山桃組培苗無糖生根培養(yǎng)研究

劉福云，孫怡婷，徐一超，盧 顯，張 東，趙彩平

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院, 陜西 楊凌 712100)

桃樹繁殖方法主要有實(shí)生砧木嫁接育苗、扦插育苗和組培快繁育苗[1]。實(shí)生砧木嫁接育苗是我國目前主要的桃苗繁育方法，實(shí)生苗根系發(fā)達(dá)，育苗簡單，已廣泛應(yīng)用于桃苗木的生產(chǎn)。但實(shí)生砧木生產(chǎn)周期長，效益低，出苗整齊度差，且適應(yīng)性不一，不適用于規(guī)范化建園[2]。種質(zhì)純凈、生長整齊、能保持優(yōu)良性狀的無性系砧木能夠有填補(bǔ)實(shí)生砧木的缺陷。無性系苗木的生產(chǎn)主要包括扦插育苗和組織培養(yǎng)育苗。扦插生根率較低，扦插后的環(huán)境因素如光強(qiáng)、溫度、濕度、通氣等不易控制，而且高濕度下枝條容易產(chǎn)生病害，需要配備專門的育苗場地以及人員，管理難度大，成本高[3,4]。組織培養(yǎng)育苗既能保持母株的優(yōu)良特性，又能在短時(shí)間內(nèi)提供大量優(yōu)質(zhì)、無毒苗木，且可以實(shí)現(xiàn)周年生產(chǎn)，是一種優(yōu)質(zhì)的苗木繁殖方法[1]。但桃組培苗的生根比一般果樹困難，且受生長素種類及濃度、體外培養(yǎng)時(shí)間[5]、培養(yǎng)基類型[6]、碳源[7]影響很大，而在生根培養(yǎng)基上添加活性炭[8]、間苯三酚[5,9]、硫銨[10]等對(duì)桃組培苗的生根效果在不同品種間差異較大，沒有穩(wěn)定的方法適用于所有桃組培苗的生根。受制于離體組織培養(yǎng)快繁中的污染、生根難和育苗成本高等問題，桃組織培養(yǎng)育苗還沒有廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。

無糖組織培養(yǎng)技術(shù)，又叫光自養(yǎng)組織培養(yǎng)技術(shù)，是由日本千葉大學(xué)的古在豐樹教授發(fā)明的。技術(shù)核心是用持續(xù)不斷泵入的氣體CO2作為碳源，促使組培苗由兼養(yǎng)型轉(zhuǎn)為自養(yǎng)型，從而生產(chǎn)根系發(fā)達(dá)、生長健壯的苗木[11]。無糖培養(yǎng)通過提高植物的自養(yǎng)能力，減少植物形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育差，生理功能弱等問題[12]。無糖生根技術(shù)在花卉[13,14]和藥用植物[12]中應(yīng)用較多，近年來在蘋果[15]、油茶[16]和歐李[17]苗木生產(chǎn)中也開始推廣應(yīng)用。有糖組培環(huán)境濕度大，不利于空氣流通，組培苗根系發(fā)育不良，側(cè)根少，質(zhì)地脆，移栽時(shí)容易斷裂。而且組培苗長期處于低CO2濃度的環(huán)境，氣孔長期開放，調(diào)節(jié)能力低[18]，移栽時(shí)苗子極易失水而導(dǎo)致枯萎死亡[19]。與有糖生根培養(yǎng)相比，無糖培養(yǎng)用蛭石代替了價(jià)格高的瓊脂粉[17]，每盒可以生產(chǎn)幾十株，成本低廉。無糖培養(yǎng)過程中由于沒有添加糖類，接種過程中不易發(fā)生污染，夏秋污染高發(fā)的時(shí)期，有時(shí)無糖組培盒會(huì)產(chǎn)生一些真菌，但菌斑不易擴(kuò)散，附近的苗子都不受影響，污染損失率低。無糖生根處理以蛭石為基質(zhì)，基質(zhì)疏松多孔，有利于幼苗地下部的氣體交換[15]，生產(chǎn)出的幼苗根系發(fā)達(dá), 有大量側(cè)根形成，根系活力強(qiáng)[20]，木質(zhì)化程度高，移栽時(shí)不易斷裂。而且蛭石與移栽用基質(zhì)的環(huán)境相似，移栽前不用煉苗[15]，苗子在溫室培養(yǎng)至半米高即可移至大田，可極大縮短無性系砧木的生產(chǎn)時(shí)間。

