醬香堆積酒醅中扣囊復膜酵母的分離鑒定及酒精發(fā)酵性能研究

龍亞飛，唐佳代，王 帥，呂相華，吳德光，2

（1.茅臺學院釀酒工程系，貴州仁懷 564500；2.天津科技大學生物工程學院，天津 300000）

醬香型白酒具有醬香突出，香氣優(yōu)雅細膩，口味醇厚，回味悠長，空杯留香持久的獨特風格。醬香酒的特征在一定程度上是由其獨特的生產工藝（即高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫流酒和生產周期長、貯存期長）、氣候和微生物多樣性決定的。其中，高溫堆積是醬香型白酒特有的釀造工藝，大量釀造環(huán)境中的微生物在此過程中富集，為窖池發(fā)酵提供了大量的微生物儲備、酶類資源和香味物質及其前體物質。近年來，“醬酒熱”仍在持續(xù)，2020 年，以貴州茅臺酒為代表的醬香型白酒凈利潤約為455 億元，利潤率達到46.38%。扣囊復膜酵母（），又稱擬內孢霉，是子囊菌門（Ascomycota）酵母亞門(Saccharomycotina)下酵母綱(Saccharomycetes)酵母目(Saccharomycetales)酵母科(Saccharomycetace)復膜酵母屬()的一個種。該菌株是多種酒曲和酒醅中的主要酵母之一，產淀粉酶、酸性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶，所產的酶都具有較高的活性，在釀酒工業(yè)中，這些酶活性決定了扣囊復膜酵母能夠以各種原料為底物，進行發(fā)酵產酒精。不少研究發(fā)現扣囊復膜酵母能產香產酯并利用丟糟生產單細胞蛋白飼料。白酒糟是釀酒行業(yè)最大的副產物，產量巨大且營養(yǎng)豐富，是一種很好的生物質資源，白酒酒糟中還含有一些殘余淀粉。因此，研究醬香堆積酒醅中扣囊復膜酵母及該菌利用酒糟酒醅混合液發(fā)酵產酒精能力十分有價值。

本研究采用平板分離篩選醬香堆積酒醅中的扣囊復膜酵母菌，并通過分子生物學法對其進行鑒定，探索該菌種利用酒糟及酒醅混合液產酒精的最佳工藝條件，為該菌種的進一步開發(fā)應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 酒醅及酒糟

酒醅取自貴州省仁懷市紅土地釀酒作坊第三輪次堆積酒醅；酒糟取自貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂、乙醇、D（+）-麥芽糖、硫酸鎂·7HO，國藥集團化學試劑有限公司；可溶性淀粉、葡萄糖、α-乳糖、磷酸二氫鉀，天津市科密歐化學試劑有限公司；蔗糖、硫酸銨、氯化鈣·HO、氯化鈉，成都金山化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD 培養(yǎng)基：每1000 mL 中，酵母浸膏10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，瓊脂20 g，pH值自然。

1.1.4 儀器設備

本研究用到的儀器及設備見表1。

表1 儀器設備及規(guī)格

1.2 實驗方法

1.2.1 扣囊復膜酵母的分離鑒定

（1）分離純化

稱取醬香型堆積酒醅1.0 g，加入到99 mL 帶玻璃珠的無菌水中，搖床振蕩5 min 進行10 倍系列稀釋（10、10、10、10、10、10、10、10）。各取1 μL 稀釋液涂布于YPD 平板上進行涂布分離，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d 后挑取形態(tài)不同的單菌落，多次在YPD 平板上劃線純化，獲得純培養(yǎng)的菌株。

（2）形態(tài)學鑒定

將純化獲得的扣囊復膜酵母接入YPD 固體培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d，觀察其菌落形態(tài)；將純化獲得的扣囊復膜酵母接種到YPD 液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在12 h、24 h、36 h、48 h 時分別取樣，用顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍照。

（3）分子鑒定

菌落形態(tài)和細胞形態(tài)鑒定后獲得的酵母菌株，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，以NL1和NL4 為上下游引物，擴增26S rDNA 目標基因對菌株進行分子鑒定。測序結果在NCBI數據庫中進行同源性比對分析。

1.2.2 單因素發(fā)酵條件對酒精產量的影響研究

為探究發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、菌株接種量及酒糟與酒醅比在扣囊復膜酵母發(fā)酵過程中對酒精產量的影響，將篩選出的扣囊復膜酵母菌株（S-9）按照不同發(fā)酵條件（發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、菌株接種量）接種于不同比例的酒糟、糟醅混合液中，通過測量酒精的產量來確定各個單因素的最佳條件。酒精含量測定方法采用氣相色譜法：美國安捷倫科技有限公司，色譜柱：CP-Wax57CB(50 m×0.25 mm×0.2 μm)聚乙二醇石英毛細管柱；進樣口溫度240 ℃；檢測器溫度280 ℃；進樣量1 μL；載氣流量1.0 mL/min；分流比15∶1；氫氣（H）∶空氣（O）∶尾吹氣（N）=400∶40∶25。升溫程序：初溫40 ℃，保持5 min；以5 ℃/min 升至110 ℃，以20 ℃/min 升至280 ℃，保持30 min。

