組織透明化技術(shù)在神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用研究進(jìn)展

陳小玉，羅連響，潘韻琪，鮑波*

1廣東醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣東湛江 524000；2廣東醫(yī)科大學(xué)海洋醫(yī)藥研究院，廣東湛江 524000；3廣東醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東湛江 524000

目前，全球約有4700萬人受到神經(jīng)退行性疾病的影響[1]。在常見的神經(jīng)退行性疾病中，阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)[2-3]、帕金森病(Parkinson's disease，PD)[4]、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)[5]等的發(fā)病率逐漸升高，且治療效果不佳，造成了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。大腦是一個(gè)結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜的動(dòng)態(tài)神經(jīng)功能網(wǎng)絡(luò)。目前，人類對(duì)于大腦的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，即使對(duì)于僅為人腦體積數(shù)百分之一的嚙齒動(dòng)物腦的結(jié)構(gòu)和功能機(jī)制，也無法進(jìn)行確切地闡述[6]。在全腦范圍內(nèi)對(duì)特定類型的神經(jīng)環(huán)路進(jìn)行高分辨率多維成像，分析病理性結(jié)構(gòu)(如淀粉樣斑塊、神經(jīng)纖維斑塊纏結(jié))的分布及形態(tài)學(xué)變化，對(duì)于腦功能及相關(guān)疾病的研究至關(guān)重要。然而，傳統(tǒng)二維組織切片技術(shù)無法客觀地獲得目標(biāo)區(qū)域真實(shí)的立體空間結(jié)構(gòu)，且在機(jī)械切片過程中易破壞組織結(jié)構(gòu)的連續(xù)性，導(dǎo)致某些關(guān)鍵信息丟失。

組織透明化技術(shù)以細(xì)胞分辨率對(duì)大腦結(jié)構(gòu)進(jìn)行3D成像，并作為連接影像學(xué)成像技術(shù)如電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)[7]、正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像(positron emission computed tomography，PET)[8]、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)[9]與經(jīng)典顯微組織學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)之間的橋梁。為了獲取全腦范圍內(nèi)神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)形態(tài)和蛋白分布信息，不僅需要具有較高空間分辨率的光學(xué)成像系統(tǒng)，同時(shí)還需要能夠?qū)⒋篌w積樣品進(jìn)行快速成像的技術(shù)。光學(xué)顯微鏡如激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)[10]、雙光子激發(fā)熒光顯微鏡(two-photon excitation fluorescence microscopy，TPEFM)[11]和光片熒光顯微鏡(light sheet fluorescence microscope，LSFM)[12]的發(fā)展解決了不同層面焦距變化和成像深度的問題，神經(jīng)科學(xué)家開始嘗試無需切片直接進(jìn)行3D成像，組織透明化技術(shù)由此應(yīng)運(yùn)而生。這為優(yōu)化大體積組織成像提供了較好的途徑，可使光線滲透到組織內(nèi)更深的區(qū)域，在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平提高了成像分辨率和對(duì)比度，并逐漸地應(yīng)用于多個(gè)生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。本文對(duì)腦組織透明化技術(shù)的基本原理和特點(diǎn)及其在神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用研究進(jìn)行綜述。

1 組織透明化技術(shù)的原理

由于生物組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有不同折射率(refraction index，RI)的生物大分子(如脂質(zhì)、色素、蛋白質(zhì)復(fù)合物等)分布不均，當(dāng)局部生物大分子聚集較多時(shí)，形成了一個(gè)特定RI的異質(zhì)性空間。光通過組織內(nèi)部時(shí)發(fā)生不均勻散射或折射[13]，導(dǎo)致不透明。組織透明化技術(shù)通過多種有機(jī)化合物或離子去污劑組成混合試劑對(duì)生物組織進(jìn)行一系列處理，以去除、替換或匹配RI不均一的物質(zhì)，增加組織器官透明度，從而提高光的穿透深度，有利于實(shí)現(xiàn)生物組織的空間結(jié)構(gòu)解析和三維重建，其技術(shù)流程如圖1所示。

