miR-205-5p通過抑制UHRF1表達促進大鼠周圍神經(jīng)再生的研究進展

張 娜，左曉霜，王文慧

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科,西安 710032；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院腫瘤科，西安 710032

神經(jīng)損傷可導(dǎo)致嚴重殘疾，對患者的活動及生活質(zhì)量產(chǎn)生影響。與中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同，周圍神經(jīng)具有再生能力，這取決于病變的性質(zhì)和嚴重程度。外周神經(jīng)損傷后，損傷部位的神經(jīng)纖維碎片和中斷的軸突可能阻礙神經(jīng)的再生，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[1]。多項研究表明，顯微手術(shù)器械的發(fā)展和新的縫合技術(shù)可修復(fù)患者的周圍神經(jīng)損傷[2- 3]，但目前仍沒有任何藥物能夠克服神經(jīng)損傷后軸突再生功能的局限性[4]。因此，迫切需要一種新的治療外周神經(jīng)損傷的策略。

MicroRNAs (miRNAs)是一種內(nèi)源性編碼的小RNA，研究顯示其是一類重要的新型分子開關(guān)，通過作用于靶基因的3’端，促進蛋白質(zhì)編碼基因(mRNA)降解和(或)抑制蛋白翻譯，作為基因轉(zhuǎn)錄后的重要調(diào)節(jié)因子，在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中發(fā)揮作用[5]。miRNAs的產(chǎn)生是通過發(fā)育和再生的生物信號來調(diào)控的，這些信號與經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合，協(xié)同放大廣泛的生物和細胞行為的改變，包括神經(jīng)發(fā)育、細胞存活和突觸重排。而且，神經(jīng)系統(tǒng)疾病與miRNA改變之間也存在相關(guān)性[6]。盡管針對miRNA進行了大量研究， 但相對于mRNA，目前人們對miRNA的功能認識還十分有限，尤其在神經(jīng)再生過程中的作用還鮮有報道。大量研究表明，miR-205-5p在乳腺癌、胃癌和子宮內(nèi)膜癌中具有抑制細胞增殖和侵襲的作用[7-9]，然而，miR-205-5p與周圍神經(jīng)損傷后再生的關(guān)系尚不清楚。

UHRF1是一種分子量為90kd的多結(jié)構(gòu)域蛋白，在調(diào)控表觀遺傳、機體生長、發(fā)育及腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究報道，UHRF1在調(diào)節(jié)結(jié)腸T細胞和造血干細胞的增殖、存活和分化中具有重要作用[10-11]，敲除小鼠胚胎中的UHRF1會表現(xiàn)出極端的生長遲緩。此外，UHRF1可以促進大腦皮層神經(jīng)干細胞發(fā)育[12- 13]，并且在周圍神經(jīng)損傷后表達量明顯增高，能促進軸突再生[14]。然而，在周圍神經(jīng)損傷情況下，miR-205-5p是否通過UHRF1發(fā)揮促進神經(jīng)軸突再生的作用，目前鮮有報道。因此，該研究旨在確定miR-205-5p促進大鼠坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)的作用，希望為周圍神經(jīng)損傷提供了一種新的基于miRNA療法。

材料與方法

1 主要材料

1.1實驗動物 選取0～2d齡SD大鼠10只，質(zhì)量5～6g，平均5.7g，用于提取嗅鞘細胞和背根神經(jīng)節(jié)；選取雄性SD大鼠30只用于體內(nèi)實驗，6～8周齡，質(zhì)量200～240g，平均214.6g。大鼠均購置于空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，本實驗經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(KY20172005-1)。