1.2.3 正交實驗

在單因素試驗的基礎上，選取菌種接種量、溫度、時間、糟醅比4 個因素，進行4 因素3 水平正交實驗，進一步考察各因素對酒精產量的影響，正交條件如表2所示。

表2 扣囊復膜酵母產酒精四因素三水平正交條件表

2 結果與分析

2.1 分離鑒定

利用YPD 作為培養(yǎng)基對扣囊復膜酵母進行菌株篩選，在平板上28 ℃培養(yǎng)2 d，經菌落形態(tài)以及菌株鏡檢觀察，共篩選分離到9 株（分別命名為S-1、S-2、S-3、S-4、S-5、S-6、S-7、S-8、S-9）具有酵母特征的菌株（見圖1、圖2）。

圖1 酵母菌初篩

圖2 扣囊復膜酵母的菌落和細胞形態(tài)特征

在形態(tài)學觀察的基礎上，本研究對篩選出的9株菌進行分子水平鑒定，PCR 產物測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，所得序列在NCBI數據庫中進行Blast 同源性比對，比對結果見表3，確定5株為扣囊復膜酵母。

表3 酵母菌株26S rDNA鑒定結果

2.2 單因素發(fā)酵條件對扣囊復膜酵母酒精產量的影響

本研究選取4 個因素，包括菌株接種量（10～10個/mL）、發(fā)酵溫度（24～32 ℃）、發(fā)酵時間（24～120 h）、糟醅比（1∶1～1∶5），對篩選到的S-9 菌株發(fā)酵產酒精條件做了進一步研究。菌株的接種量是影響酒精產量的重要因素之一，如圖3A 所示，當扣囊復膜酵母的接種量為10個/mL 時，菌株的酒精產量最高，達到2480 ng/μL。在考察發(fā)酵溫度對酵母菌產酒精能力的影響時發(fā)現（見圖3B），菌株S-9的酒精產量隨著溫度升高先上升、后降低，這可能與扣囊復膜酵母最適生長溫度有關，溫度偏高或偏低對菌株的發(fā)酵產酒精均有明顯的抑制作用，在28 ℃時產量最高，達到3594 ng/μL。發(fā)酵時間不同程度上影響著扣囊復膜酵母菌株的酒精產量，如圖3C 所示，當發(fā)酵時間為96 h 時，S-9 菌株酒精產量達到最高值，為2738 ng/μL，隨著發(fā)酵時間延長可能酒精揮發(fā)了，導致酒精產量降低。糟醅比對扣囊復膜酵母產酒精影響比較大（圖3D），這可能與糟醅混合液中淀粉成分的含量有關，研究發(fā)現，隨著酒醅添加量的增加，酒精產量先增加后減少，可能是扣囊復膜酵母接種量不夠，糟醅比1∶3是最適合的底物配比，酒精產量高達3455 ng/μL。

圖3 單因素發(fā)酵條件對扣囊復膜酵母菌株酒精產量的影響

2.3 正交實驗結果

根據單因素實驗結果，選取4 個因素各3 個水平進行菌株產酒精能力研究，包括A 菌株接種量（10個/mL、10個/mL、10個/mL）、B 發(fā) 酵 溫 度（26 ℃、28 ℃、30 ℃）、C發(fā)酵時間（72 h、96 h、120 h）、D 糟醅比（1∶2、1∶3、1∶4）進行正交實驗，以確定菌株S-9 產酒精的最優(yōu)發(fā)酵條件，正交表見表2。菌株S-9 的產酒精條件結果和極差分析見表4，結果表明，4 個影響因素中糟醅比對酒精的產量影響程度最大，4 個因素的影響程度由高到低排序為糟醅比＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞菌株接種量。根據實驗結果綜合分析，最優(yōu)組合為ABCD，即接種量為10個/mL，發(fā)酵溫度為26 ℃，發(fā)酵時間為72 h，糟醅比為1∶2，此條件下酒精的產量為3672 ng/μL。

表4 S-9菌株產酒精條件的正交實驗結果

3 結論

本研究通過菌落形態(tài)、細胞形態(tài)分析從醬香堆積酒醅中分離出9 株酵母菌，經分子鑒定，確定5株為扣囊復膜酵母。對其中1 株進行酒精發(fā)酵研究，單因素實驗最佳條件為：發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時間96 h，接種扣囊復膜酵母量10個/mL，最佳糟醅比1∶3。正交實驗的最佳組合為ABCD，即接種量為10個/mL，發(fā)酵溫度為26 ℃，發(fā)酵時間為72 h，糟醅比為1∶2。為進一步研究扣囊復膜酵母在醬香白酒生產及白酒糟回收利用中的應用提供參考。