圖1 組織透明化技術(shù)工作流程Fig.1 Workflow of tissue clearing techniques

現(xiàn)有透明化方法多通過以下幾種方式：(1)使用洗滌劑和(或)清除劑提高組織通透性；(2)脫脂和脫鈣，去除RI相對(duì)較高的成分；(3)脫水，去除RI相對(duì)較低的組分，并允許疏水性透明化試劑滲透；(4)變性或消化，將RI大的隔室分解成小而均勻的隔室。為保持組織成分和生物分子自然地分布于三維空間，且同時(shí)實(shí)現(xiàn)RI均質(zhì)化，需要借助一些外力，如電泳驅(qū)動(dòng)[14-15]、被動(dòng)熱擴(kuò)散[16]和灌注[17]等加壓方式，加速洗滌劑分子移動(dòng)、化學(xué)滲透和去除脂質(zhì)等成分。對(duì)于富含色素或發(fā)色團(tuán)的有色組織(如黑色素、肌紅蛋白中的血紅素、腦中的脂褐素等)，開發(fā)了包含脫色步驟的組織透明化方法，如CUBIC-L(clear unobstructed brain imaging cocktails of N-butyl-diethanolamine and triton X-100)[18]、PEGASOS[polyethylene glycol(PEG)-associated solvent system][19]。然而，黑色素和脂褐素等大分子色素用有機(jī)溶劑或水性試劑很難脫色，DEEPClear(depigmentation-plus-clearing)采用疏水和親水試劑的混合物以及過氧化物漂白步驟，可去除包括黑色素在內(nèi)的各種色素[20]，為研究各種模式動(dòng)物的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)提供了方案。然而，化學(xué)清除劑可能會(huì)對(duì)組織造成損傷，丟失某些生物分子和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，故需采取一定的保護(hù)性預(yù)處理，如固定或網(wǎng)狀凝膠聚合物包埋。Park等[21]利用生物分子與環(huán)氧化物連接的原理開發(fā)了SHIELD(stabilization under harsh conditionsviaintramolecular epoxide linkages to prevent degradation)方法，將組織與柔性聚環(huán)氧化物交聯(lián)，以形成穩(wěn)定性較高、均勻且透明的基質(zhì)，從而在苛刻的化學(xué)/物理處理過程中保護(hù)組織結(jié)構(gòu)和熒光蛋白。然而，組織透明化方法中更復(fù)雜的作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

2 透明化技術(shù)的代表性方法及其分類

組織透明化技術(shù)結(jié)合多種熒光標(biāo)記技術(shù)如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、病毒示蹤、熒光染料及原位雜交等，可在器官甚至全身水平獲取生物組織的三維結(jié)構(gòu)信息；結(jié)合高分辨率光學(xué)顯微成像技術(shù)，可呈現(xiàn)大腦和脊髓組織中復(fù)雜而又緊密連接的三維結(jié)構(gòu)，有助于進(jìn)一步理解中樞神經(jīng)與周圍神經(jīng)、血管的連接機(jī)制，為研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、損傷修復(fù)、可塑性、神經(jīng)連接，以及分析各類腦細(xì)胞的空間結(jié)構(gòu)等提供了重要工具。

1914年，Spalteholz最先使用有機(jī)溶劑苯甲醇和水楊酸甲酯混合透明化試劑，對(duì)透明的心臟組織進(jìn)行3D觀察[22]；2003年，Liu等[23]開發(fā)了使用水溶性化合物進(jìn)行組織透明化的方法，開拓了近代組織透明化技術(shù)發(fā)展的道路；2007年，Dodt等[24]使用苯甲醇-苯甲酸芐酯(BABB)試劑透明新生小鼠大腦得到了透明腦，首次可視化了完整的小鼠大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；2013年，Chung和Deisseroth[25]發(fā)明的CLARITY(clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging/immunostaining/in situhybridizationcompatible tissue-hydrogel)透明化技術(shù)，出色地展示了將整個(gè)生物組織透明后獲得精細(xì)圖像的能力。迄今為止，已經(jīng)開發(fā)了60多種離體組織透明化方法[26]，表1總結(jié)了具有代表性的腦透明化方法學(xué)參數(shù)[17,19,21,25,27-45]，為研究者選用和進(jìn)一步開發(fā)擴(kuò)展方法提供簡(jiǎn)要索引。