1.2實驗主要試劑 胞嘧啶(Sigma Aldrich公司，美國)；B27(Gibco公司，美國)；人神經(jīng)生長因子(hNGF,R&D Systems公司，美國)；L-谷氨酰胺(Gibco公司，美國)；胰蛋白酶(北京Solarbio公司，中國)；胎牛血清(Gibco公司，美國)；DF12(DMEM和Ham’s F12的1∶1混合物)培養(yǎng)基(HyClone公司，美國)；多聚左旋賴氨酸(poly-L-lysine，PLL)(Sigma公司，美國)；青霉素-鏈霉素(北京Solarbio公司，中國)；磷酸鹽緩沖鹽水(HyClone公司，美國)；TRIzol(Invitrogen公司，美國)；實時熒光定量PCR試劑盒GoTaq@qPCR Master(Promega公司，美國)；雙熒光素酶報告檢測試劑盒(Promega公司，美國)；雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)(Promega公司，美國)；miRNA-205-5p抑制物，miRNA-205-5p-mimics和NC-mimics(上海吉凱基因公司，中國)；UHRF1-siRNA和NC-siRNA(上海吉凱基因公司，中國)；Lipofect AMINE 3000(上海銳賽生物公司，中國)；Lipo6000TM(上海Beyotime公司，中國)；miRNeasy Mini試劑盒和miRNeasy FFPE試劑盒 (Qiagen公司，德國)；TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems公司，德國)；RAPI裂解緩沖液(上海Beyotime公司，中國)；蛋白定量試劑盒(上海Beyotime公司，中國)；UHRF1兔單克隆抗體(Abcam公司，美國)；β-actin鼠單克隆抗體(Abcam公司，美國)；β-tubulin-Ⅲ兔單克隆抗體(CST公司，美國)；鼠抗NF160單克隆抗體(Abcam公司，美國)；山羊抗兔綠色熒光二抗、山羊抗鼠紅色熒光二抗 (江蘇康為世紀公司，中國)；山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(江蘇康為世紀公司，中國)。

1.3實驗主要儀器 臺式離心機(湖南湘儀公司，中國)；培養(yǎng)瓶(廣州杰特生物，中國)；電泳儀(BioRad公司，美國)；轉(zhuǎn)膜儀(BioRad公司，美國)；熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)；熒光定量PCR儀(BioRad公司，美國)；全自動定量繪圖酶標儀(BioTek公司，美國)。

2 實驗方法

2.1新生SD大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的提取和純化 將出生0～2d的SD大鼠置入冰凍的75%乙醇缸內(nèi)消毒處死，隨后轉(zhuǎn)移至超凈臺中，利用體視顯微鏡摘取背根神經(jīng)節(jié)，去除神經(jīng)周圍組織后用剪刀將神經(jīng)剪碎至1mm3小塊，然后用0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅳ型膠原酶消化60min，然后在含有2%的B27、50ng/mL的人神經(jīng)生長因子(hNGF)、2mM的L-谷氨酰胺和1%的青鏈霉素混合液的神經(jīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。差速貼壁純化后，用10μmol/L的胞嘧啶處理48 h去除其中的成纖維細胞。然后培養(yǎng)基被不含胞嘧啶的神經(jīng)基培養(yǎng)基替代，用于后續(xù)實驗。

2.2成年SD大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型的構(gòu)建 選用SD大鼠30只，分為損傷組(15只)和對照組(15只)，腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉，切開左后肢的皮膚和鈍性分裂下面的組織，小心地暴露出左側(cè)坐骨神經(jīng)。在坐骨神經(jīng)上靠近背根神經(jīng)節(jié)一端距離坐骨神經(jīng)分叉處1cm的位置用止血鉗擠壓10s，然后將肌肉和表皮進行縫合，損傷和對照組的SD大鼠同時暴露坐骨神經(jīng)，但對照組不對坐骨神經(jīng)進行擠壓，為3d后提取神經(jīng)元做準備。

2.3成年SD大鼠的DRG神經(jīng)元的提取和神經(jīng)長度分析 實驗方法2.2中預(yù)處理損傷及對照組的SD大鼠中分離出L4的背根神經(jīng)節(jié)，分別從對照組和損傷組取部分DRG組織用于檢測miR-205-5p的表達情況。將取出的其他DRG組織剪碎后，置于含10mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HBSS-H)的Hanks平衡鹽溶液中，37℃下連續(xù)應(yīng)用含有木瓜蛋白酶(15U/mL)和膠原酶(1.5mg/mL)的HBSS-H溶液處理背根神經(jīng)節(jié)，用100 μm的細胞濾網(wǎng)過濾細胞。然后重懸于含有2%的B27(Gibco)、50ng/mL的hNGF、2mM的L-谷氨酰胺和1%的青鏈霉素混合液的神經(jīng)培養(yǎng)基中，并在含有聚d-賴氨酸/層黏連蛋白涂層的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)。成年DRG神經(jīng)元培養(yǎng)20h，用β-III-tubulin(1∶200)染色。觀察DRG軸突生長情況，測量其最長神經(jīng)軸突長度，并計算軸突的總長度。