桃砧木主要采用毛桃和山桃，山桃適應(yīng)性強(qiáng)，耐旱、耐寒、耐鹽堿，嫁接親和力強(qiáng)，為我國北方桃產(chǎn)區(qū)的主要砧木[2]，應(yīng)用范圍廣。目前山桃主要采用種子繁殖，播種時(shí)間分為春播和秋播，春播前需要進(jìn)行沙藏和催芽處理，秋播不需要處理但發(fā)芽慢[21,22]。實(shí)生繁殖的山桃造林耗時(shí)久，出苗整齊度差，后代性狀分離，適應(yīng)性不一，不利于規(guī)?；▓@。無糖生根技術(shù)能解決組培生根培養(yǎng)中的污染和生根難的問題，并且育苗成本低于有糖生根培養(yǎng)技術(shù)，育苗周期短，后代性狀穩(wěn)定，有助于優(yōu)質(zhì)山桃種質(zhì)的推廣和應(yīng)用。

研究以山桃組培苗為實(shí)驗(yàn)材料，采用無糖生根技術(shù)，通過對(duì)山桃生根中生長素和含水量的篩選，以及不同生根時(shí)期山桃根系和地上部的生長情況統(tǒng)計(jì)，為山桃無糖組培快繁提高參考，進(jìn)一步為其他砧木和優(yōu)質(zhì)雜交桃品種的無性繁殖提供參考，以期實(shí)現(xiàn)桃苗木繁殖的規(guī)?；?、工廠化生產(chǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)于2019年5月至2020年11月在西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院組培室進(jìn)行，位于陜西省咸陽市楊凌區(qū)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)所用的山桃母樹位于西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝場桃種質(zhì)資源圃，為17年生的實(shí)生成年樹，實(shí)驗(yàn)地土壤類型為沙壤土。以山桃離體莖尖培養(yǎng)而成的組培苗為試驗(yàn)材料，選擇繼代30d后的組培苗新稍進(jìn)行生根誘導(dǎo)試驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生長素種類及濃度的篩選 每升純水中加入2.215g MS(Murashige and Skoogmedi)培養(yǎng)基，再加入生長素配置成終濃度分別為1.0 和1.5 mg/L IBA(Indole-3-butyric acid)、0.5 和1.0 mg/L NAA(1-Naphthaleneacetic acid)的營養(yǎng)液，最后用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至5.8。將蛭石放入滅菌袋中，和營養(yǎng)液一起放入高壓滅菌鍋中，121℃ 滅菌 21min，再于潔凈的地方放涼。開紫外前提前將組培盒和蛭石轉(zhuǎn)移至在超凈工作臺(tái)中消毒。先向無糖組培盒中倒入蛭石，再加入營養(yǎng)液至蛭石上方出現(xiàn)一條水線。切去山桃組培苗莖基部的愈傷組織，保留所有葉片，插入蛭石中。每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10棵苗。生根處理30 d后，打開盒蓋統(tǒng)計(jì)山桃的生根率和平均生根數(shù).用根系分析儀分別掃描每個(gè)重復(fù)的根系，再用分析軟件分析出各項(xiàng)根系指標(biāo)，用Excel計(jì)算每株山桃的根長、平均根直徑、根體積和根表面積。

1.2.2 蛭石初始含水量的篩選 在篩選出生長素種類及濃度的基礎(chǔ)上，配制生長素為1.0 mg/L IBA，其他物質(zhì)同上的營養(yǎng)液，向蛭石中加入營養(yǎng)液至蛭石含水量分別為 65%、70%、75%，滅菌放涼后接種山桃組培苗。每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10棵苗。統(tǒng)計(jì)方法如上。

1.2.3 山桃無糖生根不同時(shí)期根系和地上部的生長發(fā)育情況 配制生長素為1.0 mg/L IBA，其他物質(zhì)同上的營養(yǎng)液。由于生根培養(yǎng)時(shí)間較長，后期山桃苗易缺水干枯，向蛭石中加入營養(yǎng)液至蛭石初始含水量為 75%，滅菌放涼后接種山桃組培苗。挑選莖稈粗壯、葉片多而濃綠的山桃組培苗接種到蛭石上，分別培養(yǎng)至 0 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d、35 d、40 d，統(tǒng)計(jì)山桃苗的根系生長情況和地上部生長情況，根系生長指標(biāo)統(tǒng)計(jì)如上，山桃苗地上部統(tǒng)計(jì)指標(biāo)包括山桃組培苗株高(莖基部到生長點(diǎn)距離)、葉片數(shù)和莖粗。每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6棵苗。