表1 腦組織透明化方法學(xué)比較Tab.1 Comparison of methods of brain tissue transparency

根據(jù)所用主要試劑的性質(zhì)，組織透明化技術(shù)可分為兩類，即有機(jī)溶劑型透明化技術(shù)和親水溶劑型透明化技術(shù)，其優(yōu)缺點(diǎn)如圖2所示。(1)有機(jī)溶劑型透明化技術(shù)可將組織在幾天內(nèi)實(shí)現(xiàn)較高地透明度，但內(nèi)源性熒光信號(hào)極易淬滅，如3DISCO(3D imaging of solvent-cleared organs)[28]。近年來開發(fā)了一些新型的有機(jī)溶劑透明化技術(shù)，如iDISCO(immunolabeling-enabled DISCO)[29]、uDISCO(ultimate DISCO)[30]、vDISCO[nanobody(VHH)-boosted DISCO][46]等，可在一定程度上保存熒光蛋白。(2)親水溶劑型透明化技術(shù)，可進(jìn)一步分類。一類包括ScaleS[33]、SeeDB2(see deep brain)[35]、FOCM[38]等水合溶劑，以良好的熒光保存和維持原組織大小而著稱，通過高濃度透明化試劑CUBIC系列[34,47]簡(jiǎn)單孵育可較好地透明化胚胎、新生小鼠大腦或厚切片。另一類包括離子去污劑聯(lián)合水凝膠包被的CLARITY技術(shù)[25]及其變體，可以實(shí)現(xiàn)完整成年小鼠大腦的高度透明，這極大地拓寬了組織透明化技術(shù)研究的范圍，可應(yīng)用于果蠅、蟑螂、斑馬魚、小鼠、大鼠、兔、狗、狨猴甚至人類的多種組織。

圖2 組織透明化技術(shù)的分類及特點(diǎn)Fig.2 Classification and characteristics of tissue clearing techniques

2.1 D I S C O 系列 有機(jī)溶劑型透明化技術(shù)以3 D I S C O[28]、i D I S C O[29]、P E G A S O S[19]、SHANEL(small-micelle-mediated human organ efficient clearing and labeling)[31]等為代表。技術(shù)流程主要包括兩個(gè)步驟：脫水/脫脂和高折射率成像介質(zhì)浸泡。因高折射率成像介質(zhì)(RI均為1.56左右)與水(RI為1.33)不相溶[48]，首先使用有機(jī)溶劑四氫呋喃代替乙醇進(jìn)行組織脫水，因乙醇會(huì)嚴(yán)重破壞熒光蛋白信號(hào)；脫水后應(yīng)用脫脂試劑(如BABB、二芐醚)可大幅度提高透明介質(zhì)向深層組織滲透的效率。此類方法的優(yōu)勢(shì)是透明速度快而徹底，透明后的組織變硬，體積縮小，而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中體積呈等向性縮減，有助于標(biāo)本長(zhǎng)期保存以及多次成像。盡管改進(jìn)了GFP熒光保存方法，但內(nèi)源性GFP熒光損傷仍然顯著。此外，因大多數(shù)有機(jī)溶劑對(duì)人體和環(huán)境均具有毒性，使用時(shí)需做好生物安全防護(hù)措施，廢液應(yīng)集中處理。DISCO及其衍生方法在透明組織的同時(shí)，可進(jìn)行深層免疫標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于成年小鼠腦及全身、人類胚胎、腫瘤活檢樣本、人腦組織等的研究。

2.2 CUBIC系列 親水性組織透明化試劑可高濃度溶解于水，與組織中的蛋白質(zhì)、水分子等成分形成氫鍵，穩(wěn)定熒光蛋白信號(hào)，并保留組織的3D結(jié)構(gòu)，依靠滲透壓驅(qū)動(dòng)逐漸完成透明。常用方法包括ScaleS[33]、CUBIC[34]及SeeDB2[35]等。實(shí)驗(yàn)流程包括脫色、脫脂和RI匹配。此類方法生物安全性更高，具有多種生物兼容性(如親脂性染料)和保留熒光蛋白的優(yōu)勢(shì)。由于未去除脂質(zhì)，透明效果不及疏水性有機(jī)溶劑，但可通過延長(zhǎng)透明化時(shí)間達(dá)到良好的透明效果。CUBIC非常適合于光照或給藥后即刻早期基因的檢測(cè)，已應(yīng)用于腦部腫瘤遷移灶、全腦范圍內(nèi)單個(gè)神經(jīng)元的追蹤、全腦谷氨酸能神經(jīng)元突觸連接、下丘腦神經(jīng)元分型及視網(wǎng)膜神經(jīng)投射等研究。