2.4實時熒光定量PCR檢測miR-205-5p的表達水平 細胞中總RNA提取使用miRNeasy Mini試劑盒,組織中總RNA提取使用miRNeasy FFPE試劑盒。使用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)制造商的說明，使用TaqMan MicroRNA檢測系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng))測量miR-205-5p的表達情況。RNU6B(MicroRNA內(nèi)參)被用作內(nèi)部對照,使用比較閾值(Ct)法計算相對表達。

2.5實時熒光定量PCR檢測UHRF1的表達水平 取適量背根神經(jīng)節(jié)細胞，加入1mL TRIzol進行勻漿，加入200μL氯仿萃取并離心取上清液，再加入等體積異丙醇，-20 ℃靜置過夜沉淀RNA；離心除去上清液，用75%乙醇溶液洗滌沉淀后，將RNA溶解于無酶的去離子水中。

利用酶標儀檢測提取的RNA的濃度和純度，利用GoScript反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)獲得cDNA，之后使用Promega GoTaq@qPCR Master Mix行實時Q-PCR分析，以2-ΔΔCt值表示目的基因的相對表達量，引物序列見表1。

2.6miR-205-5p對DRG神經(jīng)元的影響 將提取的新生SD大鼠DRG神經(jīng)元分為4組，一組用PBS處理，其余三組使用脂質(zhì)體法(Lipofect AMINE 3000)分別轉(zhuǎn)染50nM的miR-205-5p-mimic、抑制物和miRNA-NC。轉(zhuǎn)染流程參閱試劑盒提供的操作說明， 每組細胞設(shè)置4個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后細胞在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24h，用β-III-tubulin(1∶200)染色。觀察DRG神經(jīng)元軸突生長情況，測量其最長神經(jīng)軸突長度。

2.7熒光素酶報告實驗檢測 miR-205-5p與UHRF1基因的相關(guān)性 通過Starbase網(wǎng)站(starbase.sysu.edu.cn/)分析miR-205-5p的相關(guān)靶基因，發(fā)現(xiàn)UHRF1基因可能是miR-205-5p的靶基因。

熒光素酶報告檢測按照制造商的方案進行。293T細胞(工具細胞，具有易轉(zhuǎn)染特點)被接種于24孔板中，使用Lipo6000TM將熒光素酶報告基因UHRF1-3’-UTR-WT或UHRF1-3’-UTR-MUT其中一種和miR-205-5p-mimics(50nm)或NC-mimics其中一種共轉(zhuǎn)染。根據(jù)制造商的協(xié)議，使用雙熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶活性。每項實驗重復(fù)3次。

2.8miR-205-5p過表達對大鼠DRG神經(jīng)元的影響 將提取的成年雄性SD大鼠DRG神經(jīng)元分為NC-mimics+未損傷、NC-mimics+損傷、miR-205-5p-mimics+未損傷和miR-205-5p-mimics+損傷4組，按照分組使用脂質(zhì)體法分別向其轉(zhuǎn)入對應(yīng)的質(zhì)粒。每組細胞設(shè)置4個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后細胞在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24 h，用蛋白免疫印跡法(WB)檢測UHRF1的表達情況。

2.9檢測UHRF1的干擾RNA(UHRF1-siRNA)對坐骨神經(jīng)損傷大鼠DRG神經(jīng)元UHRF1表達的影響 為了敲除UHRF1，將提取的坐骨神經(jīng)損傷的成年雄性SD大鼠DRG神經(jīng)元分為損傷+NC、損傷+ UHRF1-siRNA1、損傷+ UHRF1-siRNA2和損傷+ UHRF1-siRNA3共4組，分別轉(zhuǎn)染25 nM的NC-siRNA、UHRF1-siRNA1、UHRF1-siRNA2和UHRF1-siRNA3。使用脂質(zhì)體法分別將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞。轉(zhuǎn)染流程參閱試劑盒提供的操作說明， 每組細胞設(shè)置4個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后細胞在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24h，并用Q-PCR和蛋白質(zhì)印跡法(WB)檢測轉(zhuǎn)染效率。

