洋河濃香型大曲產(chǎn)香細菌的篩選、鑒定及香氣成分分析

陳桂芳，王曉慧，趙 琦，邵高超，董大偉

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷 223800）

白酒是我國民族傳統(tǒng)產(chǎn)品，歷史悠久、風格獨特，白酒的質(zhì)量決定了一個企業(yè)的競爭力與生命力。洋河濃香型大曲由于其特殊的制曲工藝，網(wǎng)羅了許多產(chǎn)香微生物，形成了特定的微生物區(qū)系，這些產(chǎn)香微生物對白酒風味的形成起著至關(guān)重要的作用。隨著研究的深入，濃香型大曲產(chǎn)香功能菌在提高白酒的品質(zhì)、豐富白酒風味等方面取得了較好的應(yīng)用效果。本研究從濃香型大曲中分離篩選產(chǎn)香細菌，對篩選得到的菌株進行高通量測序鑒定和產(chǎn)香性能研究，在探索不同微生物產(chǎn)香特性的同時，以期篩選出呈香效果較好的微生物種屬，為洋河濃香型大曲質(zhì)量的提升和制曲機理的研究提供一定的理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

1.1.1 大曲樣品

選取洋河酒廠制曲一、二車間的出房曲，從感官、微生物和理化指標等維度進行綜合評價，選取綜合質(zhì)量較好的優(yōu)等大曲作為篩選樣本，粉碎后過40 目篩，采用四分法縮至200 g，裝于無菌袋，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗耗材

細菌分離、保藏培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。

細菌種子培養(yǎng)基：LB肉湯。

小麥固體培養(yǎng)基：取200 g 適度粉碎的小麥于500 mL 三角瓶中，調(diào)節(jié)小麥原料含水量36 %～38.5%。

1.1.3 儀器設(shè)備

分析天平（±0.0002 g），型號AR224CN，上海奧豪斯公司；電熱恒溫水浴鍋（±0.1 ℃），型號DKS24，上海蘇達實驗儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（±0.1 ℃），型號LDZW-80KCS，上海申安醫(yī)療器械廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱（±0.1 ℃），型號DNP-9162，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SW-CJ-1F 超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；燒杯；三角瓶；發(fā)酵栓；培養(yǎng)皿等。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的分離、純化

采用稀釋涂布平板法對細菌進行分離篩選：準確稱取2 g 大曲樣品，置入裝有18 mL 無菌水的三角瓶中，振蕩30 min。用移液槍吸取1 mL 振蕩均勻的菌懸液，置入裝有9 mL 無菌水的試管中，振蕩均勻，以此10倍逐級稀釋至10。

取10、10、103 個稀釋度的菌懸液分別在LB 培養(yǎng)基上進行平板涂布，于37 ℃下倒置培養(yǎng)24 h。長出菌落后，選取具有典型細菌特征的菌落進行劃線分離、純化，鏡檢后編號，接種于斜面試管中保藏，并送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行菌株鑒定。

1.2.2 固態(tài)產(chǎn)香實驗

將分離出的細菌菌株分別接入LB肉湯中，37 ℃搖床培養(yǎng)16 h 后，調(diào)節(jié)種子液濃度至10個/mL。按10%接種量接種于滅菌后的小麥固體培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)9 d。

1.2.3 產(chǎn)香性能測定

對各細菌菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進行感官評價。對發(fā)酵產(chǎn)物香味良好的菌株進行揮發(fā)性成分的鑒定分析。

1.2.3.1 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物感官評價

由6 名聞香專業(yè)人員組成評價小組，對各菌株發(fā)酵后的樣品進行外觀、香味評價。

1.2.3.2 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性成分檢測

根據(jù)參考文獻修改。

固相微萃取條件：取3 g 發(fā)酵產(chǎn)物于頂空瓶中，放入40 ℃左右的孵化池，再加入乙酸薄荷酯內(nèi)標20 μL（100 mg/L）；60 ℃頂空瓶中預熱10 min 后插入固相萃取頭吸附40 min，萃取結(jié)束后立即插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進樣口熱解吸5 min。

色譜條件：HP-FFAP 石英毛細管柱（50 m×0.20 mm×0.33 μm）；升溫條件：柱溫箱溫度50 ℃保持3 min，以3 ℃/min 升溫至170 ℃，再以6 ℃/min升溫至230 ℃保持5 min，總檢測時間50 min；載氣流速1.5 mL/min；分流比設(shè)為不分流；質(zhì)量掃描范圍30～550 amu，檢索NIST 庫，選取匹配度大于800 的物質(zhì)，采用內(nèi)標法計算化合物的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲樣本的篩選

從制曲車間選取3 種感官較好且微生物和理化指標適中的大曲進行粉碎并混合后作為篩選樣本。大曲的感官和理化指標結(jié)果見表1。選取的大曲篩選樣本感官方面包含了斷面發(fā)酵好、火圈勻凈和菌絲飽滿等特征，理化指標均在優(yōu)等曲指標范圍，富含霉菌、酵母和細菌等功能菌。