2.3 CLARITY系列 與其他透明化技術(shù)相比，CLARITY系列兼具水溶性透明化方法保持生物分子功能的特性和疏水性方法高效透明的優(yōu)勢(shì)，包括PACT-PARS[42]、ACT-PRESTO[44]、SHIELD[22]等。代表性方法CLARITY采用聚丙烯酰胺凝膠，使蛋白質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)及核酸等生物分子通過化學(xué)鍵與水凝膠偶聯(lián)，并將其固定在組織原位，極大地減少了結(jié)構(gòu)破壞，同時(shí)凝膠的大分子滲透性支持免疫標(biāo)記在整個(gè)組織中的擴(kuò)散，且折射率匹配解決方案可通過進(jìn)一步減少透明和未透明樣品中的光散射來實(shí)現(xiàn)深度高分辨率成像。結(jié)合示蹤實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行系統(tǒng)性無偏倚地自動(dòng)化分析，可在高分辨率水平進(jìn)行單個(gè)神經(jīng)元成像；結(jié)合自動(dòng)化細(xì)胞檢測(cè)、大腦之間的對(duì)齊方式，能快速獲取高通量數(shù)據(jù)。

3 透明化技術(shù)在神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用

組織透明化技術(shù)結(jié)合多種免疫標(biāo)記方法，完美地實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞水平可視化大腦完整結(jié)構(gòu)(如健康人腦皮質(zhì)中錐體神經(jīng)元、中間神經(jīng)元、小腦浦肯野細(xì)胞、顆粒細(xì)胞等)和功能腦圖譜，以及單個(gè)細(xì)胞在不同腦區(qū)活動(dòng)的關(guān)聯(lián)等。該技術(shù)提供了多維度視角(宏觀和微觀尺度)，可揭示潛在分子標(biāo)志物在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。通過透明化技術(shù)對(duì)病理性人腦組織樣本或各種退行性疾病動(dòng)物模型進(jìn)行高分辨率成像，如可視化AD的淀粉樣斑塊，PD的多巴胺能軸突、浦肯野細(xì)胞、α-突觸核蛋白包涵體，以及MS的腦皮質(zhì)萎縮和突觸等病理性結(jié)構(gòu)，可在神經(jīng)環(huán)路水平探究疾病的病理發(fā)展過程。詳見表2。

表2 透明化技術(shù)在神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用Tab.2 Application of tissue clearing in neurodegenerative diseases

3.1 AD AD是一種漸進(jìn)性神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶障礙、認(rèn)知功能障礙及語(yǔ)言障礙，是老年癡呆癥最主要的病因。65歲以上人群患病率為11.3%[2]。AD患者大腦皮質(zhì)萎縮，神經(jīng)元長(zhǎng)期受β淀粉樣斑塊(amyloid β-protein，Aβ)及神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)等侵蝕，突觸功能出現(xiàn)不同程度的紊亂甚至丟失[60]。組織透明化技術(shù)直觀地展示了AD病理標(biāo)志物在三維立體空間中的分布、結(jié)構(gòu)異質(zhì)性，以及與神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、血管等周圍環(huán)境的相互關(guān)系，可促進(jìn)AD病理機(jī)制的研究。Hama等[33]開發(fā)ScaleS清除APP轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)合AbScale深層免疫標(biāo)記Aβ斑塊，發(fā)現(xiàn)其主要分布于腦皮質(zhì)；在AD患者腦組織中，致密Aβ斑塊與小膠質(zhì)細(xì)胞毗鄰而存。Vints等[51]使用CUBIC處理25月齡APP轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)合高爾基-科克斯(Golgi-Cox)與硫代黃素-S染色，解析大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)整個(gè)神經(jīng)元與點(diǎn)狀A(yù)β斑塊的空間關(guān)系。Ando等[52]通過CLARITY獲得了均勻透明的腦組織，結(jié)合Aβ、微管相關(guān)蛋白Tau和神經(jīng)絲三重免疫標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)皮質(zhì)致密實(shí)心Aβ大斑塊呈局灶性分布，松散點(diǎn)狀斑塊表現(xiàn)為彌漫性分布，過度磷酸化Tau蛋白則非連續(xù)性聚集于纏結(jié)的神經(jīng)元和Aβ灶性沉積物周圍區(qū)。