1.3 環(huán)境控制參數(shù)

無糖培養(yǎng)系統(tǒng)購自上海離草科技有限公司，主要包括組培架、無糖組培盒、二氧化碳?xì)馄?、氣泵、LED 燈、控制器等。為防止二氧化碳逃溢，設(shè)置一塊密閉避光的空間作為無糖組培室，配置空調(diào)調(diào)節(jié)培養(yǎng)間溫度。無糖組培盒的CO2濃度為1 000±100 mL/L，組培室溫度為 23±2℃，空氣濕度為 50±5%。接種后先密封通氣孔遮光，3 d后見光并通入氣體CO2。CO2氣閥在第4天打開1/2，兩周后全開。光周期為光照 16 h/黑暗8 h。無糖組培盒上方30 cm 處單根LED燈管的光照度為37～40 umol/(s·m2)，共設(shè)置四根燈管。第4天打開中間的一根 LED燈管，之后每隔一周開一根燈管。

1.4 指標(biāo)測(cè)定與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

生根率=生根苗數(shù)/總苗數(shù)；平均生根數(shù)=總生根數(shù)之和(主根數(shù)+1 cm以上的側(cè)根數(shù))/總苗數(shù)；含水量=營養(yǎng)液重量/營養(yǎng)液與干蛭石的總重量；根長、根系直徑、根體積、根表面積由根系掃描儀掃描根系，并通過掃描分析軟件分析，最后匯總計(jì)算得到。根系掃描儀型號(hào)為EPSON 12 000XL，掃描灰度為8位，DPI為400，掃描軟件為espon scan2，分析軟件為WinRHIZO pro。利用直尺測(cè)得株高；葉片數(shù)為每株山桃上的展開葉的葉片數(shù)；每株苗子的粗度為山桃苗莖桿上中下三個(gè)點(diǎn)的平均粗度，由美耐特牌游標(biāo)卡尺測(cè)得。使用 Microsoft Office Excel 2019 和 IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長素種類及濃度對(duì)山桃根系生長發(fā)育的影響

生長素的種類及濃度對(duì)植物根系的誘導(dǎo)和發(fā)育非常重要，生根的好壞主要表現(xiàn)為生根率和根系質(zhì)量。生根數(shù)、根長、根系直徑和根系體積越大，植物根系越發(fā)達(dá)；根系表面積越大，根系越舒展。從圖1 可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中添加 IBA 濃度為1.0 mg/L 時(shí)，山桃試管苗的生根效果最好，生根率、生根數(shù)顯著高于其他處理，根體積最大。當(dāng)NAA 濃度為0.5mg/L時(shí)，山桃的根長顯著高于其他處理，根表面積最大，但生根數(shù)和根系直徑最小，根系發(fā)育不良。1.5 mg/L IBA處理的山桃雖然根系直徑最大，但生根率低，根長較短，不適宜誘導(dǎo)山桃生根。1.0 mg/L NAA處理的山桃生根效果最差，根長、根體積和根表面積顯著低于其他處理，生根數(shù)低。綜合來看，1.0 mg/LIBA處理的山桃組培苗生根率高，根系質(zhì)量好，最適宜誘導(dǎo)山桃的無糖生根。

注：圖中柱狀圖上的小寫字母表示在p < 0.05水平差異顯著。

2.2 不同初始含水量對(duì)山桃無糖生根的影響

從表1 可以看出，蛭石初始含水量為65%時(shí)，山桃試管苗的生根率和根長顯著高于其他處理，根體積和根表面積最大。蛭石初始含水量為70%時(shí)，根系的生根數(shù)和根系直徑顯著高于其他處理，但該處理生根率較低，根長和根系表面積最低。初始含水量為75%時(shí)，山桃的生根率最低，生根數(shù)和根系表面積與70%的含水量相似，生根效果不理想。三個(gè)處理的根系體積無顯著差異。適度的干旱有利于山桃根系的誘導(dǎo)和發(fā)育，蛭石初始含水量為65%時(shí)最適宜誘導(dǎo)山桃根的形成，但含水量為70%時(shí)山桃生根數(shù)多，根系直徑粗，側(cè)根比前者多，根系更發(fā)達(dá)。綜合來看，初始蛭石含水量為65%～70%時(shí)無糖生根效果最好。