2.10檢測miR-205-5p通過調(diào)節(jié)UHRF1表達進而調(diào)控DRG神經(jīng)元軸突再生 將提取的新生SD大鼠DRG神經(jīng)元分為miR-NC、miR-205-5p抑制物、miR-205-5p抑制物+si-NC和miR-205-5p inhibitor+UHRF1-si-UHRF1共4組，按照分組使用脂質(zhì)體法分別向其轉(zhuǎn)入對應(yīng)的質(zhì)粒。每組細胞設(shè)置4個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后細胞在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24h，用β-III-tubulin(1∶200)染色。觀察DRG神經(jīng)元軸突生長情況，測量其最長神經(jīng)軸突長度。

2.11蛋白質(zhì)印跡法檢測UHRF1蛋白表達水平 收集上述各組涉及到WB實驗的細胞，用RIPA裂解液處理細胞，提取細胞總蛋白，通過使用蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。取等量蛋白進行SDS-PAGE分離，并用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉封閉處理PVDF膜2h，按照1∶1000的稀釋比例配制一抗(UHRF1、β-actin)，4 ℃孵育過夜。用PBST清洗3次，每次5min。按照1∶3000的稀釋比例加入二抗，室溫孵1h，用PBST清洗3次，每次5min。最后使用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，分析各蛋白條帶的灰度值。以UHRF1蛋白與β-actin蛋白條帶灰度值之比表示其相對表達水平。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

1 實驗動物情況

坐骨神經(jīng)損傷和對照組大鼠各15只，均存活，全部進入后續(xù)實驗數(shù)據(jù)分析。

2 坐骨神經(jīng)損傷后，神經(jīng)再生能力增強，并且miR-205-5p表達降低

通過β-Ⅲ-tubulin染色發(fā)現(xiàn)，與對照組對比，坐骨神經(jīng)損傷組DRG神經(jīng)元最長神經(jīng)軸突長度顯著增加(P<0.01，圖1a、b)。采用Q-PCR檢測了損傷和未損傷SD大鼠的DRG組織和細胞中miR-205-5p的表達水平。結(jié)果顯示，損傷組SD大鼠的DRG組織和細胞中miR-205-5p的表達水平明顯低于對照組(P<0.01，圖1c)。以上結(jié)果表明，機體發(fā)生坐骨神經(jīng)損傷后，miR-205-5p表達水平明顯下降。

圖1 大鼠坐骨神經(jīng)損傷引起軸突再生，并抑制miRNA-205-5p表達。a、b.從對照組和損傷組大鼠身上分離的成年DRG神經(jīng)元，培養(yǎng)20h，用神經(jīng)元特異性標記物β-tubulinⅢ染色；c.Q-PCR檢測坐骨神經(jīng)損傷后miRNA-205-5p在坐骨神經(jīng)損傷中的表達。標尺:50μm。與對照組比較：**P<0.01

3 抑制miR-205-5p表達促進背根神經(jīng)節(jié)細胞軸突生長

以新生SD大鼠提取的DRG細胞為模型，Q-PCR法檢測結(jié)果(圖2a)顯示，與PBS組和NC-mimics組相比，miR-205-5p-mimics組DRG中miR-205-5p的表達水平明顯上調(diào)，miR-205-5p inhibitor組DRG中miR-205-5p的表達水平顯著下降，提示成功構(gòu)建了miR-205-5p過表達及低表達的背根神經(jīng)節(jié)細胞。

與PBS對照組和NC-mimics組對比，miR-205-5p抑制物組背根神經(jīng)節(jié)細胞的最長神經(jīng)軸突長度顯著增加(P< 0.001，圖2b、c)。以上數(shù)據(jù)表明，抑制miR-205-5p表達能在體外環(huán)境中促進背根神經(jīng)節(jié)細胞軸突生長。

圖2 抑制miR-205-5p促進DRG細胞軸突生長。a.miR-205-5p-mimic和miR-205-5p inhibitor轉(zhuǎn)染后，DRGs內(nèi)miR-205-5p的表達水平；b.用miR-205-5p-mimic和miR-205-5p inhibitor轉(zhuǎn)染DRGs后，用神經(jīng)元特異性標記物β-tubulinⅢ染色；c.在轉(zhuǎn)染后96h后，觀察并定量各組最長神經(jīng)突長度。標尺:50 μm。與NC-mimics比較：**P<0.01,***P<0.001