為研究斑塊的形成機(jī)制，Liebmann等[49]利用iDISCO清除4.4月齡(不含斑塊)到27月齡(斑塊高負(fù)荷)的2xTg AD小鼠，精確定位5個(gè)腦區(qū)的淀粉樣斑塊沉積的時(shí)空順序，其中皮質(zhì)最先累積，而小腦比海馬更早發(fā)生聚集；Aβ斑塊周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞較大，呈巢狀聚集，表明反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞在募集或轉(zhuǎn)移斑塊中發(fā)揮作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的慢性損傷，將導(dǎo)致AD和PD患者的突觸丟失以及神經(jīng)元細(xì)胞永久性受損[61]。De Rossi等[53]使用被動(dòng)CLARITY處理5xFAD小鼠腦，對(duì)BIN1(bridging integrator 1，一種核質(zhì)銜接蛋白，參與髓鞘膜的重塑，與遲發(fā)性AD相關(guān))、淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)和β位點(diǎn)APP裂解酶1(beta-site APP-cleaving protease 1，BACE1)進(jìn)行定位分析，發(fā)現(xiàn)APP和BACE1位于皮質(zhì)和海馬區(qū)Aβ沉積物周圍的球狀結(jié)構(gòu)中，而BIN1積聚于Aβ病灶附近。該研究明確了BIN1在大腦中的分布及營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)元中的表達(dá)，為AD相關(guān)的病理變化提供了新見解。

如何降低Tau蛋白尚不清楚，通過腦內(nèi)針對(duì)性注射藥物試驗(yàn)，評(píng)估不同階段病理性Tau的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化及其區(qū)域脆弱性，有望成為臨床前篩選延緩或阻止Tau病理進(jìn)程藥物的有力工具。Detrez等[50]使用iDISCO+透明衰老Tau.P301L小鼠半腦，在圖譜引導(dǎo)下的體積分析顯示，整個(gè)病理性Tau蛋白從注射部位順行或逆行擴(kuò)散至周邊，也可能波及次級(jí)區(qū)域。顱內(nèi)和全身聯(lián)合給予PT83，可靶向降低胞內(nèi)磷酸化Tau蛋白水平，推測(cè)其機(jī)制可能是活化膠質(zhì)細(xì)胞或抑制Tau的相互作用。此外，Martorell等[54]采用SHIELD透明6月齡5xFAD小鼠腦切片，發(fā)現(xiàn)同時(shí)使用視覺和聽覺GENUS刺激1周，小鼠整個(gè)新皮質(zhì)的淀粉樣蛋白負(fù)荷體積降低了37%，數(shù)量減少了34%；單獨(dú)使用聽覺GENUS刺激Tau P301S模型小鼠可引起小膠質(zhì)細(xì)胞活化和血管擴(kuò)張反應(yīng)，使磷酸化Tau蛋白水平降低。組織透明化技術(shù)結(jié)合全腦免疫標(biāo)記提供了檢測(cè)大組織樣本的能力，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平下觀察立體空間結(jié)構(gòu)中各種致病分子與神經(jīng)細(xì)胞間的相互作用，為更客觀地理解神經(jīng)退行性病變機(jī)制提供了一種有效途徑。