表1 不同含水量下山桃的根系發(fā)育情況

2.3 山桃無糖生根培養(yǎng)期間根系的生長發(fā)育情況

無糖組培生根第10天 能觀察到錐形、白色偏透明的根，之后根慢慢增粗變長，主根上漸漸長出側(cè)根。前20 d根系白嫩粗短，增長緩慢；20 d后根系迅速伸長，主根表皮發(fā)褐，根尖和側(cè)根白亮，生長迅速。山桃在無糖環(huán)境中的生根率在前15d 迅速升高，在第25天達(dá)到100%，之后生根率一直是100%。山桃的平均生根數(shù)15～25 d 增長速率最快，在第35天達(dá)到最大。山桃根的平均直徑初期升高，在第25天后逐漸下降。每株苗的總根體積在40 d 內(nèi)持續(xù)上升，在第20～25天增長最快。根表面積的曲線與根長相似，第40天達(dá)到最長，其中根長在30 d 后以相同的速率加快伸長，根表面積20～25 d 和 30～40 d 增長最快。綜合來看，山桃無糖培養(yǎng)時(shí)間以35～40 d為宜。

2.4 山桃無糖生根培養(yǎng)期間地上部的長勢(shì)

山桃地上部在接種后的前20 d葉色深綠，莖稈柔嫩；20 d后葉子顏色略微泛黃。從圖3可以看到，山桃莖基部到生長點(diǎn)高度在無糖生根處理的40 d內(nèi)，隨時(shí)間變化呈波動(dòng)曲線，但無明顯增長。平均莖粗的變化情況與莖基部到生長點(diǎn)高度相似，也無明顯增長。葉片數(shù)前期略有增加，后期葉片逐漸脫落，第40天 葉子掉落嚴(yán)重，不適合移栽。結(jié)合根系的生長情況，無糖生根培養(yǎng)時(shí)間以35 d為宜。

圖3 無糖生根不同時(shí)期山桃苗地上部的長勢(shì)

3 討論

3.1 生長素種類及濃度對(duì)山桃生根的影響

不同桃品種之間的生根培養(yǎng)條件差異較大[23]。閆文義[24]研究發(fā)現(xiàn)將桃雜交優(yōu)系 2-7接種于1/2 MS+0.5 mg/L IBA 的培養(yǎng)基中10 d 后轉(zhuǎn)入無生長素的 1/2 MS培養(yǎng)基中生根效果較好，生根率達(dá) 90.60%。張恒濤等[25]發(fā)現(xiàn)豫農(nóng)矮砧 1 號(hào)的最佳濃度組合是 1.5 mg/L IAA + 1.0 mg/L IBA。IBA 濃度為 1.0 mg/L 時(shí)，山桃試管苗的生根效果最好，生根率為95.83%，根系粗壯[26]，與筆者實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。筆者實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)當(dāng)NAA 濃度為0.5 mg/L時(shí)，雖然山桃生根率和生根數(shù)較低，但根長和根表面積顯著高于1.0 mg/L IBA的處理。有糖生根中，有的桃組培苗直接生根，有的先產(chǎn)生愈傷組織，后從愈傷組織中長根[27]。無糖生根處理中所有的山桃都不產(chǎn)生愈傷，大部分根分布在莖基部周圍，少部分根長在底部切口處。可能是無糖環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)都吸附在蛭石中，不容易吸收，初期較低的CO2濃度和光強(qiáng)使山桃的光合作用降低，營養(yǎng)缺乏使山桃不產(chǎn)生愈傷。

3.2 蛭石含水量對(duì)無糖生根的影響

不同物種的根系生長情況隨含水量的變化表現(xiàn)不一致。土壤含水量在土壤萎蔫含水量至田間持水量之間時(shí)，楊樹插穗的生根率和根系長度隨著含水量的增加而增長；超過田間持水量時(shí)，插穗的生根率和根系長度隨著含水量的上升降低少[28]。而筆者實(shí)驗(yàn)中含水量由65%上升到75%的過程中，山桃無糖組培苗的生根率持續(xù)降低。說明在適宜的含水量范圍內(nèi)，一定程度的干旱能刺激根系的產(chǎn)生。楊樹插穗生根實(shí)驗(yàn)中，含水量低時(shí)，生根率低，淹水和中等供水處理下生根率高且相差不大。根生物量上，淹水處理低于低供水處理，低供水處理低于中等供水處理[29]。在土壤含水量較高的條件下，頭花蓼扦插生根率高，生根數(shù)量多，根系粗壯；土壤較為干旱的條件下，頭花蓼扦插生根率低，生根數(shù)少，根長最長，但根系比較細(xì)弱[30]。而筆者實(shí)驗(yàn)中蛭石初始含水量為65%時(shí)，山桃的生根率最高，根系體積和表面積最大，根長最長，生根數(shù)較少，總根量最大；含水量為70%，生根率較低，生根數(shù)最多，根系直徑大，根系質(zhì)量最好；含水量為75%時(shí)，生根率最低，生根數(shù)低，根長較短，根系質(zhì)量差。

