲的細(xì)菌豐富度和多樣性最高。由圖4 可知，隨著大曲發(fā)酵的進(jìn)行，試驗(yàn)組與對(duì)照組的真菌多樣性均表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，且在晾霉階段的Chao1 指數(shù)與Shannon 指數(shù)最高，說(shuō)明該階段的真菌豐富度和多樣性最高。

圖3 細(xì)菌Alpha多樣性box圖

圖4 真菌Alpha多樣性box圖

2.3 細(xì)菌群落多樣性

基于屬水平，試驗(yàn)組和對(duì)照組在大曲發(fā)酵過(guò)程中群落結(jié)構(gòu)的演替情況見(jiàn)圖5，相對(duì)豐度小于1 %的并為other。

由圖5 可知，在細(xì)菌屬水平上，上霉階段試驗(yàn)組和對(duì)照組群落結(jié)構(gòu)有所差異。試驗(yàn)組中，乳桿菌屬（）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，占83 %；對(duì)照組中，乳桿菌屬（）占50.7 %、明串珠菌屬（）占17.3 %、擬桿菌屬（）占15.9 %、魏斯氏菌屬（）占3.8 %、歐文氏菌屬（）占3.5%。

圖5 基于屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布

在大曲發(fā)酵過(guò)程中，葡萄球菌屬（）相對(duì)豐度逐漸增加，在大火階段增加幅度較大，發(fā)酵后期趨于穩(wěn)定，可能與發(fā)酵溫度有關(guān)；乳桿菌屬（）從大火階段開(kāi)始相對(duì)豐度減少；短桿菌屬（）從大火階段開(kāi)始相對(duì)豐度增加；明串珠菌屬（）在大曲發(fā)酵過(guò)程中一直存在，在大火階段前相對(duì)豐度較高，在大火階段后相對(duì)豐度較低；歐文氏菌屬（）在大曲發(fā)酵過(guò)程中一直存在，在大火結(jié)束時(shí)豐度最高，試驗(yàn)組7.5%，對(duì)照組4.8%；醋酸桿菌屬（）在發(fā)酵過(guò)程中先增加后降低，在潮火結(jié)束時(shí)豐度最高，試驗(yàn)組5.6 %，對(duì)照組3.4 %，大曲出房時(shí)，醋酸桿菌屬相對(duì)豐度分別是試驗(yàn)組1.0%，對(duì)照組0.9 %；棒桿菌屬（）在大曲發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度逐漸增加，出房曲相對(duì)豐度分別是試驗(yàn)組1.8%，對(duì)照組1.4%。葡萄球菌屬（）為革蘭氏陽(yáng)性球菌，需氧或兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，多數(shù)葡萄球菌能分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；乳桿菌屬（）為革蘭氏陽(yáng)性，不生孢，兼性厭氧，化能異養(yǎng)菌，需要營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，發(fā)酵分解糖代謝，終產(chǎn)物中50 %以上是乳酸；短桿菌屬（）是放線菌目中一屬專性好氧、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性、無(wú)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性段桿狀細(xì)菌；明串珠菌屬屬于乳酸菌，利用葡萄糖進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生D 型乳酸、乙酸或醋酸；歐文氏菌屬（）屬于好氧或者兼性厭氧發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌，能分解果糖、半乳糖、D-葡萄糖和蔗糖產(chǎn)酸；醋酸桿菌屬（）是一類能使糖類和酒精氧化成醋酸等產(chǎn)物的短桿菌，革蘭氏陽(yáng)性，極端嚴(yán)格好氧，因此，在大火期之后，醋酸桿菌屬相對(duì)豐度降低。

出房曲樣本中相對(duì)豐度含量較高的依次是葡萄球菌屬（）、乳桿菌屬（）、短桿菌屬（）、一類未鑒定的屬（undentified）、棒桿菌屬（）、明串珠菌屬（）、短狀桿菌屬（）。試驗(yàn)組和對(duì)照組的區(qū)別在于對(duì)照組中鏈霉菌屬（）相對(duì)豐度較高，為4.4 %，試驗(yàn)組中鏈霉菌屬相對(duì)豐度為0.8 %；對(duì)照組中歐文氏菌屬（）相對(duì)豐度較高，為2.2 %，試驗(yàn)組相對(duì)豐度為0.7 %。鏈霉菌屬在發(fā)酵前期含量不大，且試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不大，從后火階段開(kāi)始，鏈霉菌屬相對(duì)豐度逐漸增大，試驗(yàn)組和對(duì)照組之間差異逐漸增大。有研究表明，大曲中的鏈霉菌產(chǎn)生的土味素(geosmin，GsM)是造成白酒土霉味的主要原因。造成該差異的原因需要進(jìn)一步探究。

2.4 真菌群落多樣性

基于屬水平，試驗(yàn)組和對(duì)照組在大曲發(fā)酵過(guò)程中群落結(jié)構(gòu)的演替情況見(jiàn)圖6，相對(duì)豐度小于1 %的并為other。

圖6 基于屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)分布

由圖6 可知，在真菌屬水平上，臥曲階段試驗(yàn)組和對(duì)照組群落結(jié)構(gòu)有所差異。試驗(yàn)組中，復(fù)膜孢酵母屬（）相對(duì)豐度最高，為61.5 %，其次是一類未鑒定的屬，相對(duì)豐度為33.5 %；對(duì)照組樣本物種豐富度較高，相對(duì)豐度由高到低依次是根霉屬（）28.0%、復(fù)膜孢酵母屬（）21.4 %、嗜熱子囊菌屬（）14.5 %、12.1 %、畢赤酵母屬（）7.4%、曲霉屬（）3.4%。