3.2 PD PD是常見的第二大中樞神經(jīng)退行性疾病，以黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)病變?yōu)橹?，在我?guó)65歲以上人群中發(fā)病率為1.7%[62]。PD典型的病理學(xué)特征是黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta，SNpc)多巴胺能神經(jīng)元變性丟失，路易小體(Lewy bodies，LBs)異常沉積[4]。在運(yùn)動(dòng)控制過程中膽堿能和多巴胺能兩個(gè)系統(tǒng)相互拮抗，多巴胺能神經(jīng)元變性壞死導(dǎo)致紋狀體接收的多巴胺水平降低70%以上時(shí)可出現(xiàn)靜止性震顫、肌肉僵直等一系列癥狀；除了多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)外，PD患者前腦膽堿能核團(tuán)-Meynert基底核(nucleus basalis of meynert，NBM)的膽堿能神經(jīng)元退化[63]，是導(dǎo)致早期甚至進(jìn)展期認(rèn)知功能損傷的主要機(jī)制。

目前，已有學(xué)者在應(yīng)用組織透明化技術(shù)研究小鼠腦及PD患者多巴胺能神經(jīng)元多源信息的輸入、整合、編碼、輸出及投射通路方面進(jìn)行了初步嘗試。Lerner等[56]利用CLARITY透明全腦后，觀察到兩種平行的黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)元亞群投射的差異性，證實(shí)了新的神經(jīng)回路追蹤和記錄方法，這為完整大腦內(nèi)豐富的細(xì)胞類型及全局連接關(guān)系提供了信息。Menegas等[55]使用CLARITY和全腦光片成像，無偏倚地識(shí)別了整個(gè)SNpc多巴胺神經(jīng)元亞群中相互平行的輸入回路和輸出回路，揭示了獨(dú)立運(yùn)行的黑質(zhì)-紋狀體信息流，為理解多巴胺能神經(jīng)元回路的反饋機(jī)制、研究不同類型神經(jīng)元群的全腦映射提供了一個(gè)可推廣的框架。Liu等[57]使用CLARITY技術(shù)，通過正交投影圖像表征了PD患者前腦NBM區(qū)域LBs與中腦黑質(zhì)紋狀體中單胺能神經(jīng)元纖維的空間分布關(guān)系，提示α-Syn可作為病理性“種子”在細(xì)胞間沿神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)傳播和擴(kuò)增，形成特征性的α-Syn聚集體。組織透明化技術(shù)在神經(jīng)環(huán)路水平為分子追蹤提供了可能，可大范圍地研究退行性病變大腦中致病性成分或某一類細(xì)胞在整個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的作用。

3.3 MS MS是一種病因不明的慢性炎癥性中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，其晚期典型的病理改變是進(jìn)行性灰質(zhì)萎縮，大腦和脊髓出現(xiàn)嚴(yán)重脫髓鞘改變，伴有軸索消失、膠質(zhì)細(xì)胞局灶性增生[56]。為更好地了解髓鞘變性和脫髓鞘的機(jī)制，髓鞘病理學(xué)研究聚焦于軸突-少突膠質(zhì)細(xì)胞-髓鞘單位損傷所涉及的細(xì)胞間相互作用。Ertürk等[58]采用3DSICO方法對(duì)成年GFP-M小鼠脊髓和腦干進(jìn)行透明，以評(píng)估完整皮質(zhì)脊髓束(complete corticospinal tract，CST)的軸突再生和神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)了損傷1年后具有生長(zhǎng)能力的軸突繞過損傷部位大量再生的特征。在完整CNS中可視化細(xì)胞，有望用于評(píng)估脊髓損傷和其他神經(jīng)疾病的實(shí)驗(yàn)性療法。Spence等[59]應(yīng)用改良CLARITY方法清除Thy1-YFP小鼠的完整CNS，揭示了皮質(zhì)萎縮與軸突末端的突觸小泡存在關(guān)系，而與卵圓形軸突無關(guān)，表明軸突損傷可能存在可逆性窗口。通過組織透明化技術(shù)對(duì)嚙齒動(dòng)物MS模型中完整的腦-脊髓結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，可在整體水平觀察神經(jīng)脫髓鞘、軸突以及神經(jīng)元的病理結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)一步探索潛在的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)軸突再生策略和臨床前研究新療法提供技術(shù)支持。