4 miR-205-5p與UHRF1相互作用

通過Starbase網(wǎng)站進行生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，UHRF1基因可能是miR-205-5p的直接靶點(圖 3a)，兩者具有一定的相關(guān)性。

進一步采用熒光素酶報告基因?qū)嶒瀬眚炞CmiR-205-5p是否直接靶向結(jié)合UHRF1。筆者發(fā)現(xiàn)，與NC-mimics+野生型UHRF1-3’-UTR重組質(zhì)粒組、NC-mimics+突變型UHRF1-3’-UTR重組質(zhì)粒組和miR-205-5p-mimics+突變型UHRF1-3’-UTR重組質(zhì)粒組相比，僅有miR-205-5p-mimics+野生型UHRF1-3’-UTR重組質(zhì)粒組的熒光素酶活性明顯被降低(P<0.01，圖3b)。結(jié)合Starbase網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果分析推測miR-205-5p可直接靶向UHRF1基。

5 過表達miR-205-5p抑制UHRF1的表達

采用Q-PCR法和WB檢測UHRF1 mRNA 和蛋白的表達水平。Q-PCR法檢測結(jié)果顯示，與NC-mimics+未損傷組的背根神經(jīng)節(jié)細胞相比，NC-mimics+損傷組中UHRF1 mRNA的表達水平顯著升高(P<0.01)，但是在轉(zhuǎn)入miR-205-5p-mimics(miR-205-5p-mimics+損傷組)后，損傷引起的UHRF1 mRNA升高被顯著抑制(圖3c)．采用WB檢測UHRF1蛋白的表達水平,發(fā)現(xiàn)NC-mimics+損傷組DRG中UHRF1蛋白水平顯著升高(P<0.01)，但是這種情況在轉(zhuǎn)入miR-205-5p-mimics后(miR-205-5p-mimics+損傷組)明顯被抑制(P<0.01，圖3d、e)。上述結(jié)果說明，miR-205-5p能夠抑制周圍神經(jīng)損傷引起的UHRF1高表達。

圖3 miR-205-5p調(diào)控UHRF1的表達。a.預(yù)測UHRF1和miR-205-5p的結(jié)合位點;b.雙熒光素酶報告基因轉(zhuǎn)染48h后，進行熒光素酶測定;c.通過qRT-PCR確認各組差異表達的miRNA;d、e.比較各組UHRF1表達差異。與NC-mimics組對比：##P<0.01；與NC-mimics+未損傷組對比：**P<0.01；與NC-mimics+損傷組對比：$$P<0.01

6 miR-205-5p通過調(diào)控UHRF1影響神經(jīng)再生

通過Q-PCR和WB發(fā)現(xiàn)UHRF1 siRNA-3對UHRF1表達下調(diào)作用最為顯著，所以UHRF1 siRNA-3被用作下一步實驗(P<0.05,圖4a、b)。筆者將UHRF1 siRNA-3(si-UHRF1)和陰性對照載體(si-NC)分別瞬時轉(zhuǎn)染DRG神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)miR-205-5p inhibitor可上調(diào)DRG中UHRF1蛋白的表達水平，而si-UHRF1(miR-205-5p inhibitor+UHRF1-si-UHRF1組)恢復(fù)了DRG中UHRF1蛋白的表達(圖4c)。miR-205-5p抑制物對神經(jīng)突生長的促進作用被si-UHRF1抑制(圖4d～i)。這些結(jié)果共同表明，miR-205-5p通過調(diào)控UHRF1影響神經(jīng)再生。

圖4 miR-205-5p通過調(diào)控UHRF1影響神經(jīng)再生。a.用靶向UHRF1的3種不同siRNA和NC轉(zhuǎn)染后，qRT-PCR檢測DRG神經(jīng)元中UHRF1 轉(zhuǎn)錄水平;b.用3種不同的靶向UHRF1的siRNA和NC轉(zhuǎn)染后，檢測DRG神經(jīng)元中UHRF1的表達;c.miR-205-5p inhibitor上調(diào)DRGs中UHRF1蛋白的表達，而轉(zhuǎn)染si-UHRF1質(zhì)?？梢种艱RGs中UHRF1蛋白的表達;d、e.si-UHRF1再次導(dǎo)入DRG神經(jīng)元可部分抑制miR-23b-3p inhibitor對神經(jīng)突生長的增強作用。標尺:50μm。與損傷+NC組對比：*P<0.05，**P<0.01；與miR-NC組對比：##P<0.01