表1 中高溫大曲的感官及理化指標

2.2 產(chǎn)香微生物的篩選及鑒定

挑取不同形態(tài)特征的菌落進行劃線，分離單菌落，記錄單菌落的特征，并對分離菌株鑒定結(jié)果進行匯總，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，本次篩選出共計8株菌株，均為芽孢桿菌屬，經(jīng)高通量測序分析，分別為貝萊斯芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、空氣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、短芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。其中貝萊斯芽孢桿菌的菌落特征主要表現(xiàn)為圓形，菌落較大，有凸起，無光澤，邊緣不整齊；地衣芽孢桿菌的菌落特征表現(xiàn)為不規(guī)則圓形，邊緣規(guī)則，透明有光澤；枯草芽孢桿菌在菌落形態(tài)上表現(xiàn)為圓形或不規(guī)則圓形，菌落大小適中，沒有光澤，邊緣呈絨毛狀；其余芽孢桿菌多表現(xiàn)為菌落呈微黃、黃色或乳黃色，菌落較小，邊緣較整齊，表面濕潤有光澤。

表2 產(chǎn)香芽孢桿菌菌落形態(tài)及鑒定結(jié)果

2.3 產(chǎn)香微生物的產(chǎn)香驗證實驗

8 株芽孢桿菌的產(chǎn)香試驗結(jié)果如表3 所示。結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、短芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌在模擬發(fā)酵過程中產(chǎn)生明顯的褐變反應(yīng)。褐變反應(yīng)與形成醬香型酒的風格質(zhì)量有著十分密切的聯(lián)系，是產(chǎn)生醬香物質(zhì)的基礎(chǔ)，因此褐變反應(yīng)控制得當，可以賦予大曲獨特的風味。褐變反應(yīng)的菌株產(chǎn)香效果中多含有醬香味；沒有發(fā)生褐變反應(yīng)的菌株產(chǎn)香效果較差，多為霉味、餿味、汗臭味、氨味等異雜味。

表3 8株芽孢桿菌產(chǎn)香試驗結(jié)果

貝萊斯芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、空氣芽孢桿菌整體產(chǎn)香效果較差，主要以異雜味為主，且褐變反應(yīng)不突出；地衣芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌和短芽孢桿菌雖產(chǎn)醬香明顯，但含有酸味、臭味等異雜味；枯草芽孢桿菌呈香效果最好，以甜醬香為主且香氣濃郁，是本次篩選中最理想的產(chǎn)香細菌。

2.4 產(chǎn)香微生物的香氣成分分析

對菌株X-8 的發(fā)酵產(chǎn)物進行感官跟蹤，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵基質(zhì)在外觀上從小麥原色至深褐色，氣味從小麥原味到香味微弱、有醬味，最終呈現(xiàn)濃郁的香味，這一現(xiàn)象與明紅梅等的研究結(jié)果相一致。菌株X-8 的發(fā)酵產(chǎn)物的香氣成分分析見表4 和表5，發(fā)酵產(chǎn)物中的香氣成分共有65種，主要為吡嗪類、醇類和酮類，其中吡嗪類物質(zhì)的相對含量最高，達60.8 %，其次為醇類，達21.4 %，酸類和酯類物質(zhì)較少，不產(chǎn)生醛類和胺類物質(zhì)。吡嗪類物質(zhì)具有焙烤香、咖啡和烤面包香，在大曲香味中貢獻較高；醇類物質(zhì)中的2,3-丁二醇主要產(chǎn)生似黃油、乳脂、水果香，是酒類中極少數(shù)呈香的多元醇。發(fā)酵產(chǎn)物中含有的2-甲氧基-苯酚、2-羥基-3-己酮、2-庚酮等也是大曲和白酒的主要香味成分。因此，枯草芽孢桿菌X-8 是濃香型大曲中1株較為理想的產(chǎn)香功能細菌。

表4 X-8發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)匯總表

表5 X-8發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)測定

3 結(jié)論

通過稀釋涂布平板法及高通量測序成功篩選到一株產(chǎn)香效果較好的枯草芽孢桿菌X-8。通過單菌株產(chǎn)香試驗感官聞香，發(fā)現(xiàn)X-8 香味特征表現(xiàn)為濃郁的甜醬香味。利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對該菌株發(fā)酵后的香氣成分進行分析，發(fā)現(xiàn)該菌株發(fā)酵產(chǎn)物中共有65 種香氣成分，主要為吡嗪類和醇類，這兩類物質(zhì)也是濃香型大曲及白酒的重要香味成分。因此，枯草芽孢桿菌X-8是濃香型大曲中一株較為理想的產(chǎn)香功能細菌。