此外，組織透明化技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于人類胚胎學(xué)領(lǐng)域，可觀察毫米級(jí)3D腦器官的細(xì)胞結(jié)構(gòu)[64]。利用DISCO透明技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了妊娠3個(gè)月內(nèi)厘米級(jí)人類胚胎的完全透明[65-66]，結(jié)合全免疫標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)，分泌促性腺激素釋放激素的神經(jīng)元以兩種獨(dú)立的途徑遷移，并在下丘腦外的許多大腦區(qū)域定居。研究表明，在10周歲時(shí)人腦齒狀回(dentate gyrus，DG)中可觀察到數(shù)千個(gè)未成熟的神經(jīng)元[67]，而成人海馬是否有新神經(jīng)元生成尚需進(jìn)一步研究。對(duì)死后人腦組織的處理方式，在很大程度上阻礙了人類DG中AHN標(biāo)記物的檢測(cè)[68]。組織透明化技術(shù)可獲得腦樣本中完整的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)信息，有助于追蹤、評(píng)估神經(jīng)元的變化，因此對(duì)觀察死亡后人類腦組織樣本有巨大的潛力，可能為特定病理?xiàng)l件下保存和刺激新神經(jīng)元的存活和成熟提供新的方法。

4 總結(jié)與展望

組織透明化技術(shù)因保持了組織標(biāo)本的完整性，對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的損壞較小，為實(shí)現(xiàn)大體積生物組織的神經(jīng)、血管等結(jié)構(gòu)的三維可視化及分析研究提供了新的病理診斷視角?？焖俑咝У慕M織透明化方案有利于增加實(shí)驗(yàn)組規(guī)模，以識(shí)別較小的生物學(xué)效應(yīng)(如年齡、性別和生活環(huán)境)和微小而重要的臨床差異，并為從細(xì)胞水平研究器官結(jié)構(gòu)提供了新的方向，且有望為神經(jīng)退行性疾病的精準(zhǔn)治療提供可能。

目前，大多數(shù)透明化方法基于嚙齒類動(dòng)物大腦，雖為人腦透明化的可行性提供了理論驗(yàn)證，但要實(shí)現(xiàn)人類大腦全面的神經(jīng)回路分析，仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有透明化技術(shù)對(duì)完整組織器官的透明及成像效果仍有待提高，如超快的清除速度、整體器官的高透明度、親脂性染料(用于追蹤神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和脈管系統(tǒng))的兼容性以及生物安全性等。此外，還需要對(duì)成像技術(shù)、數(shù)據(jù)處理加以改善。首先，較大體積的組織需要工作距離更長(zhǎng)、視野更大的光學(xué)顯微鏡，有的顯微鏡功能并非完全兼容，且圖像采集效率較低。目前，光片熒光顯微鏡成像系統(tǒng)提供了有前途的解決方案，未來期待能實(shí)現(xiàn)任意大小組織亞微米級(jí)分辨率的光學(xué)顯微鏡，以打破三維成像中組織體積以及分辨率的限制。其次，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和處理方面要求大容量智能化，因大規(guī)模體積成像期間會(huì)生成千兆字節(jié)甚至TB級(jí)數(shù)據(jù)集，手動(dòng)提取分析有意義的數(shù)據(jù)較為困難。因此，高性能工作站對(duì)于數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和分析確實(shí)是必需的。

綜上所述，不同學(xué)科組織透明化方法的融合，為無偏倚3D組織成像鋪平了道路，將促進(jìn)組織透明化技術(shù)更廣泛地應(yīng)用，如作為藥物向中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)新的定量分析工具等。靶向神經(jīng)系統(tǒng)的生物制劑或其他大分子藥物如何克服血腦屏障和其他可能限制療效的微環(huán)境，仍需進(jìn)一步深入探討。組織透明化技術(shù)可在保持結(jié)構(gòu)完整性和蛋白質(zhì)免疫原性的同時(shí)使腦組織足夠透明，能高分辨率地獲取藥物的生物分布及單細(xì)胞水平的作用靶點(diǎn)，針對(duì)此特性的研究為了解藥物作用的分子機(jī)制、開發(fā)新型高效藥物提供了重要數(shù)據(jù)，可能為生物制藥帶來突破性變革。