討 論

miRNA在神經(jīng)組織中表達具有組織特異性，如miR-9及miR-124僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達[15-16]。目前，已發(fā)現(xiàn)miR-9、miR-219及miR-13等多個分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17-19]。盡管既往針對 miRNA 開展了大量研究，但miRNA在周圍神經(jīng)再生中的作用研究尚處于初步階段。Zhou等[20]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷后大量miRNA分子表達改變，提示miRNA 在神經(jīng)損傷中可能發(fā)揮作用。Wu等[21]條件性敲除miRNA合成的關(guān)鍵分子Dicer后，大鼠坐骨神經(jīng)離斷后的功能恢復(fù)及形態(tài)重建等明顯受限，說明miRNA在神經(jīng)損傷修復(fù)過程中發(fā)揮了重要作用。目前，關(guān)于miR-205-5p的研究主要集中在腫瘤、血管及動脈粥樣硬化等方面。王海波等[22]發(fā)現(xiàn)，過表達miR-205-5p可顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡。有研究報道m(xù)iR-205-5p高表達通過抑制血管內(nèi)皮生長因子表達，從而調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的存活。并且，miR-205-5p通過下調(diào)PRKCA mRNA及蛋白表達，減少p38蛋白的磷酸化，進而抑制血管平滑肌細胞增殖與遷移,達到其抗動脈粥樣硬化的作用[23]。但關(guān)于miR-205-5p對坐骨神經(jīng)再生的作用鮮有報道，因此本研究中重點探討了其在周圍神經(jīng)損傷中的作用。

在某種程度上，周圍神經(jīng)系統(tǒng)的成熟神經(jīng)元在軸突損傷后可以切換到再生狀態(tài)。事實上，外周而非中樞軸突損傷會引起再生反應(yīng)背后涉及到復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳變化[24]。進來研究的主要焦點是揭示再生相關(guān)基因(RAGs)促進軸突再生和調(diào)控這些基因的分子[25-26]。然而，受傷后基因被抑制的作用和相關(guān)機制仍需深入研究。

Bronner等[27]發(fā)現(xiàn)UHRF1在腫瘤細胞中高表達，并參與抑制腫瘤抑制基因?？紤]到腫瘤抑制因子在限制軸突再生方面的重要作用，Young等[14]通過在軸突上驗證發(fā)現(xiàn)，在損傷的周圍神經(jīng)中，UHRF1通過抑制PTEN和p21 (CDKN1A)基因的表達促進軸突再生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，UHRF1通過與二甲基化和三甲基化H3K9相互作用并招募DNMT1和DNMT3a促進PTEN和p21 (CDKN1A)的DNA甲基化來抑制其基因表達。同時，UHRF1也在高度增殖的神經(jīng)干/前體細胞中表達[28]，這提示在損傷的神經(jīng)元中上調(diào)UHRF1的表達可能會使其處于再生狀態(tài)。

本研究結(jié)果表明，與正常組織或細胞相比，周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生能力明顯增強，此外，筆者發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)損傷的組織或細胞中 miR-205-5p表達降低。并且抑制miR-205-5p表達會增加DRG神經(jīng)元軸突再生的能力。而miR-205-5p過表達會抑制DRG神經(jīng)元軸突再生。此外， miR-205-5p可直接靶向UHRF1基因，miR-205-5p過表達可明顯抑制UHRF1 mRNA 和蛋白的表達水平，同時抑制miR-205-5p和UHRF1表達下調(diào)抑制miR-205-5p引起的DRG神經(jīng)元軸突再生能力。表明miR-205-5p通過對UHRF1蛋白表達水平的調(diào)控改變了DRG神經(jīng)元軸突再生能力。

綜上所述，本研究表明抑制miR-205-5p通過促進UHRF1表達促進了DRG神經(jīng)元軸突再生，為周圍神經(jīng)損傷提供了一種新的無細胞療法。

作者貢獻聲明：張娜：實驗實施、收集數(shù)據(jù)、文章撰寫；左曉霜：分析數(shù)據(jù)；王文慧：課題設(shè)計