3.3 不同生根處理時(shí)期山桃根系以及地上部的差異

從圖2可以看出，根長與根表面積的變化曲線相似，都是前期增長緩慢，30～40 d 加快增長。20～25 d 根系明顯增多，根表面積在此期間增長速率加快。接種后 30～40 d，雖然根體積變化不大，但根長和根表面積卻迅速增加，這可能是因?yàn)?0 d 后主根增長量小，但側(cè)根和毛細(xì)根迅速出現(xiàn)和伸長。山桃根系的平均直徑前期升高是由于根系變粗，后期由于根尖迅速伸長，側(cè)根大量增加，平均直徑降低。根在變粗的同時(shí)逐漸伸長，前期變粗的速度高于伸長的速度，平均直徑逐漸升高。后期主根逐漸伸長，根尖處較細(xì)，并長出了更為細(xì)弱的側(cè)根，平均根直徑逐漸降低。

圖2 山桃無糖生根不同時(shí)期根系的生長發(fā)育情況

無糖培養(yǎng)促使植物由兼養(yǎng)型轉(zhuǎn)向自養(yǎng)型[11]，減少植物形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育差，生理功能弱等問題[12]。組培苗一般呈長條狀，由主莖和幾組葉片組成，莖葉嬌嫩且呈亮綠色，根部有少量黑色須根[31]。山桃地上部在接種后的前20 d葉色亮綠，莖稈柔嫩，與組培生根狀態(tài)的山桃苗相似；20 d后葉子增大，葉緣處泛黃，山桃苗的生理狀態(tài)可能發(fā)生了改變，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力增強(qiáng)。與瓊脂培養(yǎng)基相比，蛭石含水量較低，且下降迅速。山桃在生根過程中需要大量的營養(yǎng)和水分，無糖生根后期蛭石含水量過低，營養(yǎng)缺乏。前期葉片數(shù)量的增加，很可能是莖尖處的幼葉成長為功能葉導(dǎo)致。山桃在無糖組培誘導(dǎo)生根期間除了葉片增大外，其他地上部無明顯生長，且第40天時(shí)落葉嚴(yán)重。生根處理35 d 時(shí)，根系發(fā)育良好，而且地上部葉片較多，適合移栽。

與一般組培技術(shù)相比，無糖生根對(duì)外植體的要求較高，如莖葉要粗壯，需要具有進(jìn)行光自養(yǎng)生長的葉面積等[12]，苗子莖稈過細(xì)過短、葉子過少，都不利于無糖生根。觀察不同時(shí)期山桃的根系和地上部生長狀況時(shí)，由于生根培養(yǎng)時(shí)間較久，后期苗子可能因水分和營養(yǎng)缺乏而枯死，因此含水量設(shè)置為75%。盡管篩選含水量時(shí)發(fā)現(xiàn)過高的含水量不利于山桃生根，但含水量為75%的情況下第25天時(shí)山桃的生根率就達(dá)到100%。生長素篩選和含水量篩選中山桃的生根率和根系質(zhì)量效果較差，原因可能所用的山桃組培苗質(zhì)量較差。隨著生根條件和環(huán)境控制的逐步完善，山桃的生根率和生根質(zhì)量將進(jìn)一步提升，為實(shí)現(xiàn)桃苗木繁殖的規(guī)?；?、工廠化生產(chǎn)提供了更大的可能。

4 結(jié)論

①山桃在1.0 mg/L IBA中生根情況最好，生根率為90%，平均生根數(shù)為3.6條；0.5 mg/L NAA的生根效果次之。②山桃在含水量為65%的蛭石中生根率最高，平均根長、根體積和根表面積均為最大；在含水量為70%的蛭石中平均生根數(shù)、根直徑最高，適宜山桃無糖生根的蛭石含水量為65%～70%。③山桃組培苗第35天最適合移栽。無糖生根能明顯改善山桃組培苗的生根情況，生根率和平均生根數(shù)顯著提高，苗子生長健壯，根系發(fā)達(dá)，周期短，適宜在生產(chǎn)中推廣使用。