發(fā)酵過(guò)程中，復(fù)膜孢酵母屬（）相對(duì)豐度先增高后降低，之后趨于穩(wěn)定，上霉階段，復(fù)膜孢酵母屬（）相對(duì)豐度最高；上霉結(jié)束后，復(fù)膜孢酵母屬（）相對(duì)豐度逐漸減少，畢赤酵母屬（）相對(duì)豐度逐漸增加；根霉屬（）在發(fā)酵前期樣品中豐度較高，后期逐漸較少；在大曲發(fā)酵過(guò)程中先增高后降低，在晾霉階段相對(duì)豐度最高，分別是試驗(yàn)組6.5 %，對(duì)照組19.3 %。復(fù)膜孢酵母屬屬于酵母菌，能產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶，且所產(chǎn)的酶都具有較高的活性，還具有一定的產(chǎn)香產(chǎn)酯能力，在釀酒工業(yè)中具有重要地位；畢赤酵母屬是工業(yè)發(fā)酵中釀酒酵母的有益補(bǔ)充，廣泛存在于發(fā)酵食物和水果中，能增加食品或飲料的風(fēng)味，同時(shí)，具有多重耐受性和獨(dú)特的碳氮代謝，在生物能源領(lǐng)域具有巨大潛力。

在真菌屬水平上，出房曲樣本中畢赤酵母屬（）相對(duì)豐度最高，試驗(yàn)組64.6 %，對(duì)照組64.5 %；其次是復(fù)膜孢酵母屬（），試驗(yàn)組29.4%，對(duì)照組28.1%。試驗(yàn)組和對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異。

3 結(jié)論

采用Illumina Miseq 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同大麥品種培曲過(guò)程中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律進(jìn)行了分析。

從細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析來(lái)看，隨著大曲發(fā)酵的進(jìn)行，試驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)菌多樣性均表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)，且在晾霉階段與養(yǎng)曲階段多樣性變化幅度較大，出房曲的細(xì)菌豐富度和多樣性最高。雖然上霉階段二者的細(xì)菌多樣性有所差異，但是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，二者群落結(jié)構(gòu)逐漸趨于相似。在細(xì)菌屬水平上，上霉階段試驗(yàn)組和對(duì)照組群落結(jié)構(gòu)有所差異，對(duì)照組細(xì)菌多樣性較高。在發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)菌多樣性呈逐漸增加的趨勢(shì)，試驗(yàn)組和對(duì)照組出房曲樣本中相對(duì)豐度含量較高的依次是葡萄球菌屬（）、乳桿菌屬（）、短桿菌屬（）、棒桿菌屬（）和一類未能鑒別的屬等。試驗(yàn)組和對(duì)照組的區(qū)別在于對(duì)照組中鏈霉菌屬（）相對(duì)豐度較高，為4.4 %，試驗(yàn)組中鏈霉菌屬相對(duì)豐度為0.8%。造成該差異的原因需要進(jìn)一步探究。

從真菌群落結(jié)構(gòu)分析來(lái)看，隨著大曲發(fā)酵的進(jìn)行，試驗(yàn)組與對(duì)照組的真菌多樣性均表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，且在晾霉階段的Chao1 指數(shù)與Shannon 指數(shù)最高，說(shuō)明該階段的真菌豐富度和多樣性最高。雖然臥曲階段二者的真菌多樣性有所差異，但是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，二者群落結(jié)構(gòu)逐漸趨于相似。在真菌屬水平上，臥曲階段試驗(yàn)組和對(duì)照組群落結(jié)構(gòu)有所差異，對(duì)照組樣本物種多樣性較高。在真菌屬水平上，出房曲樣本中畢赤酵母屬（）相對(duì)豐度最高，試驗(yàn)組64.6 %，對(duì)照組64.5 %；其次是復(fù)膜孢酵母屬（），試驗(yàn)組29.4%，對(duì)照組28.1%。試驗(yàn)組和對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異。

研究結(jié)果表明，大曲發(fā)酵的細(xì)菌群落變化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)是大火階段，菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化。乳桿菌屬相對(duì)豐度大幅減少，葡萄球菌屬相對(duì)豐度大幅增加；歐文氏菌屬、醋酸桿菌屬在大火階段相對(duì)豐度最高，大火階段之后逐漸減少；短桿菌屬?gòu)拇蠡痣A段開(kāi)始，相對(duì)豐度逐漸增加。原因可能是大火階段溫度較高，且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，曲塊逐漸由有氧環(huán)境變?yōu)闊o(wú)氧環(huán)境，造成了好氧菌相對(duì)豐度的降低，厭氧菌相對(duì)豐度的增加。隨著大曲發(fā)酵的進(jìn)行，從大火階段開(kāi)始，大曲真菌群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，且上霉的主要真菌屬是復(fù)膜孢酵母屬。雖然試驗(yàn)組與對(duì)照組在臥曲階段細(xì)菌與真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，但是隨著大曲發(fā)酵的進(jìn)行，二者的細(xì)菌與真菌群落結(jié)構(gòu)逐漸趨于一致，大曲出房時(shí)，試驗(yàn)組與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。由此表明，在大曲發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵環(huán)境對(duì)大曲發(fā)酵的影響大于原料中的微生物。